Radiofrequency에 노출된 Chlamydomonas sp.의 mycosporine-like amino acids 생합성 유전자 발현 Expression of Mycosporine-like Amino Acids Biosynthetic Genes in the Chlamydomonas sp. Exposed to Radiofrequency원문보기
Mycosporine-like 아미노산(MAAs)은 UV 흡수물질이며, 다양한 해양생물들은 MAAs의 합성과 축적을 통하여 환경 자외선의 직 간접적인 영향을 감소시키는 기능을 진화시켜 왔다. 이 연구에서 우리는 radiofrequency(RF) 발생장치를 제작하였고, 이를 미세조류 배양에 적용하였다. $0.35{\pm}0.05$ mHz의 RF를 Chlamydomonas sp. 배양기에 공급하였고, 정해진 시간(0, 0.5, 1 및 2 시간)에 시료를 채취하였다. MAAs 생합성 관련 유전자인 dehydroquinate synthase homolog (DHQS-like)와 nonribosomal peptide synthetase homolog (NRPS-like) 유전자를 Chlamydomonas sp.로부터 클로닝하였고, RF 노출에 대한 유전자 발현을 qRT-PCR을 이용하여 분석하였다. 연구결과 RF에 노출된 Chlamydomonas sp.의 DHQS-like와 NRPS-like 유전자의 발현은 노출 1시간에 각각 1.46 배 및 1.19 배 증가하였다. 이러한 결과는 DHQS-like와 NRPS-like 유전자가 Chlaydomonas sp.의 MAAs 생합성을 진단할 수 있는 좋은 바이오마커 후보가 될 수 있음을 의미한다.
Mycosporine-like 아미노산(MAAs)은 UV 흡수물질이며, 다양한 해양생물들은 MAAs의 합성과 축적을 통하여 환경 자외선의 직 간접적인 영향을 감소시키는 기능을 진화시켜 왔다. 이 연구에서 우리는 radiofrequency(RF) 발생장치를 제작하였고, 이를 미세조류 배양에 적용하였다. $0.35{\pm}0.05$ mHz의 RF를 Chlamydomonas sp. 배양기에 공급하였고, 정해진 시간(0, 0.5, 1 및 2 시간)에 시료를 채취하였다. MAAs 생합성 관련 유전자인 dehydroquinate synthase homolog (DHQS-like)와 nonribosomal peptide synthetase homolog (NRPS-like) 유전자를 Chlamydomonas sp.로부터 클로닝하였고, RF 노출에 대한 유전자 발현을 qRT-PCR을 이용하여 분석하였다. 연구결과 RF에 노출된 Chlamydomonas sp.의 DHQS-like와 NRPS-like 유전자의 발현은 노출 1시간에 각각 1.46 배 및 1.19 배 증가하였다. 이러한 결과는 DHQS-like와 NRPS-like 유전자가 Chlaydomonas sp.의 MAAs 생합성을 진단할 수 있는 좋은 바이오마커 후보가 될 수 있음을 의미한다.
Mycosporine-like amino acids (MAAs) are UV-absorbing substances, and diverse marine organisms have the evolved the capacity to diminished the direct and indirect damaging effects of environmental ultraviolet radiation by synthesis and accumulation of MAAs. In this study, we manufactured a radiofrequ...
Mycosporine-like amino acids (MAAs) are UV-absorbing substances, and diverse marine organisms have the evolved the capacity to diminished the direct and indirect damaging effects of environmental ultraviolet radiation by synthesis and accumulation of MAAs. In this study, we manufactured a radiofrequency (RF) generation device and applied to microalgal culture. $0.35{\pm}0.05$ mHz of RF was supplied to culture vessel for Chlamydomonas sp. and samples were harvested at the designated time intervals (1, 0.5, 1 and 2 hr). MAAs biosynthetic genes, dehydroquinate synthase homolog (DHQS-like) and nonribosomal peptide synthetase homolog (NRPS-like), were cloned from Chlamydomonas sp. and their gene expressions under the RF exposure were analyzed using qRT-PCR. DHQS-like and NRPS-like gene expressions of Chlamydomonas sp. exposed to RF were increased 1.46 and 1.19 fold at 1 hr, respectively. These results means that DHQS-like and NRPS-like genes can be good biomarker candidates for diagnosis of MAAs biosynthesis in the Chlamydomonas sp.
