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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 BACE2의 효소학적 특성 규명 및 해양생물 유래 알츠하이머병 관련 저해활성물질 탐색에 필요한 활성형 BACE2를 생산하는 최적 방법을 고안하고자 하였다. 본 연구에서는 BACE2의 대량발현을 위하여 다양한 발현계를 작성하여 효소 생산에 최적인 발현벡터 및 단백질 발현 방법을 검토하였다.
- 무기금속 이온과 효소 저해제가 BACE2의 활성에 미치는 영향을 조사하였다. 무기금속이온과 저해제의 최종농도는 각각 0.
- 따라서 본 연구에서는 BACE2의 효소학적 특성 규명 및 해양생물 유래 알츠하이머병 관련 저해활성물질 탐색에 필요한 활성형 BACE2를 생산하는 최적 방법을 고안하고자 하였다. 본 연구에서는 BACE2의 대량발현을 위하여 다양한 발현계를 작성하여 효소 생산에 최적인 발현벡터 및 단백질 발현 방법을 검토하였다. 그 결과 pET11a/BACE2 발현벡터를 이용한 BACE2 단백질의 발현량이 최적인 것으로 확인되었다.
- 이와 같이, 인간 질병에 관여할 가능성이 높은 BACE2 protease의 효소학적 특성 및 해양생물 유래 천연저해물질을 탐색하기 위해서는 다량의 활성형 BACE2를 생산할 필요가 있다. 본 연구에서는 효소활성을 가지고 있는 BACE2를 간편한 방법으로 대량으로 생산하기 위하여, 그 유전자를 함유하고 있는 human placenta cDNA library를 사용하여 PCR법으로 BACE2의 유전자를 증폭하고, pET11a 발현 벡터의 BamHI 제한효소 자리에 삽입하여 pET11a/BACE2 발현벡터를 구축하였다. 이 벡터에서 발현되는 BACE2의 전체 단백질은 Fig.
제안 방법
- BACE2의 최적 발현조건을 검토하기 위하여 대장균 BL21, BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS 및 TB1을 pET11a/BACE2 발현벡터로 각각 형질전환시켰다. 각 형질 전환된 숙주 내의 BACE2 발현은 각각의 대장균을 37℃에서 약 2시간동안 배양하여, 1 mM IPTG (최종 농도)를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다.
- Forward primer (5’-GGATCCGCCGCCCCGGAGCTGGCCCCCGCGC-3’)에는 BamHI site (밑줄)와 BACE2의 N-말단의 20번째 Ala을 포함하는 아미노산(AAPELAPA-)을 코딩하는 25개의 nucleotides를 도입하였다.
- OD600이 0.6-0.8이 되었을 때 단백질 발현유도제인 IPTG (최종 농도, 1 mM)를 투여하여 37℃에서 3시간 더 진탕 배양한 후, 원심분리(5,000×g, 15 min, 4℃)하여 집균 하였다.
- 단백질 리폴딩이 완료된 효소용액은 ultrafiltration 법으로 농축하여, 원심분리(12,000×g, 30 min, 4℃)하였다.
- coli 내에서 성공적으로 발현시킬 수 있었다. 또한 BACE2 protease를 rapid-dilution 방법으로 성공적으로 리폴딩하여, Sephacryl S-300 겔 여과 및 Resource-Q 이온교환 컬럼 크로마토그래피 방법을 이용한 2단계의 간편한 단백질 정제방법을 확립하였다. 또한 정제한 프로테아제의 효소활성 및 그 특성을 확인한 결과, 본 효소는 BACE2 protease라는 것이 확인되었다.
- 그 결과 pET11a/BACE2 발현벡터를 이용한 BACE2 단백질의 발현량이 최적인 것으로 확인되었다. 또한 대량 발현된 BACE2의 inclusion body를 refolding한 후, Sephacryl S-300 gel filtration 및 ResourceQ 컬럼 크로마토그래피법을 이용한 2단계의 간단한 정제방법을 확립하였으며, 정제한 효소의 다양한 효소학적 특성을 규명하였다.
