본 연구에서는 생리활성이 우수한 것으로 알려진 적양배추를 이용하여 에탄올 및 열수 추출을 하여 마크로파지 세포에 LPS로 유도하여 염증성 질환 모델에서 세포생존, NO생성 억제, 단백질 단계에서 iNOS와 COX-2의 발현을 분석하였고 항산화 활성 측정을 위해 ABTS 라디칼 소거능과 FRAP 활성을 확인하였다. 각 추출물의 세포생존, NO생성 및 단백질 발현 분석에서 농도 의존적으로 LPS에 대해 억제 및 저해 효능을 확인하였고 특히 0.25, 0.5 그리고 1.0 mg/mL에서 유의적인 차이를 확인하였다. ABTS 라디칼 소거 및 FRAP 활성은 합성 항산화제인 BHT보다 활성이 좋지 않았지만 천연 항산화제로써의 가능성을 확인하였고 훌륭한 식품소재로서 기능성 식품 및 각종 질병에 대한 예방의 목적으로 활용이 가능할 것으로 사료된다.
본 연구에서는 생리활성이 우수한 것으로 알려진 적양배추를 이용하여 에탄올 및 열수 추출을 하여 마크로파지 세포에 LPS로 유도하여 염증성 질환 모델에서 세포생존, NO생성 억제, 단백질 단계에서 iNOS와 COX-2의 발현을 분석하였고 항산화 활성 측정을 위해 ABTS 라디칼 소거능과 FRAP 활성을 확인하였다. 각 추출물의 세포생존, NO생성 및 단백질 발현 분석에서 농도 의존적으로 LPS에 대해 억제 및 저해 효능을 확인하였고 특히 0.25, 0.5 그리고 1.0 mg/mL에서 유의적인 차이를 확인하였다. ABTS 라디칼 소거 및 FRAP 활성은 합성 항산화제인 BHT보다 활성이 좋지 않았지만 천연 항산화제로써의 가능성을 확인하였고 훌륭한 식품소재로서 기능성 식품 및 각종 질병에 대한 예방의 목적으로 활용이 가능할 것으로 사료된다.
This study investigated the anti-inflammatory and antioxidnat effects of red cabbage extracts on RAW264.7 cells. Cell toxicity was determined by MTT assay. We evaluated the anti-inflammatory effects of red cabbage extracts by measuring nitric oxide (NO), inducible NOS (iNOS) production, and cyclooxy...
This study investigated the anti-inflammatory and antioxidnat effects of red cabbage extracts on RAW264.7 cells. Cell toxicity was determined by MTT assay. We evaluated the anti-inflammatory effects of red cabbage extracts by measuring nitric oxide (NO), inducible NOS (iNOS) production, and cyclooxygenase-2 (COX-2) expression by Western blotting. Ethanolic and water extracts (0.25, 0.5, and 1.0 mg/mL) significantly suppressed LPS-stimulated production of NO. Two kinds of extracts reduced the expression of iNOS and COX-2 proteins. The present results show that red cabbage extract has potent anti-inflammatory effects on RAW264.7 cells. In addition, two kinds of extracts as well as various antioxidant activities such as 2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzo thiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS) radical scavenging activity, ferric reducing antioxidant power(FRAP). The total polyphenol and flavonoid contents of the ethanolic and water extracts from red cabbage were $18.699{\pm}0.87$ and $11.174{\pm}4.86$ mg GAE/g extract, respectively, and $7.782{\pm}2.23$ and $15.608{\pm}3.54$ mg CE/g extract. The ABTS radical scavenging activities of the ethanolic and water extracts and BHT were $0.269{\pm}0.12$, $0.212{\pm}0.22$ and $1.235{\pm}0.07mM$ Trolox equivalent/mg extract, respectively. The FRAP values of the extracts were similar to those of BHT, which were used as a positive control. Therefore, red cabbage extract is considered as a good food material of functional foods for prevention against various diseases.
