[국내논문]Murine Macrophage RAW 264.7 세포에서 구실잣밤나무 추출물의 항염증 효과 Anti-inflammatory Effect of Castanopsis cuspidata Extracts in Murine Macrophage RAW 264.7 Cells원문보기
본 연구는 구실잣밤나무(C. cuspidate) 잎 추출물의 항염증 활성이 염증성 매개인자 생성 저해 및 염증성 사이토카인의 억제와 관련이 있을 것으로 예상되어짐에 따라, 구실잣밤나무를 대상으로 80% 에탄올를 가지고 추출한 후 추출물을 극성에 따라 순차적으로 용매분획을 실시하여, 구실잣밤나무 80% 에탄올 추출물 및 용매분획물들이 염증반응의 주체가 되는 대식세포 계열인 RAW 264.7 세포에서 LPS로 유도된 NO의 생성억제효과, 그리고 iNOS와 COX-2의 mRNA와 단백질 발현 억제효과 및 IL-6와 IL-$1{\beta}$와 같은 염증성 사이토카인 생성 억제효과 등을 알아보았다. 대식세포 계열인 RAW 264.7 세포에 LPS로 자극을 주고 구실잣밤나무 80% 에탄올 추출물 및 분획물을 처리하여 확인해본 결과, 헥산, 디클로로메탄 및 에틸아세테이트 분획물에서 NO의 생성억제 효과가 강하게 나타났으며, 헥산과 디클로로메탄 분획물에서는 iNOS와 COX-2 생성 억제 효과가 다른 분획물에 비해 강하게 나타났으며 염증성 사이토카인 생성 억제 효능도 80% 에탄올 추출물 및 분획물들이 다소 차이는 있었지만 헥산과 디클로로메탄 분획물에서 IL-6와 IL-$1{\beta}$에서 생성억제 효과가 나타났다. 이러한 결과는 구실잣밤나무 잎에서 유효성분 추출을 통한 항염증 물질의 연구 또는 예방하거나 치료할 수 있는 염증 억제 성분의 분리 및 그 작용기전 연구에 중요한 기초 자료가 될 것이라 사료된다. 또한 구실잣밤나무 추출물로부터 염증억제 성분을 도출하고자 활성분획인 디클로로 메탄 분획물에 대하여 활성성분의 분리가 진행 중이다.
본 연구는 구실잣밤나무(C. cuspidate) 잎 추출물의 항염증 활성이 염증성 매개인자 생성 저해 및 염증성 사이토카인의 억제와 관련이 있을 것으로 예상되어짐에 따라, 구실잣밤나무를 대상으로 80% 에탄올를 가지고 추출한 후 추출물을 극성에 따라 순차적으로 용매분획을 실시하여, 구실잣밤나무 80% 에탄올 추출물 및 용매분획물들이 염증반응의 주체가 되는 대식세포 계열인 RAW 264.7 세포에서 LPS로 유도된 NO의 생성억제효과, 그리고 iNOS와 COX-2의 mRNA와 단백질 발현 억제효과 및 IL-6와 IL-$1{\beta}$와 같은 염증성 사이토카인 생성 억제효과 등을 알아보았다. 대식세포 계열인 RAW 264.7 세포에 LPS로 자극을 주고 구실잣밤나무 80% 에탄올 추출물 및 분획물을 처리하여 확인해본 결과, 헥산, 디클로로메탄 및 에틸아세테이트 분획물에서 NO의 생성억제 효과가 강하게 나타났으며, 헥산과 디클로로메탄 분획물에서는 iNOS와 COX-2 생성 억제 효과가 다른 분획물에 비해 강하게 나타났으며 염증성 사이토카인 생성 억제 효능도 80% 에탄올 추출물 및 분획물들이 다소 차이는 있었지만 헥산과 디클로로메탄 분획물에서 IL-6와 IL-$1{\beta}$에서 생성억제 효과가 나타났다. 이러한 결과는 구실잣밤나무 잎에서 유효성분 추출을 통한 항염증 물질의 연구 또는 예방하거나 치료할 수 있는 염증 억제 성분의 분리 및 그 작용기전 연구에 중요한 기초 자료가 될 것이라 사료된다. 또한 구실잣밤나무 추출물로부터 염증억제 성분을 도출하고자 활성분획인 디클로로 메탄 분획물에 대하여 활성성분의 분리가 진행 중이다.
