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문제 정의
- 이러한 매스틱 검의 위장 보호 효과에 대한 연구 결과를 바탕으로, 매스틱 검이 알코올로 유도한 위 손상에 대한 위산 분비 억제 및 위장 점막 보호 효과를 나타낼 수 있을 것으로 기대된다. 그러나 매스틱 검을 이용한 위장 점막의 손상과 관련된 메커니즘 규명 연구가 미미한 실정이며, 따라서 본 연구에서는 매스틱 검의 투여가 알코올 처리로 유도된 위점막 손상 동물모델에서 위액 분비, 위 점막 손상, 위산 분비 촉진 인자 발현 변화에 미치는 영향을 관찰하고, 매스틱 검의 처리에 따라 parietal cell에서 관련 수용체 발현 및 cAMP 농도 변화를 관찰하여 매스틱 검의 위산 분비 억제를 통한 위장 보호 기전을 확인하고자 하였다.
- 본 연구는 위 벽세포 in vitro 실험모델과 알코올로 위를 자극한 in vivo 실험모델을 이용하여 매스틱 검의 위산 분비 억제 및 위장 점막 보호 효과를 확인하고자 하였다. 위 조직의 병리학적인 관찰을 통하여 효과를 관찰한 결과 알코올로 위를 자극한 군에서 위 점막 조직의 손상과 표면 상피세포의 손실을 관찰할 수 있었으나, 매스틱 검 50 및 100 mg/kg 투여한 군에서 모두 control 그룹과 비교했을 때 손상이 회복되었음을 확인할 수 있었다.
제안 방법
- 70% 알코올에 150 mM HCl을 첨가하여 1 mL씩 경구 투여한 다음 1시간 뒤 희생시킨 후 개복하여 방혈한 다음 위를 적출하였다. 적출한 위는 대만부를 따라 절개한 후 식염수에 씻어 면봉으로 잘 펴서 핀으로 고정한 뒤 사진 촬영을 하였다.
- 25% trypsin-EDTA로 세포를 수집하여 RN-easy extraction kit(QIAGEN, Germantown, MD, USA)로 제조사의 manual에 따라 total RNA를 추출하고 cDNA의 합성을 위해 iScript Select cDNA Synthesis Kit(BIO- RAD)을 이용하여 5 μg의 total RNA에 5×iScript select reaction mix를 4 μL, Oligo(dT) Primer set 2 μL(Table 1), RNA sample 5 μL, Nuclease-Free Water 8 μL를 각각 넣고 마지막에 iScript Reverse Transcriptase 1 μL를 넣어 pipette으로 up & down 하여 골고루 섞어주었다. 95℃ 에서 10분간 hot start 한 후 95℃에서 15초, 60℃에서 15초, 72℃에서 15초간 35 cycling으로 PCR을 수행한 후 마지막으로 95℃에서 15초, 60℃에서 1분, 95℃ 15초간 polishing step을 거쳐 PCR 분석을 시행하였다. 반응에 사용한 primer는 Table 1에 제시하였다.
- 적출한 실험동물의 위에서 점막 부분을 분리한 뒤 수거하여 RNeasy extraction kit(QIAGEN, Germantown, MD, USA)로 제조사의 manual에 따라 total RNA를 추출하고 cDNA의 합성을 위해 iScript Select cDNA Synthesis Kit(BIO-RAD, Singapore, Singapore)을 이용하여 5 μg의 total RNA에 5×iScript select reaction mix를 4 μL, Oligo(dT) Primer set 2 μL(Table 1), RNA sample 5 μL, Nuclease-Free Water 8 μL를 각각 넣고 마지막에 iScript Reverse Transcriptase 1 μL를 넣어 pipette으로 up & down 하여 골고루 섞어주었다. 95℃에서 10분간 hot start 한 후 95℃에서 15초간, 60℃에서 15초, 72℃에서 15초간 35 cycling으로 PCR을 수행한 후 마지막으로 95℃에서 15초, 60℃에서 1분, 95℃ 15초 polishing step을 거쳐 PCR 분석을 시행하였다. 반응에 사용한 primer는 Table 1에 제시하였다.