This study investigated the anti-inflammatory and antioxidnat effects of red cabbage extracts on RAW264.7 cells. Cell toxicity was determined by MTT assay. We evaluated the anti-inflammatory effects of red cabbage extracts by measuring nitric oxide (NO), inducible NOS (iNOS) production, and cyclooxygenase-2 (COX-2) expression by Western blotting. Ethanolic and water extracts (0.25, 0.5, and 1.0 mg/mL) significantly suppressed LPS-stimulated production of NO. Two kinds of extracts reduced the expression of iNOS and COX-2 proteins. The present results show that red cabbage extract has potent anti-inflammatory effects on RAW264.7 cells. In addition, two kinds of extracts as well as various antioxidant activities such as 2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzo thiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS) radical scavenging activity, ferric reducing antioxidant power(FRAP). The total polyphenol and flavonoid contents of the ethanolic and water extracts from red cabbage were $18.699{\pm}0.87$ and $11.174{\pm}4.86$ mg GAE/g extract, respectively, and $7.782{\pm}2.23$ and $15.608{\pm}3.54$ mg CE/g extract. The ABTS radical scavenging activities of the ethanolic and water extracts and BHT were $0.269{\pm}0.12$, $0.212{\pm}0.22$ and $1.235{\pm}0.07mM$ Trolox equivalent/mg extract, respectively. The FRAP values of the extracts were similar to those of BHT, which were used as a positive control. Therefore, red cabbage extract is considered as a good food material of functional foods for prevention against various diseases.
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문제 정의
Prostaglandin E2(PGE2)는 통증과 발열에 주로 관여하는 염증 인자로서 염증 반응이 일어나면 대식세포의 COX-2에 의해 생성된다(Wang MT et al 2007, Sarkar D et al 2008). 따라서, 본 연구에서는 NO를 포함하여 염증 반응에서 생성되는 물질 중 iNOS, COX-2의 생성 억제를 확인하여 항염증 효과를 확인함으로써 다양한 효능을 나타내는 적양배추 추출물의 항산화 및 항염증 효과를 실험을 통해 검증하여 생리 기능성 바이오 소재 개발 및 조리 연구를 위한 기초자료로 활용하고자 한다.
기존의 Ju YH 등(2000)은 적양배추 추출물을 암세포에 처리했을 때 높은 암세포 증식 억제 효과를 나타냈다고 보고하였고 Nam MK ⦁ Kang KJ(2013)의 연구에서도 적양배추 에탄올 추출물이 높은 암세포 억제 활성을 확인하였다고 보고하였다. 본 연구는 염증성 질환 관련 마크로파지 세포를 이용한 결과로 다른 항산화 함암 관련 적양배추의 생리활성적인 측면에서 유사한 결과를 확인하였다.
4). 본 연구는 적양배추 추출물이 염증성 질환 세포주에 용이한 작용을 하는 것을 확인하는 것으로 iNOS의 발현억제를 통해 NO의 생성 저해를 유도하는 것을 나타낸다. 하지만 추가적으로 각 단백질 혹은 사이토카인을 조절하는 주요 인자에 대한 연구가 필요하며 지금까지 결과들로 천연식품소재가 갖는 안정성을 강조하며 부작용 등의 문제에서도 자유로울 수 있을 것으로 판단되며 동물모델을 이용하여 연구를 폭 넓게 접근하여 조리업과 외식업계에 적양배추의 특성에 관한 과학적 데이터를 제시함으로써 적양배추의 정보를 알리면서 농가의 소득 및 매출증대에도 큰 영향을 미칠 것으로 예상되어지는 바이다.
본 연구에서는 항산화 활성을 나타내는 적양배추 추출물을 이용하여 마크로파지 세포에 처리하여 염증성 cytokine, NO와 같은 매개물질을 세균내독소로 알려진 LPS에 대하여 저해 효능을 확인하고자 하였다. RAW264.
제안 방법
Transfer가 끝나면 ponceau에 담근 후 band를 확인하고 TBST로 5회 이상 세척한 후 꺼내서 5% skim milk로 overnight 시켜 항체의 비특이적 결합을 억제시켰다. 5회 washing 후 1차 antibody(1:1000)를 1시간 동안 반응 시킨 후 다시 2차 antibody(1:1000)를 반응 시키고 ECL kit(Amersham Pharmacia, England)를 이용하여 발현량을 측정하였다. Band density는 LAS-3000(Bid-rad, America)으로 확인하여 Image gauge로 수치화하였다.
LPS에 의해 손상된 세포로부터 생성된 nitrite를 측정하기 위하여 griess 반응을 이용하였다. MA JS 등(2010)의 방법을 응용하여 griess 시약의 diazo기가 nitrite를 만나면 분홍색으로 변하게 되는 색의 반응을 측정하였다.
RAW264.7 세포를 24-well plates에 5×104 cells/well이 되도록 분주하고 12시간 배양한 후 추출물을 0, 0.125, 0.25, 0.5 그리고 1.0 mg/mL과 LPS 0.1 μg/mL의 농도로 동시 처리 또는 LPS 단독 처리하여 18시간을 배양하였다.