- 1B). 또한, 단백질 발현에 영향을 미치는 단백질 유도제 첨가 후의 발현 시간을 최적화하기 위하여 발현시간을 다양하게 변화시키면서 BACE2를 발현시킨 후, 각 균체를 12.5% SDS-PAGE 전기영동법으로 단백질 발현량을 비교 검토하였다. Fig.
- 무기금속 이온과 효소 저해제가 BACE2의 활성에 미치는 영향을 조사하였다. 무기금속이온과 저해제의 최종농도는 각각 0.1-1 mM이 되도록 첨가하여 효소활성을 측정하였다. 정제 단백질의 분자량은 MALDI-TOF mass spectrometer (Applied Biosystems Voyager-DE STR mass spectrometer, USA)를 사용하여 측정하였다.
- 본 효소의 반응속도상수(Km, Vmax & kcat)는 위에서 설명한 것과 같이 합성 펩타이드 기질, NCH-γ peptide를 사용하여 측정하였다.
- 0×150 mm)을 사용하여 HPLC system으로 분석하였다. 분해된 펩타이드 획분의 용출은 0.06% trifluoroacetic acid를 포함하는 5% acetonitrile 농도에서 0.08% trifluoroacetic acid를 포함하는 95% acetonitrile 농도까지 직선농도구배법으로 실시하며, 215 nm의 흡광도에서 펩타이드 획분을 모니터하였다. 각각 분리한 펩타이드 획분들은 아미노산분석법에 의해 동정 및 정량 하였다.
- 상층액을 완충액 C (0.4 M Urea를 포함하는 20 mM Tris/HCl, pH 8.0)로 평형화시킨 Sephacry S-300 (2.6×60 cm, prepacked, GE Healthcare)을 사용한 gel filtration 방법으로 refolded 단백질을 정제하였다.
- BL21(DE3) 대장균을 pET11a/BACE2 플라스미드로 형질전환시켜 ‘재료 및 방법’에서 설명한 것과 같이 재조합 BACE2를 대량 발현하였다. 이 균체를 세척, 세포막 파쇄, 및 재세척과정을 거쳐 inclusion body를 분리하였다. 이 BACE2 inclusion body를 in vitro에서 rapid-dilution 방법으로 리폴딩하여 활성형 BACE2를 생산하였다.
- 이 반응 혼합물을 3,000×g에서 10 min 동안 원심분리 한 후, 그 상층액을 C18 reverse-phase column (1.0×150 mm)을 사용하여 HPLC system으로 분석하였다.
- 각 형질 전환된 숙주 내의 BACE2 발현은 각각의 대장균을 37℃에서 약 2시간동안 배양하여, 1 mM IPTG (최종 농도)를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 이들 대장균을 동일조건 하에서 4시간 동안 배양 후, 각 배양균체의 단백질을 12.5% SDS-PAGE 전기영동을 실시하여, 그 효소 발현량을 비교 검토하였다. 그 결과, BL21(DE3) 대장균에서 recombinant BACE2 (461 아미노산: 49.
- 효소 단백질이 함유된 Resource-Q 컬럼 분획을 회수하여 완충액 C로 투석한 다음, 원심분리(12,000×g, 30 min, 4℃)하였다. 이상의 과정으로 정제한 효소를 4℃에 보관하면서 정제 효소의 활성 및 특성실험에 사용하였다. 정제 효소의 단백질정량은 소 혈청 알부민을 표준 단백질로 사용하여 Pierce BCA Protein Assay kit (Thermo)으로 측정하였다.
- 재조합 BACE2를 정제하기 위하여, 위의 상층액을 Sephacryl S-300 gel filtration 및 Resource-Q 컬럼 크로마토그래피 방법을 이용하여 BACE2를 완전 정제하였다. 최종적으로 정제한 효소의 정제도를 확인하기 위하여 전기영동을 실시한 결과, 분자량 50 kDa 부근에서 단일 밴드가 확인되어(Fig.
- 이상의 과정으로 정제한 효소를 4℃에 보관하면서 정제 효소의 활성 및 특성실험에 사용하였다. 정제 효소의 단백질정량은 소 혈청 알부민을 표준 단백질로 사용하여 Pierce BCA Protein Assay kit (Thermo)으로 측정하였다.