Mycosporine-like amino acids (MAAs) are UV-absorbing substances, and diverse marine organisms have the evolved the capacity to diminished the direct and indirect damaging effects of environmental ultraviolet radiation by synthesis and accumulation of MAAs. In this study, we manufactured a radiofrequency (RF) generation device and applied to microalgal culture. $0.35{\pm}0.05$ mHz of RF was supplied to culture vessel for Chlamydomonas sp. and samples were harvested at the designated time intervals (1, 0.5, 1 and 2 hr). MAAs biosynthetic genes, dehydroquinate synthase homolog (DHQS-like) and nonribosomal peptide synthetase homolog (NRPS-like), were cloned from Chlamydomonas sp. and their gene expressions under the RF exposure were analyzed using qRT-PCR. DHQS-like and NRPS-like gene expressions of Chlamydomonas sp. exposed to RF were increased 1.46 and 1.19 fold at 1 hr, respectively. These results means that DHQS-like and NRPS-like genes can be good biomarker candidates for diagnosis of MAAs biosynthesis in the Chlamydomonas sp.
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문제 정의
에서의 유전자 발현 분석을 통하여. MAAs 생합성을 진단할 수 있는 바이오마커로써의 활용가능성을 검토하였다.
제안 방법
USA)을 사용하여 10 μ g의 total RNA로부터 cDNA를 합성하였다. House-keeping 유전자로 tublin 유전자를 사용하였으며, MAAs 생합성 유전자로 DHQS-like와 NRPS-like 유전자를 선택하였다. 각 유전자의 specific primers는 Chlamydomonas sp.
qRT-PCR에 적용된 프라이머는 유전자 클로닝을 위한 디자인된 프라이머(Table 2)를 사용하였다. House-keeping 유전자인 tublin 유전자를 internal control로 사용하였다. Real-time PCR은 Rotor-Gene 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia)을 사용하여 수행하였으며, delta delta CT method에 의해 유전자 발현양의 차이를 분석하였다.
RF 파형 처리용 유리생물반응기(5 L)를 RF device의 printed circuit board (PCB)에 배치하였고, RF device는 out put power가 20-40 W 정도가 발생할 수 있도록 조정하였다. Internal power supply circuit, oscillator circuit, amplifier, resonator circuit, power modulator, heat diffuser 등을 적절히 배치하여 미세조류 배양에 적용하였다[Fig. 2].
MAAs 생합성 과정에 참여하는 유전자인 DHQS-like 와 NRPS-like 유전자를 클로닝하였다. 디자인된 primers를 사용하여 RT-PCR을 수행한 결과 negative control에서 는 검출이 되지 않고, Chlamycomonas sp.
실험에 사용된 프라이머는 표 2에 표시하였다. PCR products는 1% agarose gel 상에서 전기영동하였으며, 밴드를 절단하고, agarose gel DNA fragment recovery kit (Promega Co. USA)를 사용하여 정제하였다. PCR fragments는 pGEMT easy vector에 클로닝하고, 염기서열을 분석하였다.
PCR 증폭 반응은 total 20 μL로 10X rection buffer 2 μL, 2.5 mM dNTPs 2 μL, Taq DNA polymerase 0.5 μL, cDNA 5 μL, SYBR 1 μL를 혼합하여 반응을 수행하였다.
RF 처리 시간에 대한 DHQS-like 및 NRPS-like 유전자의 발현변화를 분석하기 위하여, 0.35±0.05 MHz의 RF를 30분처리 후 30분 휴식의 cycle로 처리하였고, 0, 0.5, 1 및 2 hr에 시료를 채취하여 qRT-PCR을 수행하였다.
02 A로 조정하였다. RF 처리는 약 30분 간격으로 RF 처리와 휴식을 번갈아가며 수행을 하였다. Fig.
RF 처리를 통해 획득한 각 시간대별 미세조류 시료를 3,000×g로 5분 동안 4℃에서 원심분리하여 미세조류를 모았다.
RF 파형 처리용 유리생물반응기(5 L)를 RF device의 printed circuit board (PCB)에 배치하였고, RF device는 out put power가 20-40 W 정도가 발생할 수 있도록 조정하였다. Internal power supply circuit, oscillator circuit, amplifier, resonator circuit, power modulator, heat diffuser 등을 적절히 배치하여 미세조류 배양에 적용하였다[Fig.
Reverse transcription system (Promega Co. USA)을 사용하여 10 μ g의 total RNA로부터 cDNA를 합성하였다.