This study describes a preliminary evaluation of the anti-inflammatory activity of Castanopsis cuspidata extracts. C. cuspidata was extracted using 80% ethanol and then fractionated sequentially with n-hexane, dichloromethane, ethylacetate, and butanol. To screen for anti-inflammatory agents effecti...
This study describes a preliminary evaluation of the anti-inflammatory activity of Castanopsis cuspidata extracts. C. cuspidata was extracted using 80% ethanol and then fractionated sequentially with n-hexane, dichloromethane, ethylacetate, and butanol. To screen for anti-inflammatory agents effectively, we first examined the inhibitory effect of the C. cuspidata extracts on the production of pro-inflammatory factors and cytokines stimulated with lipopolysaccharide. In addition, we examined the inhibitory effect of C. cuspidata extracts on pro-inflammatory mediators (NO, iNOS, COX-2) in murine macrophage RAW 264.7 cells. The amounts of protein levels were determined by immunoblotting. Of the sequential solvent fractions of C. cuspidata, the n-hexane, dichloromethane and ethylacetate fractions inhibited the mRNA expression of pro-inflammatory cytokines (IL-$1{\beta}$ and IL-6), production of NO, and the protein level of iNOS and COX-2. These results suggest that C. cuspidata may have significant effects on inflammatory factors and may be provided as a possible anti-inflammatory therapeutic plant.
This study describes a preliminary evaluation of the anti-inflammatory activity of Castanopsis cuspidata extracts. C. cuspidata was extracted using 80% ethanol and then fractionated sequentially with n-hexane, dichloromethane, ethylacetate, and butanol. To screen for anti-inflammatory agents effectively, we first examined the inhibitory effect of the C. cuspidata extracts on the production of pro-inflammatory factors and cytokines stimulated with lipopolysaccharide. In addition, we examined the inhibitory effect of C. cuspidata extracts on pro-inflammatory mediators (NO, iNOS, COX-2) in murine macrophage RAW 264.7 cells. The amounts of protein levels were determined by immunoblotting. Of the sequential solvent fractions of C. cuspidata, the n-hexane, dichloromethane and ethylacetate fractions inhibited the mRNA expression of pro-inflammatory cytokines (IL-$1{\beta}$ and IL-6), production of NO, and the protein level of iNOS and COX-2. These results suggest that C. cuspidata may have significant effects on inflammatory factors and may be provided as a possible anti-inflammatory therapeutic plant.
, 2010). 본 연구에서는 자원 식물로서 활용가치가 높은 구실잣밤나무 잎 추출물을 대상으로 염증성 질환의 예방 및 치료제 개발의 기초자료로 사용 될 수 있는지 탐색하기 위해 기능성을 밝히고자 극성에 따라 순차적으로 용매 분획하여 추출물 및 분획물을 가지고 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에서 염증성 매개인자인 NO의 생성억제 효과 및 iNOS 그리고 COX-2 생성 억제 효능 및 염증성 cytokine 인 IL-1β와 IL-6의 억제 효과를 조사하였다.
제안 방법
구실잣밤나무 잎 에탄올 추출물 및 순차적 분획물의 제조는 80% 에탄올(EtOH) 및 분획용 헥산(n-hexane), 디클로로메탄 (CH2Cl2), 에틸아세테이트(EtOAc) 그리고 부탄올(BuOH)을 사용하여 용매의 극성을 이용한 순차적 추출법을 사용하였다. 즉 분말 건조된 시료 500 g에 80% 에탄올로 2회 반복 추출한 후 여과하여 얻어진 추출액을 감압 농축하여 동결건조기로 완전히 건조시켰다.
RAW 264.7 세포에 LPS (1 ㎍/㎖)를 사용하여 iNOS와 COX-2의 생성을 유도한 후 구실잣밤나무 잎 추출물과 분획물을 100㎍/㎖ 농도로 처리하여 iNOS와 COX-2의 mRNA 발현 억제 정도를 확인 하였다. 그 결과, iNOS와 COX-2의 단백질 발현 양상과 마찬가지로 헥산, 디클로로메탄 분획물에서 대조군인 LPS 단독 처리군에 비해 mRNA 발현 억제 효과를 나타내었다(Fig.
대상 데이터
제주도 하천 일대에 자생하고 있는 구실잣밤나무(Castanopsis cuspidata) 잎을 2013년 9월경에 채집하였으며, 채집된 시료는 증류수로 2～3회 수세한 뒤 물기를 제거한 뒤 2주간 음건한 후 마쇄기로 분쇄하여 추출용 시료로 사용하였다.