- 먼저 250 g 내외의 7주령 SD rat 수컷을 경추 탈골하여 70% 알코올로 피부를 소독하여 절개한 후 위 조직을 분리하였고, 이후 위 조직은 phosphate buffer saline(Hyclone Laboratories, Logan, UT, USA) 용액에서 보관하여 clean bench로 옮긴 후 phosphate buffer saline 용액에서 1회 세척하였다. DMEM(Hyclone Laboratories)에 20 mM HEPES와 5 M cimetidine을 첨가하고, collagenase(Worthington type 4) 1 mg/mL와 BSA 1 mg/mL 농도로 첨가하여 30분간 37℃에서 보관하였다. 이렇게 얻어진 세포 부유액을 nylon mesh(0.
- Histamine으로 자극한 위 벽세포에서 매스틱 검 처리에 따른 cAMP 농도 변화량과 그에 따른 H+/K+ ATPase 발현량 변화를 측정하였다. 먼저 세포 수준에서 cAMP level을 측정한 결과, vehicle 처리군 74.
- Histamine으로 자극한 위 벽세포에서 매스틱 검 처리에 따른 위산 분비 관련 유전자 발현의 변화량을 측정하였다. 먼저 CCK2r의 유전자 발현 변화량에서는 vehicle 처리군 0.
- Matrigel plate에서 배양한 세포를 24시간 동안 안정화시킨 후, 매스틱 검을 histamine 0.1 mM과 함께 30분 동안 처리한 후 0.25% trypsin-EDTA로 세포를 수집하여 RN-easy extraction kit(QIAGEN, Germantown, MD, USA)로 제조사의 manual에 따라 total RNA를 추출하고 cDNA의 합성을 위해 iScript Select cDNA Synthesis Kit(BIO- RAD)을 이용하여 5 μg의 total RNA에 5×iScript select reaction mix를 4 μL, Oligo(dT) Primer set 2 μL(Table 1), RNA sample 5 μL, Nuclease-Free Water 8 μL를 각각 넣고 마지막에 iScript Reverse Transcriptase 1 μL를 넣어 pipette으로 up & down 하여 골고루 섞어주었다.
- 군 분리는 정상 대조군(Vehicle), 알코올성 위 자극 시험대조군(Control), 매스틱 검(MG) 50 mg/kg 투여군(MG50), 매스틱 검 100 mg/kg 투여군(MG100)의 총 4군으로 군당 SD rat 8마리씩 구성하여 실험을 진행하였다. Vehicle 그룹은 0.5% CMC를, control 그룹은 0.5% CMC와 40% 에탄올을, MG50과 MG100 그룹은 7일 동안 시험물질과 40% 에탄올을 1 mL씩 경구 투여하여 위를 자극시켰다. 실험 24시간 이전에 모든 식이공급을 중단하여 위를 비우도록 하였으며 실험 당일에 70% 알코올에 150 mM HCl을 첨가하여1 mL씩 경구 투여한 후 1시간 뒤 희생시켰다.
- 군 분리는 정상 대조군(Vehicle), 알코올성 위 자극 시험대조군(Control), 매스틱 검(MG) 50 mg/kg 투여군(MG50), 매스틱 검 100 mg/kg 투여군(MG100)의 총 4군으로 군당 SD rat 8마리씩 구성하여 실험을 진행하였다. Vehicle 그룹은 0.
- 동물에서 매스틱 검 투여에 따른 histamine 저해활성을 측정하기 위해 실험동물에서 분리한 plasma를 이용하여 histamine을 측정하였다. 측정을 위해 SPI-BIO(New South Wales, Australia)의 histamine enzyme immunoassay kit(Bertin Pharma, Bretonneux, France)을 이용하여 SPI-BIO의 protocol을 따라서 실험을 하였으며, ELISA reader(Molecular Devices, Seoul, Korea)를 이용하여 측정하였다.
- 1B). 매스틱 검을 투여한 그룹(MG50, 100)에서 control 그룹에 비하여 위 점막 손상과 출혈이 감소하였음을 관찰하였다(Fig. 1A). 위 손상 면적은 매스틱 검 50 mg/kg 투여한 MG50 그룹에서 6.
- 위 벽세포 분리를 위한 실험동물은 Nakada 등(24)의 방법에 의해 수행하였다. 먼저 250 g 내외의 7주령 SD rat 수컷을 경추 탈골하여 70% 알코올로 피부를 소독하여 절개한 후 위 조직을 분리하였고, 이후 위 조직은 phosphate buffer saline(Hyclone Laboratories, Logan, UT, USA) 용액에서 보관하여 clean bench로 옮긴 후 phosphate buffer saline 용액에서 1회 세척하였다. DMEM(Hyclone Laboratories)에 20 mM HEPES와 5 M cimetidine을 첨가하고, collagenase(Worthington type 4) 1 mg/mL와 BSA 1 mg/mL 농도로 첨가하여 30분간 37℃에서 보관하였다.
