진생베리 열수 추출물의 다당체 분해 효소와 인슐린 신호전달 분자 PTP1B와 AKT1에 미치는 효과 Effects of Ginseng Berry Water Extract on the Polysaccharide Hydrolysis of Extracellular Enzymes and Intracellular PTP1B and AKT1원문보기
인삼은 건강에 효과적인 약초라고 알려져 왔다. 인삼의 열매인 진생베리는 인삼의 주성분과 비슷한 ginsenoside, saponin, polyphenol, polyacetylene, alkaloid 등의 성분을 포함한다. 본 연구의 목적은 인삼과 같이 진생베리 열수 추출물(Ginseng berry water extract, GBE)이 당뇨와 연관된 세포 외 효소와 인슐린 신호전달 경로에 있는 분자의 발현에 어떤 효과를 가지고 있는지를 조사하였다. ${\alpha}$-Amylase와 ${\alpha}$-glucosidase는 섭취한 다당분자를 분해하여 포도당을 생성함으로 항당뇨 약물개발의 표적 효소이다. GBE에 의한 두 효소의 활성 억제능을 in vitro에서 측정하였으나 최고 $1,000{\mu}g/ml$ 농도에서도 효소활성 억제능이 나타나지 않았다. 인슐린 신호전달 경로의 영향을 확인하기 위해서 HepG2 세포에서 GBE에 의한 인슐린 신호전달 경로의 주요 단백질인 protein-tyrosine phosphatase 1B (PTP1B)와 Akt1의 발현수준 변화를 Western blot 방법으로 조사하였다. 이때 인슐린에 의한 이들 분자의 변화에 GBE가 영향을 주는 것으로 나타났다. PTP1B는 인슐린에 의해 증가된 발현량이 저농도의 GBE이 의해 더욱 증가하였으나, $200{\mu}g/ml$ 농도의 GBE에 의해서는 다소 감소하는 것으로 나타났다. 또한, Akt1도 인슐린에 의해 증가된 발현량이 GBE 농도에 따라 감소하는 것으로 나타났다.
인삼은 건강에 효과적인 약초라고 알려져 왔다. 인삼의 열매인 진생베리는 인삼의 주성분과 비슷한 ginsenoside, saponin, polyphenol, polyacetylene, alkaloid 등의 성분을 포함한다. 본 연구의 목적은 인삼과 같이 진생베리 열수 추출물(Ginseng berry water extract, GBE)이 당뇨와 연관된 세포 외 효소와 인슐린 신호전달 경로에 있는 분자의 발현에 어떤 효과를 가지고 있는지를 조사하였다. ${\alpha}$-Amylase와 ${\alpha}$-glucosidase는 섭취한 다당분자를 분해하여 포도당을 생성함으로 항당뇨 약물개발의 표적 효소이다. GBE에 의한 두 효소의 활성 억제능을 in vitro에서 측정하였으나 최고 $1,000{\mu}g/ml$ 농도에서도 효소활성 억제능이 나타나지 않았다. 인슐린 신호전달 경로의 영향을 확인하기 위해서 HepG2 세포에서 GBE에 의한 인슐린 신호전달 경로의 주요 단백질인 protein-tyrosine phosphatase 1B (PTP1B)와 Akt1의 발현수준 변화를 Western blot 방법으로 조사하였다. 이때 인슐린에 의한 이들 분자의 변화에 GBE가 영향을 주는 것으로 나타났다. PTP1B는 인슐린에 의해 증가된 발현량이 저농도의 GBE이 의해 더욱 증가하였으나, $200{\mu}g/ml$ 농도의 GBE에 의해서는 다소 감소하는 것으로 나타났다. 또한, Akt1도 인슐린에 의해 증가된 발현량이 GBE 농도에 따라 감소하는 것으로 나타났다.
Ginseng has been known to be highly effective for health as a traditional medicinal herb. Ginseng berry, or fruit of ginseng, contains ginsenoside, saponin, polyphenol, polyacetylene, alkaloid, etc. as the main compounds as does ginseng. The aim of this study is to evaluate any effect of ginseng ber...