대식세포 계열(Murine macrophage cell line)인 RAW 264.7세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하여 10% fetal bovine serum (FBS)와 penicillin-streptomycin 100 units/100 ㎍/㎖이 함유된 DMEM 배지(GIBCO, Grand Island, NY, USA)를 사용하여 37°C, 5% CO2 항온기에서 배양하였으며, 3일에 한 번씩 계대배양을 시행하였다.
데이터처리
모든 실험은 3회 이상 반복으로 이루어졌으며, 실험결과는각 항목에 따라 평균치 ± 표준편차(SD)를 구하여 신뢰수준 95%(p<0.05)에서 통계적 유의차를 평가하였다.
이론/모형
2). RAW 264.7 세포에 LPS (1 ㎍/㎖)를 사용하여 iNOS의 생성을 유도한 후 큰비쑥 추출물과 분획물을 50 ㎍/㎖ 농도로 처리하여 iNOS 발현을 immunoblotting를 통해 확인하였다. 그 결과 immunoblotting에 의한 iNOS와 COX-2의 단백질 생성은 헥산과 디클로로메탄 분획물에서 대조군인 LPS 단독 처리군에 비해 강한 억제 효과를 나타내었다(Fig.
성능/효과
생성된 NO 양을 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO2-의 형태로 측정하였다. 그 결과 80% 에탄올 추출물, 헥산과 디클로로메탄 분획물에서 대조군인 LPS 단독처리군에 비해 높은 NO 생성 억제효과를 관찰할 수있었다(Table 2, Fig. 1). 특히 디클로로메탄 분획물인 경우 50㎍/㎖의 농도에서도 세포독성 효과도 보이지 않으면서 우수한 NO 생성 억제효과를 보였다.
7 세포에 LPS (1 ㎍/㎖)를 사용하여 iNOS의 생성을 유도한 후 큰비쑥 추출물과 분획물을 50 ㎍/㎖ 농도로 처리하여 iNOS 발현을 immunoblotting를 통해 확인하였다. 그 결과 immunoblotting에 의한 iNOS와 COX-2의 단백질 생성은 헥산과 디클로로메탄 분획물에서 대조군인 LPS 단독 처리군에 비해 강한 억제 효과를 나타내었다(Fig. 3). 본 연구 결과, NO 생성 억제 효과와 초기-염증성 인자 생성 억제 효과가 가장 우수한 디클로로메탄 분획물이 iNOS의 발현 또한 강하게 억제시키는 걸로 보아 NO의 생성 억제 기전은 iNOS 발현 억제를 통해 이루어진 것으로 여겨진다.
, 2009). 대식세포인 RAW 264.7 세포로부터 pro- inflammatory cytokine의 mRNA 발현 정도를 RT-PCR를 통해 확인 한 결과, LPS 자극과 함께 처리하여 IL-6와 IL-1β 생성 억제에 대한 구실잣밤나무 추출물 및 용매분획물을 100 ㎍/㎖ 농도로 처리하였을 때, IL-6 생성 억제는 80% 에탄올 추출물, 디클로로메탄과 에틸아세테이트 분획물에서 억제 효과가 나타났으며, IL-1β 생성 억제는 80% 에탄올 추출물과 디클로로메탄 분획물에서 억제 효과를 나타내었다(Fig. 4).
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
염증반응이 지속될 경우 악영향은?
, 2006). 그러나 지속적인 염증반응은 도리어 점막손상을 촉진하고, 그 결과 일부에서는 암 발생 등의 질환을 이끈다(Yoon et al., 2010; Nam et al, 2013).
pro-inflammatory cytokine 형성 이후의 염증반응 기작은?
, 2006; Kim and Moudgil, 2008). 또한 이러한 염증매개 물질의 형성은 phospholipase A2의 활성으로 인해 arachidonic acid가 prostaglandin으로 바뀌는 과정 및 NO형성 과정으로 이어지게 된다(McDaniel et al., 1996; Park et al, 2014).
염증반응이란?
염증반응은 생체나 조직에 물리적 작용이나 화학적 물질, 세균감염 등의 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습이 가해질 때 그 손상부위를 수복 재생하려는 기전이며, 일단 자극이 가해지면 국소적으로 histamine, serotonine, bradykinin, prostaglandins (PGs), hydroxyeicosatetraenoic acid (HETE), leukotriene과 같은 혈관 활성 물질이 유리되어 혈관 투과성이 증대되면서 염증을 유발한다(Tizard et al., 1986; Lee et al.
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