- 키오스 매스틱 검(Chios mastic gum: manufactured by The Chios Gum Mastic Growers Association)은 (주)진용(수원, 한국)으로부터 분말형태로 공급받아 실험에 사용하였다. 세포 실험을 위한 실험재료의 준비는 분말형태의 매스틱 검을 0.2% ethanol(Merk, Darmstadt, Germany)에 녹여 사용하였으며, 동물실험에 사용된 매스틱 검은 CMC 0.5% 용액에 분말 그대로 첨가 후 용해하여 사용하도록 하였다.
- 사육환경은 온도 23±3℃, 습도 50±5%에서 light cycle은 12시간으로 유지하였다. 순화기간 중 건강하다고 판정된 동물에 대하여 체중을 측정하고 평균체중에 가까운 개체를 선택하여 무작위법을 이용하여 군 분리를 실시하였다.
- 위산 분비와 관련된 다른 수용체의 발현을 확인하기 위해 위염이 유발된 실험동물의 위 점막 조직에서 유전자 발현 정도를 비교하였다. 그 결과 알코올로 위를 자극한 동물의 위 조직의 CCK2r 및 H+/K+ ATPase의 발현 정도가 정상대조군에 비하여 유의적으로 높아져 알코올에 의한 위 점막의 손상에 영향을 준 것을 확인하였다.
- 위장 점막에 손상을 주는 위액 분비와 관련된 인자인 histamine과 그로 인해 영향을 받는 H2 수용체 유전자의 발현 변화량을 확인하였다. 먼저 histamine의 경우 vehicle 처리 군에 비해 control 그룹에서 3.
- 이렇게 분리된 세포는 Complete Medium[DMEM/F-12(GIBCO-BRL, Grand Island, NY, USA), 20 mM HEPES, 0.2% BSA, 10 mM glucose, 1 insulin-transferrin-selenium-A(GIBCO), 1 mM glutamine, 100 U/mL penicillin/streptomycin, 400μg/mL gentamicin sulfate, 15 mg/mL geneticin, pH 7.4]을 첨가하여 다시 1,600 rpm으로 10분간 원심분리 하였다.
- 또한 이러한 자극이 위산 분비를 더욱 증가시키고 위 내부 pH 증가와 위산에 의한 위장 점막의 손상을 심화시키는 것으로 알려져 있다(20,21). 이번 연구에서 알코올로 위를 자극한 동물의 위산 분비와 위 점막 조직 손상에 매스틱 검 투여에 대한 효과를 확인하기 위하여 위 점막 조직의 형태학적, 병리학적 변화, 위산 분비량 및 위액의 산도를 측정하였다. 실험 결과, 알코올로 위를 자극한 동물의 위 점막 조직이 현저히 손상되어 ulcer index(손상 면적)가 유의적으로 증가한 것으로 나타났으며, 위액 분비량 및 위액 산도 역시 유의적으로 높아진 것으로 나타나 알코올의 영향으로 위액 분비 증가와 위 점막 조직 손상이 심화된 것을 확인할 수 있었다.
- 적출한 실험동물의 위에서 점막 부분을 분리한 뒤 수거하여 RNeasy extraction kit(QIAGEN, Germantown, MD, USA)로 제조사의 manual에 따라 total RNA를 추출하고 cDNA의 합성을 위해 iScript Select cDNA Synthesis Kit(BIO-RAD, Singapore, Singapore)을 이용하여 5 μg의 total RNA에 5×iScript select reaction mix를 4 μL, Oligo(dT) Primer set 2 μL(Table 1), RNA sample 5 μL, Nuclease-Free Water 8 μL를 각각 넣고 마지막에 iScript Reverse Transcriptase 1 μL를 넣어 pipette으로 up & down 하여 골고루 섞어주었다.