Ginseng has been known to be highly effective for health as a traditional medicinal herb. Ginseng berry, or fruit of ginseng, contains ginsenoside, saponin, polyphenol, polyacetylene, alkaloid, etc. as the main compounds as does ginseng. The aim of this study is to evaluate any effect of ginseng berry water extract (GBE) on diabetic-associated molecules, such as enzymes, which are responsible for the glucose entry of the cells and the insulin receptor signaling molecules using HepG2 cells. Therefore, two enzymes, ${\alpha}$-amylase and ${\alpha}$-glucosidase, were selected and assayed for their activities in the presence of GBE in vitro. These two enzymes are responsible for producing glucose from dietary starch. Protein-tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) and Akt1 are key proteins in the insulin receptor signaling pathway. These two intracellular signaling molecules were investigated for their expression levels in HepG2 cells after insulin and GBE treatment. GBE, at concentrations up to $1,000{\mu}g/ml$, did not exert any inhibitory effect on ${\alpha}$-amylase and ${\alpha}$-glucosidase. It was observed that the expression level of PTP1B was increased by insulin and the $25{\mu}g/ml$ GBE treatment enhanced the PTP1B level. However, GBE at a concentration of $200{\mu}g/ml$ reduced the expression level of PTP1B. In the case of Akt1, the Akt1 level by insulin was decreased by GBE treatment. These data suggest that the water extracts of ginseng berry have an influence on intracellular signaling by insulin.
Ginseng has been known to be highly effective for health as a traditional medicinal herb. Ginseng berry, or fruit of ginseng, contains ginsenoside, saponin, polyphenol, polyacetylene, alkaloid, etc. as the main compounds as does ginseng. The aim of this study is to evaluate any effect of ginseng berry water extract (GBE) on diabetic-associated molecules, such as enzymes, which are responsible for the glucose entry of the cells and the insulin receptor signaling molecules using HepG2 cells. Therefore, two enzymes, ${\alpha}$-amylase and ${\alpha}$-glucosidase, were selected and assayed for their activities in the presence of GBE in vitro. These two enzymes are responsible for producing glucose from dietary starch. Protein-tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) and Akt1 are key proteins in the insulin receptor signaling pathway. These two intracellular signaling molecules were investigated for their expression levels in HepG2 cells after insulin and GBE treatment. GBE, at concentrations up to $1,000{\mu}g/ml$, did not exert any inhibitory effect on ${\alpha}$-amylase and ${\alpha}$-glucosidase. It was observed that the expression level of PTP1B was increased by insulin and the $25{\mu}g/ml$ GBE treatment enhanced the PTP1B level. However, GBE at a concentration of $200{\mu}g/ml$ reduced the expression level of PTP1B. In the case of Akt1, the Akt1 level by insulin was decreased by GBE treatment. These data suggest that the water extracts of ginseng berry have an influence on intracellular signaling by insulin.
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문제 정의
간(Liver)은 췌장에서 분비된 인슐린의 중요한 표적 장기로서 인슐린에 의해 혈액 내 포도당을 흡수하여 glycogen으로 저장을 한다. 따라서, 간 유래 세포인 HepG2를 이용하여 GBE의 인슐린 신호전달의 영향을 알아보기 위해 우선적으로 HepG2 cell에 대한 GBE의 세포독성을 MTT assay로 조사하였다. Fig.
최근 인삼 열매의 항당뇨 연구에서 in vivo 인슐린의 농도 등이 향상되는 결과가 나타났으나 표적분자에 대한 결과는 없었다[16]. 본 연구는 인삼 열매의 기능성을 당뇨와 관련된 세포 외 및 내 분자에 어떤 영향을 미치는 가를 in vitro 모델에서 조사하였다. 본 연구에서 인산 열매의 추출은 물을 사용하였다.
인삼열매를 이용한 항당뇨에 대한 연구는 현재 몇몇 연구가 보고되어 있으나 아직까지는 활발하지 못하다. 본 연구는 인삼열매의 추출물이 당뇨와 관련된 효소와 인슐린 신호전달물질에 어떤 영향을 주는가에 대한 결과를 보고하고자 한다.
본 연구에서는 이러한 역할을 하는 α-glucosidase와 α-amylase 효소 활성에 대한 GBE의 저해효과를 조사하기 위해 α-amylase와 α-glucosidase 활성저해 실험을 실시하였다.