- PCR생성물은 1% agarose gel 전기영동으로 확인한 후, PCR purification kit (Qiagen)로 정제하여 발현계의 구축에 사용하였다. 정제된 BACE2 유전자와 발현벡터 pET11a를 제한효소 BamHI으로 절단한 후 ligation하여 재조합 pET11a/BACE2 벡터를 작성하였다.
- 정제한 BACE2의 효소활성은 합성 펩타이드 기질, NCH-γ peptide (Val-Gly-Ser-Gly-Val-Leu-Leu-Ser-Arg-Lys)를 사용하여 Leu잔기와 Ser잔기 사이의 펩타이드 결합의 절단속도로 결정하였다.
- 효소 단백질이 함유된 Resource-Q 컬럼 분획을 회수하여 완충액 C로 투석한 다음, 원심분리(12,000×g, 30 min, 4℃)하였다.
- 효소 단백질이 함유된 분획을 회수하여 완충액 C로 평형화시킨 Resource-Q (1.6×3 cm, prepacked, GE Healthcare) 컬럼에 주입하고, 충분한 양의 완충액 C로 컬럼 내의 비흡착단백질을 제거하기 위해 세척한 후, 완충액 C의 NaCl 농도가 0-0.5M에 이르도록 농도 기울기법으로 분별 용출하였다.
- 효소반응의 초기 속도를 측정하기 위하여 효소농도는 약 6.26 μM, 기질 농도는 0.1-2 mM의 범위에서 반응속도를 측정하였다.
대상 데이터
- 0 cm, prepacked)는 GE Healthcare (NJ, USA)에서 구매하여 사용하였다. Antipain, Aprotinin, Chymostatin, E-64, Leupeptin, Pepstatin, Phosphoramidon, 및 Pefabloc SC 등은 Sigma (MO, USA) 제품을 사용하였다. 그 외에 본 실험에 사용된 모든 시약은 분석용 특급시약을 사용하였다.
- BL21(DE3) 대장균을 pET11a/BACE2 플라스미드로 형질전환시켜 ‘재료 및 방법’에서 설명한 것과 같이 재조합 BACE2를 대량 발현하였다.
- Glutathione (oxidized & reduced form), isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG), dithiothreitol (DTT), EDTA 및 β-mercaptoethanol은 Sigma (MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
- coli strain DH5α, BL21 (DE3) 및 plasmid pET11a는 Novagen (Madison, USA)으로 부터 구입하였다. Restriction endonucleases, DNA amplification reagents, nTag DNA polymerase, 및 DNA ligation kit은 New England BioLabs (MA, USA) 제품을 사용하였다. Glutathione (oxidized & reduced form), isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG), dithiothreitol (DTT), EDTA 및 β-mercaptoethanol은 Sigma (MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
- Reverse primer (5’-GGATCCTCAGGGCTCGCTCAAAGACTGAGCGGG-3’)에는 BamHI site (밑줄), stop codon (고딕체), 및 BACE2의 하단의 459-466번째 아미노산(PAQSLSEP)을 코딩하는 24개의 nucleotides를 삽입한 것을 사용하였다.
- Sephacryl S-300 (2.6×60 cm, prepacked) 및 Resource-Q (1.6×3.0 cm, prepacked)는 GE Healthcare (NJ, USA)에서 구매하여 사용하였다.
- 1A에 도식으로 나타내었다. 발현단백질은 N-말단에서부터 T7 tag sequence, BACE2의 pro domain (20A-62L) 및 mature domain (63A-466P)의 순서로 구성된 recombinant BACE2 단백질이 발현되도록 디자인하였다.
- 본 실험에서 사용한 기질은 화학적으로 합성한 펩타이드(Val-Gly-Ser-Gly-Val-Leu-Leu-Ser-Arg-Lys: NCH-γ peptide)을 사용하여 분석하였다(Schroeter et al., 1998).
- 본 연구에서 사용한 E. coli strain DH5α, BL21 (DE3) 및 plasmid pET11a는 Novagen (Madison, USA)으로 부터 구입하였다.