- 70% 알코올에 150 mM HCl을 첨가하여 1 mL씩 경구 투여한 다음 1시간 뒤 희생시킨 후 개복하여 방혈한 다음 위를 적출하였다. 적출한 위는 대만부를 따라 절개한 후 식염수에 씻어 면봉으로 잘 펴서 핀으로 고정한 뒤 사진 촬영을 하였다. 촬영한 사진은 이미지 프로그램(AxioVs V 4.
- 동물에서 매스틱 검 투여에 따른 histamine 저해활성을 측정하기 위해 실험동물에서 분리한 plasma를 이용하여 histamine을 측정하였다. 측정을 위해 SPI-BIO(New South Wales, Australia)의 histamine enzyme immunoassay kit(Bertin Pharma, Bretonneux, France)을 이용하여 SPI-BIO의 protocol을 따라서 실험을 하였으며, ELISA reader(Molecular Devices, Seoul, Korea)를 이용하여 측정하였다.
- Pipette을 이용하여 suspension 한 뒤 10분간 원심분리 하고 그 상층액을 사용하였다. 측정을 위해 cAMP direct immunoassay kit(Biovision, Milpitas, CA, USA)을 이용하여 Biovision의 protocol을 따라서 실험을 하였으며, ELISA reader(Molecular Devices)를 이용하여 측정하였다.
대상 데이터
- 본 연구에 사용한 실험동물은 경희대학교 동물실험윤리위원회(KHUASP(SE)-14-002)의 승인을 받아 진행하였다. ㈜대한바이오링크(충북 음성군, 한국)로부터 공급받은 250 g 내외의 7주령 SD rat 수컷을 일주일 동안 설치류 사육실에서 적응시킨 후 적응기간 중 일반 상태를 관찰하여 건강한 개체만 실험에 사용하였다. 사육환경은 온도 23±3℃, 습도 50±5%에서 light cycle은 12시간으로 유지하였다.
- 키오스 매스틱 검(Chios mastic gum: manufactured by The Chios Gum Mastic Growers Association)은 (주)진용(수원, 한국)으로부터 분말형태로 공급받아 실험에 사용하였다. 세포 실험을 위한 실험재료의 준비는 분말형태의 매스틱 검을 0.
데이터처리
- Different superscript letters (a-c) in a column show a significant difference at P<0.05 as determined by one-way ANOVA.
- 모든 측정 항목의 결과는 평균(mean)±표준편차(standard deviation, SD)로 표시하였고 실험군 간 평균의 차이는 one-way ANOVA로 유의성을 확인하였으며 P<0.05 수준에서 유의성의 여부를 검증하였다.
- 본 실험 결과는 SPSS(Statistical Package for the Social Science) version 20.0(IBM, Cambridge, MA, USA) 프로그램을 이용하여 분석하였다. 모든 측정 항목의 결과는 평균(mean)±표준편차(standard deviation, SD)로 표시하였고 실험군 간 평균의 차이는 one-way ANOVA로 유의성을 확인하였으며 P<0.
- 촬영한 사진은 이미지 프로그램(AxioVs V 4.8.2, Axiovision, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 위손상 부위 및 위 전체 면적을 측정하였고 Ulcer Index(%)=(손상 면적/전체 면적)×100으로 계산하였다.
이론/모형
- 위 벽세포 분리를 위한 실험동물은 Nakada 등(24)의 방법에 의해 수행하였다. 먼저 250 g 내외의 7주령 SD rat 수컷을 경추 탈골하여 70% 알코올로 피부를 소독하여 절개한 후 위 조직을 분리하였고, 이후 위 조직은 phosphate buffer saline(Hyclone Laboratories, Logan, UT, USA) 용액에서 보관하여 clean bench로 옮긴 후 phosphate buffer saline 용액에서 1회 세척하였다.
- 위장 점막에 손상을 주는 위액 분비와 관련된 유전자의 발현 변화량을 real-time PCR을 이용하여 확인하였다. 먼저 CCK2r의 유전자 발현 변화량에서는 vehicle 처리군 0.
성능/효과
- Control 그룹과 비교하였을 때 매스틱 검을 투여한 모든 그룹에서 점수가 유의적으로 감소하는 경향을 관찰할 수 있었다(P<0.05)(Table 3).
- H2r의 발현량 조사 결과 vehicle 처리군 0.31±0.01에 비해 control 그룹에서 1.00±0.15로 control군의 H2r 발현이 통계적으로 유의성 있게 증가한 것으로 확인하였다(P<0.05).