Akt1은 인슐린 반응과 생육인자 반응에 모두 관여하는 신호전달의 교차점 분자로서 기능성 및 중요성이 복잡한 분자이다[8]. 본 연구에서는 인슐린 신호전달에 중요한 이들 PTP1B와 Akt1의 단백질 발현 수준을 조사하기 위하여 Western blot을 수행하였다. Fig.
제안 방법
α-Glucosidase 저해활성은 nitrophenol 분석법을 응용하여 측정하였다.
10 nM 인슐린 또는 10 nM 인슐린과 GBE 농도 별 시료를 처리한 HepG2 세포에 세포용해 완충용액(50 mM Tris–HCl, pH 7.5, 0.4% Nonidet P-40, 120 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 80 μg/ml leupeptin, 3 mM NaF and 1 mM DTT)을 첨가하여 4℃에서 30 분 동안 처리하였다.
Western blot의 각 band는 LAS3000®image analyzer (Fuji film Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다.
그 다음 10% skim milk를 nitrocellulose membrane에 전처리하고 목적 단백질에 대한 1차 항체 anti-PTP1B, anti-Akt1, anti-beta-actin (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, USA)을 처리한 다음, 2차 항체 처리 후, chemiluminescent ECL kit (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, USA)를 사용하여 목적 단백질을 검출하였다.
인삼열매 추출물을 제조하기 위해 한국인삼열매공사(대전광역시)에서 구매한 4-5년생 생(生)인삼 열매에서 분리한 종자를 60℃에서 24시간 건조 한 후 총량에 대하여 10배의 물을 가하여 75℃에서 9시간 동안 열수 추출한 다음 여과하였다. 여과한 추출액(Ginseng berry extract, GBE)을 동결건조 과정을 거쳐 파우더로 생산하여 물에 일정한 농도로 희석하여 실험에 사용하였다.
대상 데이터
HepG2 cell line은 ATCC (American Type Culture Collection, USA)로부터 구입하였고, α-amylase, α-glucosidase, MTT reagent, agarose 등의 시약은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.
본 연구는 인삼 열매의 기능성을 당뇨와 관련된 세포 외 및 내 분자에 어떤 영향을 미치는 가를 in vitro 모델에서 조사하였다. 본 연구에서 인산 열매의 추출은 물을 사용하였다. 열수 추출물(GBE) 내에 함유된 gensenoside를 HPLC로 분석하였을 때 Rd와 Rg3가 존재하는 것을 확인하였고, Rd의 함유량이 월등히 높게 나타났다(Fig.
인삼열매 추출물을 제조하기 위해 한국인삼열매공사(대전광역시)에서 구매한 4-5년생 생(生)인삼 열매에서 분리한 종자를 60℃에서 24시간 건조 한 후 총량에 대하여 10배의 물을 가하여 75℃에서 9시간 동안 열수 추출한 다음 여과하였다. 여과한 추출액(Ginseng berry extract, GBE)을 동결건조 과정을 거쳐 파우더로 생산하여 물에 일정한 농도로 희석하여 실험에 사용하였다.
데이터처리
각 시료 농도군에 대한 유의검정은 대조군과 비교하여 Student’s t test 한 후 통계적 유의성을 얻었다.
각 실험은 3회 반복실험을 통하여 얻은 결과를 각각의 시료 농도에 대해 평균±표준편차로 나타내었다.
이론/모형
HepG2 세포는 5% CO2 및 37℃에서 95% 이상의 습도를 유지한 배양기에서 10% fetal bovine serum, 2 mM glutamine과 100 μg/ml penicillin-streptomycin을 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였다. HepG2 세포에 대한 GBE의 세포독성을 Hansen, et al [7]의 방법에 따라 MTT (3-(4,5-dimethyl-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 이용하여 측정하였다.
성능/효과
Fig. 2에서 보는 바와 같이 GBE는 양성대조군인 acarbose와 비교하여 α-amylase와 α-glucosidase 모두에서 효소활성 저해효과가 없는 것으로 나타났다.