본 연구에서는 MAAs의 일종인 shinorine 생합성 과정에 참여하는 DHQS-like 및 NRPS-like 유전자를 Chlamydomonas sp.로부터 클로닝하고[Fig. 3], 고주파 처리에 의한 유전자 발현을 분석하였다[Fig. 4]. qRT-PCR을 사용하여 유전자 발현을 분석한 결과 DHQS-like와 NRPS-like 유전자가 1 시간 RF에 노출된 시료의 경우 RF 처리하지 않은 대조구에 비해 1.
5 μL, cDNA 5 μL, SYBR 1 μL를 혼합하여 반응을 수행하였다. 반응 조건은 94℃에서 20초, 55℃에서 20초 그리고 72℃에서 15초씩 각각 40 사이클을 실시 하였다. 각 실험에 대하여 평균±SD를 계산하였으며, One-way ANOVA를 통해 결과의 유의성을 분석하였다.
대상 데이터
Chlamidomonas sp.는 인천대학교 해양사업단에서 분양받아 배양을 하였다. 순수분리된 Chlamidomonas sp.
데이터처리
각 실험에 대하여 평균±SD를 계산하였으며, One-way ANOVA를 통해 결과의 유의성을 분석하였다.
이론/모형
House-keeping 유전자인 tublin 유전자를 internal control로 사용하였다. Real-time PCR은 Rotor-Gene 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia)을 사용하여 수행하였으며, delta delta CT method에 의해 유전자 발현양의 차이를 분석하였다. PCR 증폭 반응은 total 20 μL로 10X rection buffer 2 μL, 2.
Real-time PCR은 위에 기술된 cDNA template를 사용하여 수행하였다. qRT-PCR에 적용된 프라이머는 유전자 클로닝을 위한 디자인된 프라이머(Table 2)를 사용하였다.
성능/효과
연구결과 두 유전자 모두 RF 처리 후 1 시간에 발현량이 최고로 증가하였다. DHQS-like 유전자는 control에 비해 약 46% 증가하였으며, NRPS-like 유전자는 약 19% 발현이 증가하였다[Fig. 4].
4]. qRT-PCR을 사용하여 유전자 발현을 분석한 결과 DHQS-like와 NRPS-like 유전자가 1 시간 RF에 노출된 시료의 경우 RF 처리하지 않은 대조구에 비해 1.46배 및 1.19배 증가하였다. 이러한 결과는 DHQS-like와 NRPS-like 유전자가 미세조류에서 MAAs 합성을 진단할 수 있는 바이오마커로써 활용 가능함을 보여준다.
0 hr 에서의 유전자 발현을 1로 설정하였으며, 각 시간별 시료의 발현정도를 상대적인 값으로 표시하였다. 연구결과 두 유전자 모두 RF 처리 후 1 시간에 발현량이 최고로 증가하였다. DHQS-like 유전자는 control에 비해 약 46% 증가하였으며, NRPS-like 유전자는 약 19% 발현이 증가하였다[Fig.
후속연구
19배 증가하였다. 이러한 결과는 DHQS-like와 NRPS-like 유전자가 미세조류에서 MAAs 합성을 진단할 수 있는 바이오마커로써 활용 가능함을 보여준다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
MAAs란?
MAAs는 자외선(UV)을 흡수하는 물질이며[7], 남조류, 균류, 미세조류 및 해조류에서 합성된다[8,9]. MAAs는 cyclohexenone과 cuclohexenimine chromophore가 아미노산의 질소치환기 또는 imino 알콜기와 결합되어 있는 구조이며[10], 최대흡수파장은 310-360 nm이다[11].
Rediofrequency(RF)란?
Rediofrequency(RF)는 3 kHz-300 GHz까지 범위에 있는 전자기파이다. 최근 RF의 사용이 급증하고, RF를 방출하는 기기가 보편화됨에 따라 RF의 생체악영향에 관련된 연구가 증가하고 있다.
조기경보자로써 활용가능한 바이오마커는 무엇인가?
바이오마커는 인위적인 환경요인에 의해 유도되는 생화학, 분자생물학 또는 생리적 반응을 특이적으로 반영하는 지표로 정의될 수 있다. 바이오마커는 물리·화학적 영향에 대한 특이적이고, 민감하고 분명한 반응을 나타내며, 반응이 짧은 시간에 나타나게 되므로 조기경보자 (early warning system)로써 활용가능하다[27].
참고문헌 (28)
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