- 51(M+H)+이었다(결과 생략). 이론적으로 pET11a/BACE2 벡터에서 발현되는 재조합 BACE2는 461개의 아미노산으로 구성되어있고, 그 분자량은 49,173 kDa인 단백질이 발현되도록 디자인하였다. 본 실험에서 정제한 단백질과 재조합BACE2의 이론적인 분자량을 비교해 보면 그 분자량이 약 0.
이론/모형
- BACE2의 유전자는 human placenta cDNA library (Clontech)로부터 아래의 oligonucleotide primers를 사용하여 polymerase chain reaction (PCR) 법으로 유전자를 증폭하여 사용하였다. Forward primer (5’-GGATCCGCCGCCCCGGAGCTGGCCCCCGCGC-3’)에는 BamHI site (밑줄)와 BACE2의 N-말단의 20번째 Ala을 포함하는 아미노산(AAPELAPA-)을 코딩하는 25개의 nucleotides를 도입하였다.
- BACE2의 효소 활성 측정은 Kim et al. (2002)의 방법으로 다음과 같이 결정하였다. 본 실험에서 사용한 기질은 화학적으로 합성한 펩타이드(Val-Gly-Ser-Gly-Val-Leu-Leu-Ser-Arg-Lys: NCH-γ peptide)을 사용하여 분석하였다(Schroeter et al.
- N-말단 아미노산 서열 분석은 Porcise® cLC System Model 492 cLC (Applied Biosystem, USA)를 사용하여 Edman 분해법으로 분석하였다.
- 08% trifluoroacetic acid를 포함하는 95% acetonitrile 농도까지 직선농도구배법으로 실시하며, 215 nm의 흡광도에서 펩타이드 획분을 모니터하였다. 각각 분리한 펩타이드 획분들은 아미노산분석법에 의해 동정 및 정량 하였다. BACE2의 효소 활성 1 unit는 1 min 당 생산된 1 nmol 기질 분해 펩타이드 농도로 정의하였다.
- 이 균체를 세척, 세포막 파쇄, 및 재세척과정을 거쳐 inclusion body를 분리하였다. 이 BACE2 inclusion body를 in vitro에서 rapid-dilution 방법으로 리폴딩하여 활성형 BACE2를 생산하였다. 이렇게 리폴딩된 단백질 용액(4 liter)을 회수하여 약 40 mL까지 농축한 후, 원심분리하여 저분자 물질 및 불용성 물질을 제거하였다.
- 1 mM oxidized glutathione 용액에, 1:5 (v/v)로 희석시켜 unfolded 단백질을 제조하였다. 이 단백질의 리폴딩은 rapid dilution 방법(Lin et al., 2000; Kim et al., 2002)에 따라 아래와 같이 실행하였다. 위의 unfolded 단백질 용액을 20배 양의 20 mM Tris base에 희석한 후, 1 M HCl을 사용하여 단백질 용액의 pH를 하루에 0.
- 1-1 mM이 되도록 첨가하여 효소활성을 측정하였다. 정제 단백질의 분자량은 MALDI-TOF mass spectrometer (Applied Biosystems Voyager-DE STR mass spectrometer, USA)를 사용하여 측정하였다. N-말단 아미노산 서열 분석은 Porcise® cLC System Model 492 cLC (Applied Biosystem, USA)를 사용하여 Edman 분해법으로 분석하였다.
- 효소의 반응속도상수(Km & Vmax)는 BACE2 효소 활성 측정 기질과 동일한 합성펩타이드를 사용하여 Lineweaver-Burk plot 방법으로 결정하였다.
성능/효과
- T7-tag, T7 sequence; Pro, Pro domain; BACE2, mature protease region; D, active-site aspartic acid. (B) SDS-PAGE profiles of BACE2 protease expressed in various time periods (0, 1, 2, 3, 4, 5, 6h) after induction by 1mM IPTG. The expression of the recombinant BACE2 protease was confirmed by the 12.
- 그 결과 BACE2 protease의 특이적인 효소활성은 15,120 (pmol/min·mg)으로 확인되었다.