Fig. 3에서 나타내는 바와 같이 25 μg/ml 저농도에서는 인슐린의 작용 PTP1B의 발현을 증가시켰으나, 고농도인 200μg/ml에서는 인슐린의 작용을 억제하여 PTP1B의 발현이 감소한 것으로 나타났다(Fig. 3B).
3B). 비록 in vitro 실험의 한계는 있지만 PTP1B의 발현에 GBE가 영향을 준다는 것을 확인하였다. Akt1는 IR를 통한 신호전달 경로의 중간 분자로서 인슐린에 의한 신호전달에 아주 중요한 분자이다.
Akt1는 IR를 통한 신호전달 경로의 중간 분자로서 인슐린에 의한 신호전달에 아주 중요한 분자이다. 실험에 사용된 HepG2 세포에 인슐린을 24시간 처리하였을 때 Akt1 단백질 발현은 약 11% 증가하였으나 GBE와 함께 처리한 경우에는 Akt1 단백질발현은 저농도의 GBE에 의해서도 감소하는 것으로 나타났다(Fig. 3C). 이러한 데이터는 GBE가 α-amylase와 α-glucosidase 효소를 억제하지 못하지만 인슐린에 의한 신호전달과정에 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다.
본 연구에서 인산 열매의 추출은 물을 사용하였다. 열수 추출물(GBE) 내에 함유된 gensenoside를 HPLC로 분석하였을 때 Rd와 Rg3가 존재하는 것을 확인하였고, Rd의 함유량이 월등히 높게 나타났다(Fig. 1). 이런 Rd와 Rg3의 양적인 차이 결과는 앞서 보고된 것과 유사하였으나, 다른 종류의 gensenoside는 검출되지 않은 것은 추출용매가 물이어서 70% 에탄올 추출에서 검출되는 gensenoside profile과는 차이가 있었다[16].
이러한 데이터는 GBE가 α-amylase와 α-glucosidase 효소를 억제하지 못하지만 인슐린에 의한 신호전달과정에 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
당뇨란 무엇인가?
인체는 해당과정 및 당 신생 과정을 통해 체내 혈당을 일정하게 유지하여 정상적인 대사활동을 할 수 있게 한다[1]. 이러한 과정이 정상적으로 이루어지지 않고 혈당조절이 제대로 유지되지 않는 것을 당뇨라 한다. 당뇨는 신장 기능의 저하, 동맥경화, 망막 출혈로 인해 시력 저하, 말초신경병증 등 다양한 합병증을 유발하기 때문에 더욱 위험한 질병으로 알려져있다[3, 5].
당료치료제로 PTP1B억제를 target으로 한 연구가 진행되는 이유는 기존 당료치료제가 어떤 한계점을 가지고 있기 때문인가?
현재까지의 항당뇨 연구는 주로 α-glucosidase와 α-amylase 효소활성의 억제에 초점을 맞추었으며, 이들 효소의 억제물질 중 잘 알려진 대표적인 성분으로는 acarbose와 voglibose 등이 보고 되었다[21]. 하지만 인슐린 저항성에 대한 이러한 acarbose와 같은 당뇨치료제들은 설사 및 복부팽만감등의 부작용이 보고되고 있어 안정성등의 이유로 사용이 제한되고 있는 실정이다. 최근의 연구는 좀더 안정적인 PTP1B억제를 target으로 한 연구가 진행되고 있다[11].
2형당뇨가 유발되는 원인은?
당뇨는 원인에 따라 크게 insulin 의존성 당뇨인 1형과 insulin 비 의존성 당뇨인 2형으로 나뉜다. 그 중에 전체 당뇨의 90%에 해당하는 2형당뇨는 간, 근육, 지방조직에서 insulin에 대한 저항성으로 인해 insulin 작용이 정상적으로 작동하지 않아 고혈당이 지속되어 유발된다[19]. 또한, vitamin A 수송 단백질인 retinol-binding protein 4의 혈액 내 증가가 실험동물과 사람에게서 전신적인 인슐린 저항성을 유발하는 요인이 될 수 있다는 보고는 당뇨병 유발이 다양한 원인에 의해서 일어날 수 있음을 제시하고 있다[22].
참고문헌 (24)
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