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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 누에 추출물(SWE)이 체내의 활성산소 생성에 미치는 영향을 규명하기 위하여 누에의 에탄올 추출물을 20 mg/kg/day의 농도로 14일 간 생쥐의 복강에 투여한 후, MDA와 H2O2의 함량을 혈청과 뇌의 조직에서 정량하였다.
- 따라서 본 연구에서는 지질과산화와 활성산소를 측정할 수 있는 지표들을 실험동물의 혈액과 뇌의 조직에서 정량함으로서 누에 추출물(SWE)이 체내 활성산소 생성에 미치는 효능을 규명하고자 한다. MDA의 함량은 누에 추출물(SWE)을 실험동물에 처리함에 따라 혈청과 뇌 조직에서 유의적으로 감소함을 보였다 (Fig.
제안 방법
- 전뇌, 대뇌피질 및 소뇌의 미토콘드리아 분획과 세포질 분획에서 MDA의 함량은 각 분획의 단백질 함량을 1 ㎎/㎖으로 동일하게 보정한 후, 위의 방법에서 혈청을 대신에 각 뇌 조직액의 미토콘드리아 분획이나 세포질 분획을 100 ㎕ 넣어 분석하였다. MDA 의 표준용액은 1,2,3,3-tetraethoxypropane을 2, 4, 6, 8, 10, 20, 30 nmole의 농도로 제조하여 사용하였다.
- 실험동물은 생리식염수나 누에 추출물(SWE)을 마지막으로 투여한 후, 24시간 절식시킨 다음, CO2로 희생시켰다. 그 다음으로 약 500 ㎕의 혈액을 심장에서 채혈한 후, 곧바로 두개골을 열어 뇌(brain)을 적출하였다. 적출한 뇌 조직은 전뇌(whole brain), 대뇌피질(cerebral cortex), 소뇌(cerebellum)를 구분하여 액체질소에 곧바로 넣은 후, –70℃인 deep freezer에 보관하면서 분석하였다.
- H2O2는 dichlorofluorescin (DCFH)를 fluorescent dichlorofluorescein (DCF)로 산화시킨다28,29). 그러므로 본 연구자는 전뇌, 대뇌피질 및 소뇌에서 DCF를 정량하는 간접적인 방법으로 H2O2를 정량하였다. H2O2의 함량은 누에 추출물(SWE)을 실험동물에 처리함에 따라 전뇌(whole brain), 대뇌피질(cerebral cortex) 및 소뇌(cerebellum)에서 대조군에 비하여 유의적으로 감소함을 보였다(Fig.
- 농가에서 직접 구입한 5령 3일된 누에를 –20℃에서 동사시켜 분쇄한 누에 가루 200g과 70% 알코올 1L를 혼합한 다음, 초음파를 1분간 가하고 30초간 쉬는 과정을 5회 반복하였다.
- 누에추출물이 체내 활성산소의 생성에 미치는 영향을 조사하고자 누에 추출물(SWE)을 실험동물에 투여한 후, 체중 변화, MDA 및 H2O2의 함량을 분석하여 다음과 결과를 얻었다. 누에 추출물(SWE)이 웅성 생쥐(male mouse, C57BL/6)의 혈청과 뇌조직에서 MDA와 과산화수소(H2O2)의 함양을 유효하게 감소시키는 것으로 볼 때, 누에 추출물(SWE)은 노화, 성인병, 독성물질, 방사선 노출 등으로 인한 체내 활성산소의 과도한 생성을 억제시킬 뿐만 아니라 세포의 산화적 손상을 감소시키는 것을 입증한 결과이다.
- 대조군과 누에 추출물(SWE) 투여군으로부터 적출한 뇌는 전뇌, 대뇌피질 및 소뇌를 구분한 후, 미토콘드리아 분획과 세포질 분획을 제조하였다. 즉, 각각의 뇌 조직을 10 mM sodium phosphate buffer (pH 7.
- 대조군과 누에 추출물(SWE) 투여군으로부터 채혈한 혈액을 실온에서 30분간 방치한 다음, 원심분리(3,000 rpm, 10 min)하여 얻은 상등액을 혈청(serum)으로 이용하였다.
- 동물실험은 생리식염수(0.9% NaCl)를 14일간 생쥐의 복강에 투여한 대조군(control)과 누에 추출물(SWE)을 20 mg/kg/day의 농도로 14일간 생쥐의 복강에 투여한 실험군(SWE)으로 나누었다. 실험동물은 생리식염수나 누에 추출물(SWE)을 마지막으로 투여한 후, 24시간 절식시킨 다음, CO2로 희생시켰다.