- 본 연구에서는 BACE2의 대량발현을 위하여 다양한 발현계를 작성하여 효소 생산에 최적인 발현벡터 및 단백질 발현 방법을 검토하였다. 그 결과 pET11a/BACE2 발현벡터를 이용한 BACE2 단백질의 발현량이 최적인 것으로 확인되었다. 또한 대량 발현된 BACE2의 inclusion body를 refolding한 후, Sephacryl S-300 gel filtration 및 ResourceQ 컬럼 크로마토그래피법을 이용한 2단계의 간단한 정제방법을 확립하였으며, 정제한 효소의 다양한 효소학적 특성을 규명하였다.
- 그 결과, BACE2의 반응속도상수 Km = 0.2 mM, Vmax = 0.054 μM·S-1, kcat =0.0087 s-1이었다(Fig. 2).
- 5% SDS-PAGE 전기영동을 실시하여, 그 효소 발현량을 비교 검토하였다. 그 결과, BL21(DE3) 대장균에서 recombinant BACE2 (461 아미노산: 49.2 kDa)에 해당되는 새로운 단백질의 발현을 확인할 수 있었다(Fig. 1B). 또한, 단백질 발현에 영향을 미치는 단백질 유도제 첨가 후의 발현 시간을 최적화하기 위하여 발현시간을 다양하게 변화시키면서 BACE2를 발현시킨 후, 각 균체를 12.
- 발현 벡터 pET11a/BACE2에 의해 대량발현된 BACE2의 전기영동 젤을 densitometer로 분석한 결과, 총 대장균 단백질의 약 10%까지 발현되는 것으로 확인되었다. 따라서, BACE2 단백질의 발현량을 효율적으로 높이기 위해서는 단백질 발현 유도제를 첨가한 후 약 3시간 이상 배양하는 것이 최적인 것으로 확인되었다(Fig. 2B)
- 또한 BACE2 protease를 rapid-dilution 방법으로 성공적으로 리폴딩하여, Sephacryl S-300 겔 여과 및 Resource-Q 이온교환 컬럼 크로마토그래피 방법을 이용한 2단계의 간편한 단백질 정제방법을 확립하였다. 또한 정제한 프로테아제의 효소활성 및 그 특성을 확인한 결과, 본 효소는 BACE2 protease라는 것이 확인되었다. 현재까지 다양한 종류의 알츠하이머병 치료제 개발에 많은 연구자들이 연구하였으나, 알츠하이머성 치매에 효과적인 치료제개발에 이르지 못하였다.
- 2 kDa과 일치한다. 발현 벡터 pET11a/BACE2에 의해 대량발현된 BACE2의 전기영동 젤을 densitometer로 분석한 결과, 총 대장균 단백질의 약 10%까지 발현되는 것으로 확인되었다. 따라서, BACE2 단백질의 발현량을 효율적으로 높이기 위해서는 단백질 발현 유도제를 첨가한 후 약 3시간 이상 배양하는 것이 최적인 것으로 확인되었다(Fig.
- 이론적으로 pET11a/BACE2 벡터에서 발현되는 재조합 BACE2는 461개의 아미노산으로 구성되어있고, 그 분자량은 49,173 kDa인 단백질이 발현되도록 디자인하였다. 본 실험에서 정제한 단백질과 재조합BACE2의 이론적인 분자량을 비교해 보면 그 분자량이 약 0.02%의 오차 범위인 것으로 확인되어 정제한 단백질과 재조합 BACE2의 분자량은 일치하는 것으로 확인 되었다. 한편, 정제한 효소의 N-말단 아미노산 배열을 알아보기 위해 아미노산서열 분석을 한 결과, Ala-Ser-Met-Thr-Gly의 5개의 아미노산배열을 확인하였다.
- 이 배열은 재조합 BACE2의 1번 아미노산부터 5번 아미노산까지의 배열에 해당한다. 위의 정제한 단백질의 분자량 측정 및 N-말단 아미노산 분석 결과를 종합해 보면, 본 실험에서 생산된 단백질은 재조합 BACE2 protease (461개 아미노산; 분자량: 49,173)인 것으로 명확히 확인되었다.