각 시료 및 표준용액 0.5 mL를 대조액과 시험용액으로 두 개의 시험관에 취하고, 에탄올 1.5 mL, 10% Aluminum nitrate(Yakuri pure chemicals Co., Ltd., Osaka, Japan) 0.1mL 및 1.0 M Potassium acetate(Junsei chemical Co., Ltd.) 0.1 mL, 증류수 2.8 mL를 잘 혼합 후 실온에서 40분간 정치하고 UV/Visible spectrophotometer(UV-2550, Shimadzu)를 사용하여 415 nm에서 흡광도를 측정하여 작성한 검량선으로부터 함량을 구하였다. 공시험의 경우 10% Aluminum nitrate 0.
1) 이 결과는 천연 소재가 세포주에 특별한 독성이 없다는 것을 의미한다. 또한, 추 후 연구를 수행하면서 추출물 처리 농도는 0.125, 0.25, 0.5 그리고 1.0 mg/mL를 선택하였다. 기존의 Ju YH 등(2000)은 적양배추 추출물을 암세포에 처리했을 때 높은 암세포 증식 억제 효과를 나타냈다고 보고하였고 Nam MK ⦁ Kang KJ(2013)의 연구에서도 적양배추 에탄올 추출물이 높은 암세포 억제 활성을 확인하였다고 보고하였다.
본 연구는 적양배추의 항산화 및 세포단계에서 항염증 활성을 측정하기 위해 ABTS 및 FRAP 그리고 마크로파지 세포에서 NO생성 억제, 단백질 발현량을 분석하였다. 분석한 결과는 다음과 같다.
세포를 24-well plates에 5×104 cells/mL 농도로 1.0 mL씩 분주한 뒤 24시간 동안 배양하고 각 시료를 최종 농도(0, 0.125, 0.25, 0.5, 1.0 그리고 2.0 mg/mL)가 되도록 세포에 처리하여 24시간 동안 배양하였다.
실험에 사용된 시료 추출을 위한 용매는 물과 에탄올을 사용하였고 먼저 열수추출은 건조 분말 시료 20 g을 3차 증류수 500 mL을 첨가하여 70℃에서 60분 동안 3회 추출하였다. 추출물은 여과지(No.
지금까지의 결과를 바탕으로 적양배추 추출물의 NO생성에 영향을 미치는 iNOS와 COX-2의 세포내 단백질 발현억제에 관한 활성을 western blot으로 명확하게 분석하였다. 마크로파지 세포에 LPS(100 ng/mL) 단독 처리군과 적양배추 열수 및 에탄올 추출물 1.
실험에 사용된 시료 추출을 위한 용매는 물과 에탄올을 사용하였고 먼저 열수추출은 건조 분말 시료 20 g을 3차 증류수 500 mL을 첨가하여 70℃에서 60분 동안 3회 추출하였다. 추출물은 여과지(No. 11, Whatman, Maidstone, England)로 잔재물을 제거한 후 rotary vacuum evaporator(EYELA, Tokyo, Japan)로 농축하고 동결건조 하였다. 다음으로 에탄올 추출은 건조 분말 시료 20 g에 에탄올 500 mL를 첨가하여 20℃에서 120 rpm의 진탕기로 24시간씩 3회 추출한 후 농축하여 동결건조하여 시료화 한 후 –20℃에 보관하여 실험에 사용하였다.
이혼합 용액을 23℃에서 2시간 동안 정치한 후 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도는 gallic acid를 이용하여 작성된 검량선으로 총 페놀화합물 함량을 계산하였다.
대상 데이터
RAW264.7 마크로파지 세포의 배양은 DMEM 배지에 10% 불활성시킨 FBS를 첨가하고 항생제를 mL 당 10 μg 넣은 것을 사용하였다.
그리고 세포실험을 위해 사용 된 시약인 Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM), Fetal Bovine Serum(FBS), Penicillin Streptomycin은 Invitrogen()에서 구입하였다.
7 마크로파지 세포의 배양은 DMEM 배지에 10% 불활성시킨 FBS를 첨가하고 항생제를 mL 당 10 μg 넣은 것을 사용하였다. 세포는 10~12번의 계대배양을 통해 세포가 안정된 상태에서 실험을 진행하였고 배양기의 온도는 37℃이었으며 CO2는 5%의 조건으로 사용하였다.
Louis, MO, USA)사에서 구입하였다. 염증성 모델인 RAW264.7 세포는 활성측정을 위해 사용하였고 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 분양받았다. 그리고 세포실험을 위해 사용 된 시약인 Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM), Fetal Bovine Serum(FBS), Penicillin Streptomycin은 Invitrogen()에서 구입하였다.