- 동물의 사육 조건은 온도 22±2℃, 습도 40-60%, 환기 12-15회/시간으로 유지하였으며, 조명은 200-300 Lux로 12시간 지속하고 나머지 12시간은 모든 빛을 차단하였다.
- 본 연구에서는 acetic acid, Bovine serum albumin, 2,7-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA), hydrogen peroxide, hydrochloric acid, sodium deoxychlolate, sodium dodecyl sulfate (SDS), sodium hydroxide, sodium phosphate, 1,2,3,3-tetraethoxypropane, thiobarbituric acid 등 Sigma사의 제품을 이용하였다. 본 실험에서는 spectrophotometer (Beckman, DU-70), 감압농축기(Buchi, R-114), 원심분리기(Hanil HRT-60IV, Sorvall RC-28S, Beckman XL-90), luminescence spectrometer (Perkin-Elmer, LS-50B), shaker (Taitec, SR-Ⅱ), homogenizer (OMNI) 등을 이용하였다.
- 9% NaCl)를 14일간 생쥐의 복강에 투여한 대조군(control)과 누에 추출물(SWE)을 20 mg/kg/day의 농도로 14일간 생쥐의 복강에 투여한 실험군(SWE)으로 나누었다. 실험동물은 생리식염수나 누에 추출물(SWE)을 마지막으로 투여한 후, 24시간 절식시킨 다음, CO2로 희생시켰다. 그 다음으로 약 500 ㎕의 혈액을 심장에서 채혈한 후, 곧바로 두개골을 열어 뇌(brain)을 적출하였다.
- 실험동물의 체중은 동물실험 첫째 날 누에 추출물(SWE)을 실험동물에 투여하기 직전과 14일째 누에 추출물(SWE)을 투여한 직후에 측정하였다. 그 결과 동물실험 첫째 날 대조군의 체중은 동물실험 14일 째의 체중과 유의적인 차이를 보이지 않았다.
- 적출한 뇌 조직은 전뇌(whole brain), 대뇌피질(cerebral cortex), 소뇌(cerebellum)를 구분하여 액체질소에 곧바로 넣은 후, –70℃인 deep freezer에 보관하면서 분석하였다.
- 이것을 원심분리(3,000 rpm, 10 min)하여 얻은 상등액의 흡광도를 532 nm에서 측정하였다. 전뇌, 대뇌피질 및 소뇌의 미토콘드리아 분획과 세포질 분획에서 MDA의 함량은 각 분획의 단백질 함량을 1 ㎎/㎖으로 동일하게 보정한 후, 위의 방법에서 혈청을 대신에 각 뇌 조직액의 미토콘드리아 분획이나 세포질 분획을 100 ㎕ 넣어 분석하였다. MDA 의 표준용액은 1,2,3,3-tetraethoxypropane을 2, 4, 6, 8, 10, 20, 30 nmole의 농도로 제조하여 사용하였다.
- 본 연구에서 MDA의 함량은 Suematsu 등19) 의 방법을 통하여 혈청, 전뇌, 대뇌피질 및 소뇌에서 각각 측정하였다. 즉, 20% acetic acid 750 ㎕ 8.1% SDS 111.25 ㎕, 증류수 37.25 ㎕, 1.2% TBA 500 ㎕와 혈청 100 ㎕를 혼합하여 100℃에서 30분간 가열하여 발색하였다. 이것을 원심분리(3,000 rpm, 10 min)하여 얻은 상등액의 흡광도를 532 nm에서 측정하였다.
- 의 방법을 통하여 전뇌, 대뇌피질및 소뇌에서 각각 측정하였다. 즉, 각 뇌의 미토콘드리아 분획 50㎕, 40mM Tris-HCl buffer(pH 7.4) 935 ㎕, DCFH (dichlorofluorescin) 25 ㎕와 1 mM FeSO4 10㎕를 넣은 후, 37℃에서 15분간 반응시켜 형성된 DCF(fluorescent dichlorofluorescein)를 형광광도계(excitation; 488 nm, emission; 525 nm)를 이용하여 측정하였다. DCFH는 1 mM 2,7-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA) 0.
- 기존의 연구자들은 혈당강하효과7-12), 기관지의 점액분비 촉진효과13), monoamine oxidase-B의 억제효과14). 파킨슨병 동물모델에서 신경전달물질인 도파민의 보호효과15) 등 누에의 약리학적인 효능을 과학적으로 규명하였다. 최근에는 항당뇨 음료와 같은 기능성의 음료를 개발하기 위한 누에추출물의 기초 연구가 진행되었다16-17).