- 이번 연구에서 실험동물의 혈장에서 histamine 농도를 측정한 결과 알코올로 위를 자극시킨 동물의 혈장 histamine 농도가 정상 대조군에 비하여 유의적으로 높아진 반면, 매스틱 검 투여 그룹에서는 control 그룹과 비교하여 혈장 histamine 농도가 유의적으로 낮아진 것을 확인하였다. Histamine 분비에 의해 조절되는 H2r의 유전자 발현량을 비교한 결과에서도 역시 혈장 histamine 농도와 비슷한 양상으로 매스틱 검 투여 그룹에서 그 발현이 유의적으로 감소한 것을 확인하였다. 이러한 실험 결과는 앞서 확인한 위 점막 조직의 손상, 위액 분비량 및 위액 산도를 확인한 결과와 일치하였으며, 이는 매스틱 검의 투여가 histamine 분비를 조절함으로써 위산 분비 증가와 관련된 H2r의 발현에도 영향을 미쳐 결국 위산 분비를 감소시키고 위 점막 조직의 보호 효과가 나타난 것으로 생각된다.
- CCK2r과 M3r에서는 각각 gastrin과 acetylcholine에 의한 자극에 더욱 민감하게 반응할 것으로 생각되며, 이러한 부분은 추후 실험을 통해 확인되어야 할 것이다. Histamine 자극에 따른 세포 내 cAMP 농도 변화를 측정한 결과에서 histamine 자극에 의해 높아진 세포 내 cAMP 농도가 매스틱 검의 처리에 따라 유의적으로 감소한 것으로 나타났으며, 세포 수준에서 H+/K+ ATPase 발현 변화량과 비슷한 결과가 나타났음을 확인하였다. 이러한 결과를 바탕으로 histamine에 의해 위산 분비와 관련된 인자의 활성이 조절되며, 매스틱 검이 이러한 인자의 발현 증가에 대한 자극을 감소시켜 결국 위산 분비를 저해하는 효과가 나타난 것으로 생각된다.
- Histamine에 의해 가장 직접적으로 영향을 받는 H2r의 발현량 변화에서는 vehicle 처리군의 0.32±0.07에 비해 control 그룹에서 1.00±0.13으로 H2r 발현이 통계적으로 유의성 있게 증가한 것으로 확인되었다(P<0.05).
- L-1/100 g으로 정상 대조군에 비해 control 그룹의 총산도가 유의적으로 증가한 것으로 확인되었다(P<0.05).
- MG50 그룹 및 MG100 그룹에서는 각각 2.88±0.05와 3.06±0.52로 control군에 비해 유의적으로 pH가 증가하였으며, 특히 MG100 그룹에서 가장 효과적으로 pH가 증가하였음을 확인하였다(Table 3).
- cAMP 농도에 의해 영향을 받는 H+/K+ ATPase 발현 변화량을 측정한 결과, vehicle 처리군 0.44±0.07에 비해 histamine 으로 자극시킨 control 그룹에서 1.00±0.12로 유전자 발현량이 유의적으로 증가한 것으로 나타났다(P<0.05).
- 위산 분비와 관련된 다른 수용체의 발현을 확인하기 위해 위염이 유발된 실험동물의 위 점막 조직에서 유전자 발현 정도를 비교하였다. 그 결과 알코올로 위를 자극한 동물의 위 조직의 CCK2r 및 H+/K+ ATPase의 발현 정도가 정상대조군에 비하여 유의적으로 높아져 알코올에 의한 위 점막의 손상에 영향을 준 것을 확인하였다. 반면 매스틱 검을 투여한 모든 실험군(MG50, MG100)에서 위산 분비 관련 수용체의 발현이 유의적으로 감소하여 위 점막 손상에 대한 보호 효과가 나타난 것을 확인하였다.
- 동물실험 결과를 바탕으로 세포 수준에서 위산 분비와 관련된 기전적 연구를 추가적으로 진행하였다. 동물의 위 조직에서 분리한 parietal cell에서 histamine 자극에 의한 수용체 발현을 확인하였으며, 실험 결과 H2r과 H+/K+ ATPase 는 정상세포에 비해 histamine으로 자극한 세포에서 발현량이 유의적으로 증가하였고, 반면 매스틱 검 처리에 따라 농도 의존적으로 H2r과 H+/K+ ATPase의 발현을 유의적으로 감소시킨 것으로 나타났다. 그러나 M3r 및 CCK2r의 발현에서는 histamine으로 자극한 세포와 매스틱 검을 처리한 세포 사이에 유의적인 차이가 나타나지 않았으며, 이는 수용체의 특성에 따른 것으로 보인다.