적양배추는 2012년 6월 반여 농산물 시장(Busan, Korea)에서 구입하여 음건하고 분쇄기로 파쇄하여 사용하였다(Hanil, Seoul, Korea). Lipopolysaccharide(LPS)는 Sigma Chemical Co.
데이터처리
a-bMeans in a column by different superscripts are significantly different at the 0.05 level by Duncan’s multiple range test.
모든 결과는 3회 반복 측정 후 평균±표준편차로 나타내었으며, 유의성 검증은 Window용 SPSS 12.0 version을 이용하여 student t-test one way를 이용하였으며 Duncan’s new multiple range test으로 사후검증 하였다.
이론/모형
1 μg/mL의 농도로 동시 처리 또는 LPS 단독 처리하여 18시간을 배양하였다. Nitrite의 측정은 Griess reagent system을 이용하여 분석하였다.
단백질 발현량 분석은 Lee SJ 등(2012)의 방법에 준하여 진행하였다. RAW264.
세포의 생존율은 3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide(MTT) 환원 방법을 이용하여 측정하였다. 세포를 24-well plates에 5×104 cells/mL 농도로 1.
적양배추의 열수 및 에탄올 추출물을 이용하여 마크로파지 세포인 RAW264.7를 이용하여 세포 독성을 측정하고자 MTT assay로 분석하였다. 두 종류의 추출물이 모두 1.
성능/효과
/mg extract을 확인하였고 비교군으로 사용한 합성 항산화제인 BHT의 결과가 1.084 ± 0.16 mM FeSO4 eq.
7를 이용하여 세포 독성을 측정하고자 MTT assay로 분석하였다. 두 종류의 추출물이 모두 1.0 mg/mL까지는 약 100% 이상의 세포생존을 확인하였고(Fig. 1) 이 결과는 천연 소재가 세포주에 특별한 독성이 없다는 것을 의미한다. 또한, 추 후 연구를 수행하면서 추출물 처리 농도는 0.
또한, 플라보노이드 함량을 분석한 결과는 열수 추출물이 15.608 ± 3.54 mg CE/g extract, 에탄올 추출물이 7.782 ± 2.23 mg CE/g extract로 열수 추출물이 높은 함량임을 확인하였다.
지금까지의 결과를 바탕으로 적양배추 추출물의 NO생성에 영향을 미치는 iNOS와 COX-2의 세포내 단백질 발현억제에 관한 활성을 western blot으로 명확하게 분석하였다. 마크로파지 세포에 LPS(100 ng/mL) 단독 처리군과 적양배추 열수 및 에탄올 추출물 1.0 mg/mL을 같이 처리하여 배양하였을 때 열수 추출물이 iNOS를 약 15% 저해 하였고 에탄올 추출물이 약 25% 저해하였다(Fig. 3). 또한 COX-2는 열수 추출물이 약 20% 저해하였으며 에탄올 추출물은 35%를 저해하였다(Fig.
0 mg/mL의 고농도에서는 약 70%이상 NO를 저해하였다. 에탄올 추출물에서도 이와 유사한 결과를 확인하였으나 열수 추출물의 활성보다는 낮은 저해 효능을 나타내었고 두 추출물간 큰 차이는 없었다. 기존에 Gamet-Payrastre L 등(2000)은 적양배추가 속하는 십자화과 채소에서 발견되는 anthocyanin, indole-3-carbinol, sulforaphane 등이 높은 생리활성을 나타낸다고 보고 하였고 이는 본 연구인 적양배추로부터 유효물질을 분리 및 동정하는 연구가 필요한 것으로 판단된다.
열수 추출물의 총 페놀함량은 11.174 ± 4.86 mg GAE/g extract, 에탄올 추출물은 18.699 ± 0.87 mg GAE/g extract로 열수 추출보다 유기용매 추출에서 총 페놀함량이 높은 것을 확인하였다.
후속연구
02 mM Trolox eq./mg extract와 비교하였을 때 적양배추의 유효 단일물질이 아닌 추출물로써 우수한 항산화력을 확인하였고 이는 충분히 천연자원을 활용한 합성 대체 항산화제의 응용이 가능할 것으로 사료된다.
Bridle P·Thimberlake CF(1997) 연구에서는 적양배추는 다량으로 함유된 안토시아닌계열 성분에 의해 식품에서 우수한 항산화 작용뿐만 아니라 중요한 착색제로 사용되어진다고 보고하였다. 그러나 이러한 기능성이 부각되었음에도 불구하고 적양배추의 생리활성적인 사례는 미흡한 실정으로 본 연구 결과는 식품학적으로 중요한 자료를 제공할 것으로 사료된다.