대상 데이터
- H2O2의 표준용액은 H2O2을 10, 20, 30, 40, 60, 80, 100 μmole의 농노로 제조하여 사용하였다.
- 본 연구에서는 acetic acid, Bovine serum albumin, 2,7-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA), hydrogen peroxide, hydrochloric acid, sodium deoxychlolate, sodium dodecyl sulfate (SDS), sodium hydroxide, sodium phosphate, 1,2,3,3-tetraethoxypropane, thiobarbituric acid 등 Sigma사의 제품을 이용하였다. 본 실험에서는 spectrophotometer (Beckman, DU-70), 감압농축기(Buchi, R-114), 원심분리기(Hanil HRT-60IV, Sorvall RC-28S, Beckman XL-90), luminescence spectrometer (Perkin-Elmer, LS-50B), shaker (Taitec, SR-Ⅱ), homogenizer (OMNI) 등을 이용하였다.
- 실험동물은 생후 3개월 된 C57BL/6 계통(strain)의 웅성 생쥐(male mouse)를 이용하였다. 동물의 사육 조건은 온도 22±2℃, 습도 40-60%, 환기 12-15회/시간으로 유지하였으며, 조명은 200-300 Lux로 12시간 지속하고 나머지 12시간은 모든 빛을 차단하였다.
- 동물의 사육 조건은 온도 22±2℃, 습도 40-60%, 환기 12-15회/시간으로 유지하였으며, 조명은 200-300 Lux로 12시간 지속하고 나머지 12시간은 모든 빛을 차단하였다. 실험동물의 사료는 조단백질 22.0%, 조지방 4.5%, 칼슘 0.7%, 인 0.5%, 조섬유 6.0%, 조회분 8.0% 및 비타민과 미네랄이 0.4% 함유된 제품의 고형사료를 공급하였다. 물은 멸균수를 충분히 공급해 주었다.
데이터처리
- 본 연구의 실험결과는 평균±표준편차로 나타내었고, Student’s t-test 프로그램으로 통계처리한 후, P값이 0.05 이하인 경우에 통계학적으로 유의성이 있다고 판정하였다.
이론/모형
- H2O2함량은 Cathcart 등20)의 방법을 통하여 전뇌, 대뇌피질및 소뇌에서 각각 측정하였다. 즉, 각 뇌의 미토콘드리아 분획 50㎕, 40mM Tris-HCl buffer(pH 7.
- 모든 작업은 단백질의 변성을 최소화하기 위하여 4℃의 cold room에서 수행하였다. 모든 단백질은 Lowry 등18)의 방법을 통하여 정량하였다.
- MDA는 thiobarbituric acid와 반응하여 532 nm에서 빛을 흡수하면 complex를 형성하기 때문에 지질과산화의 지표로서 이용되는 물질이다. 본 연구에서 MDA의 함량은 Suematsu 등19) 의 방법을 통하여 혈청, 전뇌, 대뇌피질 및 소뇌에서 각각 측정하였다. 즉, 20% acetic acid 750 ㎕ 8.
성능/효과
- 그러므로 본 연구자는 전뇌, 대뇌피질 및 소뇌에서 DCF를 정량하는 간접적인 방법으로 H2O2를 정량하였다. H2O2의 함량은 누에 추출물(SWE)을 실험동물에 처리함에 따라 전뇌(whole brain), 대뇌피질(cerebral cortex) 및 소뇌(cerebellum)에서 대조군에 비하여 유의적으로 감소함을 보였다(Fig. 5).
- 따라서 본 연구에서는 지질과산화와 활성산소를 측정할 수 있는 지표들을 실험동물의 혈액과 뇌의 조직에서 정량함으로서 누에 추출물(SWE)이 체내 활성산소 생성에 미치는 효능을 규명하고자 한다. MDA의 함량은 누에 추출물(SWE)을 실험동물에 처리함에 따라 혈청과 뇌 조직에서 유의적으로 감소함을 보였다 (Fig. 1, 2, 4). H2O2는 dichlorofluorescin (DCFH)를 fluorescent dichlorofluorescein (DCF)로 산화시킨다28,29).
- 실험동물의 체중은 동물실험 첫째 날 누에 추출물(SWE)을 실험동물에 투여하기 직전과 14일째 누에 추출물(SWE)을 투여한 직후에 측정하였다. 그 결과 동물실험 첫째 날 대조군의 체중은 동물실험 14일 째의 체중과 유의적인 차이를 보이지 않았다. 동물실험 첫째 날 누에 추출물(SWE) 투여군의 체중은 누에 추출물(SWE)을 20 mg/kg/day의 농도로 2주간 투여한 후의 체중과 유의적인 차이를 보이지 않았다(Table 1)
- 그리고 세포질 분획에서 대조군의 MDA 함량은 1.38±0.04 nmoles이었고, 누에 추출물(SWE) 투여군은 1.39± 0.08 nmoles로 대조군과 유의성 있는 차이를 보이지 않았다(Fig. 3).