- 그 결과 BACE2 protease의 특이적인 효소활성은 15,120 (pmol/min·mg)으로 확인되었다. 이러한 결과는 human BACE2를 pET11a/BACE2 발현벡터를 사용하여 대장균에서 발현시켜 리폴딩 및 정제한 재조합 BACE2 protease는 충분한 효소활성을 가지고 있는 것으로 판단된다. 본 효소의 반응속도상수(Km, Vmax & kcat)는 위에서 설명한 것과 같이 합성 펩타이드 기질, NCH-γ peptide를 사용하여 측정하였다.
- 이상의 결과처럼, 우리는 본 연구에서 구축한 pET11a/BACE2 발현 벡터를 이용하여 human BACE2 protease를 E. coli 내에서 성공적으로 발현시킬 수 있었다. 또한 BACE2 protease를 rapid-dilution 방법으로 성공적으로 리폴딩하여, Sephacryl S-300 겔 여과 및 Resource-Q 이온교환 컬럼 크로마토그래피 방법을 이용한 2단계의 간편한 단백질 정제방법을 확립하였다.
- 1C, lane 2), 재조합 BACE2 단백질이 균일하게 정제된 것으로 판단되었다. 이상의 정제과정의 결과, 4 Liter의 배양액으로부터 완전 정제한 BACE2 protease를 약 100 mg 생산할 수 있는 것으로 확인되었다. 정제한 BACE2의 효소활성은 합성 펩타이드 기질, NCH-γ peptide (Val-Gly-Ser-Gly-Val-Leu-Leu-Ser-Arg-Lys)를 사용하여 Leu잔기와 Ser잔기 사이의 펩타이드 결합의 절단속도로 결정하였다.
- 최종적으로 정제한 재조합 BACE2의 분자량은 MALDI-TOF mass spectrometer를 이용하여 측정한 결과 m/z=49183.51(M+H)+이었다(결과 생략). 이론적으로 pET11a/BACE2 벡터에서 발현되는 재조합 BACE2는 461개의 아미노산으로 구성되어있고, 그 분자량은 49,173 kDa인 단백질이 발현되도록 디자인하였다.
- 재조합 BACE2를 정제하기 위하여, 위의 상층액을 Sephacryl S-300 gel filtration 및 Resource-Q 컬럼 크로마토그래피 방법을 이용하여 BACE2를 완전 정제하였다. 최종적으로 정제한 효소의 정제도를 확인하기 위하여 전기영동을 실시한 결과, 분자량 50 kDa 부근에서 단일 밴드가 확인되어(Fig. 1C, lane 2), 재조합 BACE2 단백질이 균일하게 정제된 것으로 판단되었다. 이상의 정제과정의 결과, 4 Liter의 배양액으로부터 완전 정제한 BACE2 protease를 약 100 mg 생산할 수 있는 것으로 확인되었다.
- 02%의 오차 범위인 것으로 확인되어 정제한 단백질과 재조합 BACE2의 분자량은 일치하는 것으로 확인 되었다. 한편, 정제한 효소의 N-말단 아미노산 배열을 알아보기 위해 아미노산서열 분석을 한 결과, Ala-Ser-Met-Thr-Gly의 5개의 아미노산배열을 확인하였다. 이 배열은 재조합 BACE2의 1번 아미노산부터 5번 아미노산까지의 배열에 해당한다.
후속연구
- , 2005). 따라서 본 연구에서 확보된 효소를 사용하여 BACE2의 효소활성발현 메커니즘 규명뿐만 아니라 다양한 해양생물 유래 β-secretase 관련 효소들의 저해물질을 탐색하여 알츠하이머병 치료제 개발방향의 패러다임을 전환할 필요가 있다.
- 대표적인 억제제로는 peptide-based inhibitor, Isophthalamide-based inhibitor, acyclic acylguamidines, cyclic acylguamidine inhibitor 등의 후보물질들이 개발되고 있으나 알츠하이머성 치매에 효과적인 완전한 치료제는 아직 알려져 있지 않다(Stachel SJ, 2009). 한편, 해양생물 종의 다양성과 진화과정의 독자성 및 서식환경의 특이성이라는 요인에 의하여 기존의 육상생물이 보유하고 생산할 수 없는 다양한 생체분자 및 화학물질을 보유하고 있을 가능성이 높아 새로운 알츠하이머성 치매 억제제 개발에 이 이상의 좋은 소재는 없을 것으로 생각된다.
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