에탄올 추출물에서도 이와 유사한 결과를 확인하였으나 열수 추출물의 활성보다는 낮은 저해 효능을 나타내었고 두 추출물간 큰 차이는 없었다. 기존에 Gamet-Payrastre L 등(2000)은 적양배추가 속하는 십자화과 채소에서 발견되는 anthocyanin, indole-3-carbinol, sulforaphane 등이 높은 생리활성을 나타낸다고 보고 하였고 이는 본 연구인 적양배추로부터 유효물질을 분리 및 동정하는 연구가 필요한 것으로 판단된다.
05) 단백질 발현 분석에서 LPS처리군에 비해 추출물 처리군이 20~30% 저해하는 것을 확인하였다. 이미 컬러푸드에 관한 연구는 활발히 진행되는 추세로 본 연구에서 확인한 우수한 생리활성의 적양배추를 이용한 조리는 시각적, 미각적으로 시너지 효과를 볼 수 있을것으로 사료되지만 적양배추에 관한 연구는 미흡한 실정으로 아직까지 명확하게 확립되어있는 단계가 아니기 때문에 본 연구 결과는 조리 및 식품학적의 기초지식을 제공 할 것으로 사료되어지고 좀 더 정확한 결과를 위해 동물모델을 이용한 생리활성 연구가 필요할 것으로 판단되어지며 유효단일물질의 분리 방법 확립 등이 추가적으로 필요할 것으로 판단된다.
본 연구는 적양배추 추출물이 염증성 질환 세포주에 용이한 작용을 하는 것을 확인하는 것으로 iNOS의 발현억제를 통해 NO의 생성 저해를 유도하는 것을 나타낸다. 하지만 추가적으로 각 단백질 혹은 사이토카인을 조절하는 주요 인자에 대한 연구가 필요하며 지금까지 결과들로 천연식품소재가 갖는 안정성을 강조하며 부작용 등의 문제에서도 자유로울 수 있을 것으로 판단되며 동물모델을 이용하여 연구를 폭 넓게 접근하여 조리업과 외식업계에 적양배추의 특성에 관한 과학적 데이터를 제시함으로써 적양배추의 정보를 알리면서 농가의 소득 및 매출증대에도 큰 영향을 미칠 것으로 예상되어지는 바이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
적양배추는 어떤 효능이 있는 것으로 보고되고 있는가?
또한, 식품에서 다양한 생리활성뿐 아니라 중요한 착색제로도 사용된다고 보고되었다(Singh J et al 2006). 적양배추는 항노화(Heo HJ & Lee CY 2006), 콜레스테롤 저하활성(Komatsu W et al 1998), 항균작용(Lee SM et al 1997; Cha BC et al 1998), 심장 및 간 보호효능(Sankhari JM et al 2011), 그리고 당뇨유발 쥐로부터 기능회복작용(Kataya HAH & Hamza AA 2008) 등에 효능이 있는 것으로 보고되고 있다. 또한, 적양배추는 베타카로틴과 루테인 등에 의해 눈의 황변성을 저하시키는 효능에 따라 눈을 보호하는 것으로 알려져 있다(Nam MK & Kang KJ 2013).
적양배추는 일반 양배추보다 어떤 성분이 풍부한가?
적양배추는 일반 양배추보다 과당과 포도당, 라이신, 비타민 및 셀레늄이 풍부하다고 보고되고 있다(Plumb et al 1997). 특히 적양배추의 붉은색을 내는 성분인 안토시아닌은 항산화 효능이 우수하여 자유라디칼 소거활성 및 항암, 항염증 활성이 우수한 것으로 알려져 있다(Zhu C et al 2000).
체내에 대한 산화적 요인이 유발하는 염증 반응이 만성적으로 일어나면 어떻게 되는가?
이처럼 체내에 대한 산화적 요인은 염증을 유발하는데 특히 흡연이나 음주, 비만, 독성물질에 의해 증가하면서 만성질환을 유발하는 것으로 알려져 있다(Ryu JH et al 2003). 염증 반응이 만성적으로 일어날 때는 염증매개 물질이 과도하게 분비되어 암세포의 성장을 촉진하고 인슐린 저항성을 증가시키며 동맥경화를 악화시키는 등 다양한 병리학적 기전에 관여한다고 보고되고 있다(Nishida T et al 2007; Cheon YP et al 2009). 염증 반응에서 대식세포(macrophage)는 병원체에 반응하여 iNOS와 cyclooxygenase-2(COX-2)를 생합성하여 NO 및 prostaglandin E2(PGE2)를 생성한다(Moncada S et al 1991; Strorck M et al 1994; Wink DA & Mitchell JB 1998; Jin HJ et al 2010).
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