- 그리고 세포질 분획에서 대조군의 MDA 함량은 2.39±0.07 nmoles이었고, 누에 추출물(SWE) 투여군은 2.11±0.05 nmoles로 대조군에 비하여 약 11% 감소함을 보였다(Fig. 4)
- 그리고 세포질 분획에서 대조군의 MDA 함량은 3.62±0.2 nmoles이었고, 누에 추출물(SWE) 투여군은 2.59±0.15 nmoles로 대조군에 비하여 약 28% 감소함을 보였다(Fig. 2)
- 의 함량을 분석하여 다음과 결과를 얻었다. 누에 추출물(SWE)이 웅성 생쥐(male mouse, C57BL/6)의 혈청과 뇌조직에서 MDA와 과산화수소(H2O2)의 함양을 유효하게 감소시키는 것으로 볼 때, 누에 추출물(SWE)은 노화, 성인병, 독성물질, 방사선 노출 등으로 인한 체내 활성산소의 과도한 생성을 억제시킬 뿐만 아니라 세포의 산화적 손상을 감소시키는 것을 입증한 결과이다.
- 대뇌피질의 미토콘드리아 분획에서 대조군의 H2O2 함량은 62.76±3.17 μ moles이었고, 누에 추출물(SWE) 투여군은 49.61±2.35 μmoles로 대조군에 비하여 약 21% 감소함을 보였다.
- 대뇌피질의 미토콘드리아 분획에서 대조군의 MDA 함량은 2.08±0.13 nmoles이었고, 누에 추출물(SWE) 투여군은 2.05±0.21 nmoles로 대조군과 유의성 있는 차이를 보이지 않았다.
- 대조군의 MAD 함량은 10.82±1.81 nmoles이었고, 누에 추출물(SWE) 투여군은 6.71±0.64 nmoles로 대조군에 비하여 약 39%감소함을 보였다.
- 그 결과 동물실험 첫째 날 대조군의 체중은 동물실험 14일 째의 체중과 유의적인 차이를 보이지 않았다. 동물실험 첫째 날 누에 추출물(SWE) 투여군의 체중은 누에 추출물(SWE)을 20 mg/kg/day의 농도로 2주간 투여한 후의 체중과 유의적인 차이를 보이지 않았다(Table 1)
- 본 연구자는 누에 추출물을 20 mg/kg의 농도로 2주간 생쥐의 복강에 투여하였을때, 체중, 간 및 뇌의 무게에 영향을 주지 않음을 선행의 연구에서 이미 규명한 바 있다15). 본 연구에서도 기존의 결과와 유사한 것으로 보아 누에 추출물(SWE)이 실험동물에 독성물질로 작용하지 않음을 다시 한 번 확인시켜 준 의미 있는 결과라고 생각된다(Table 1)
- 소뇌의 미토콘드리아 분획에서 대조군의 H2O2 함량은 93.61±4.21 μmoles이었고, 누에 추출물(SWE) 투여군은 81.32±2.31 μmoles로 대조군에 비하여 약 13% 감소함을 보였다(Fig. 5).
- 소뇌의 미토콘드리아 분획에서 대조군의 MDA 함량은 2.52±0.1 nmoles이었고, 누에 추출물 (SWE) 투여군은 2.15±0.29 nmoles로 대조군에 비하여 약 15% 감소함을 보였다.
- 이상의 결과를 볼 때, 누에 추출물(SWE)은 체내 활성산소의 과도한 생성을 억제함으로서 세포 내의 단백질, 핵산, 지질의 과산화를 억제시킬 것으로 사료되며, 노화를 지연시키고, 자외선이나 방사선과 같은 유해물질로부터 세포를 보호할 것으로 사료된다.
- 전뇌의 미토콘드리아 분획에서 대조군의 H2O2 함량은 60.25±1.62 μmoles이었고, 누에 추출물(SWE) 투여군은 52.22±1.14μmoles로 대조군에 비하여 약 13% 감소함을 보였다.
- 전뇌의 미토콘드리아 분획에서 대조군의 MDA 함량은 3.41±0.41 nmoles이었고, 누에 추출물(SWE) 투여군은 2.15±0.21 nmoles로 대조군에 비하여 약 37% 감소함을 보였다.
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