- 이러한 동물실험 결과를 바탕으로 세포 수준에서의 기전 규명을 위한 연구를 추가적으로 진행하였으며, 세포 내 cAMP 농도, H+/K+ APTase 및 H2r의 발현 변화를 관찰한 결과 매스틱 검의 처리가 효과적으로 이들의 발현을 감소시켰음을 확인하였다. 따라서 매스틱 검의 위산 분비 억제 및 점막 보호 활성 효과는 형태학적 및 병리학적 관찰, histamine 분비 억제, 수용체 발현 억제효과 등으로 확인한 결과, histamine을 통한 위산 분비 경로를 조절함으로써 위산 분비 및 위장 점막 손상에 대해 보호 효과를 나타내었으며 이는 이전 실험 결과들과 동일한 농도에서 효과가 나타났음을 확인하였다.
- 따라서 이러한 결과로 매스틱 검의 투여에 따라 위액 분비량이 감소되었음을 확인하였다(P<0.05)(Fig. 2).
- 이로써 매스틱 검의 항염증 활성을 증명한 바 있으며, 매스틱 검의 기능성분에 대한 연구를 통해 resin 등 풍부한 식이섬유가 염증 억제 및 위 점막의 보호 활성을 나타낸 것으로 보고하였다(30,31). 따라서 이번 연구에서 알코올로 위를 유발시킨 동물에서 매스틱 검의 처리로 인하여 위 손상을 감소시킨 결과는 매스틱 검의 점막 보호 활성 및 위산 분비 억제 활성으로 인한 결과로 예상할 수 있다.
- 또한 M3r에서도 vehicle 처리군의 0.65±0.17에 비해 control 그룹에서 1.00±0.15로 유전자 발현이 통계적으로 유의성 있게 증가하였으나, 매스틱 검 처리 세포에서 control 그룹과 유의적인 차이가 나타나지 않은 것으로 확인되었다(Fig. 5B).
- 또한 매스틱 검 투여 그룹에서는 MG50 그룹은 0.76±0.01, MG100 그룹은 0.83±0.01로 control군에 비해 유의적으로 발현이 감소한 것으로 나타났다(P<0.05)(Fig. 4C).
- 혈장 histamine 농도와 그로 인해 영향을 받은 H2r 발현량 변화로 위산 분비 관련 인자를 확인한 결과에서도 매스틱 검을 투여한 그룹에서 유의적으로 그 농도가 감소한 것을 확인하였다. 또한 위 벽세포에서 위산 분비 증가와 관련된 수용체인 CCK2r과 H+/K+ APTase 발현 변화도 역시 매스틱 검의 투여가 효과적으로 발현을 억제한 것으로 나타났다. 이러한 동물실험 결과를 바탕으로 세포 수준에서의 기전 규명을 위한 연구를 추가적으로 진행하였으며, 세포 내 cAMP 농도, H+/K+ APTase 및 H2r의 발현 변화를 관찰한 결과 매스틱 검의 처리가 효과적으로 이들의 발현을 감소시켰음을 확인하였다.
- 매스틱 검 5 μg/ mL를 처리한 세포에서 0.92±0.09, 매스틱 검 10 μg/mL 처리 세포에서 0.94±0.15, 매스틱 검 20 μg/mL 처리 세포에서 1.04±0.11로 나타났으나 control 그룹 사이에 유의성은 나타나지 않은 것으로 확인되었다(Fig. 5A).
- 먼저 CCK2r의 유전자 발현 변화량에서는 vehicle 처리군 0.27±0.01에 비해 control 그룹에서 1.00±0.14로 control군의 CCK2r 발현이 통계적으로 유의성 있게 증가한 것으로 확인되었다(P<0.05).
- 먼저 CCK2r의 유전자 발현 변화량에서는 vehicle 처리군 0.77±0.09에 비해 histamine 처리한 control 그룹에서 1.00±0.18로 CCK2r 발현이 통계적으로 유의성 있게 증가한 것으로 확인되었다(P<0.05)(Fig. 5A).
- 먼저 histamine의 경우 vehicle 처리 군에 비해 control 그룹에서 3.46±0.40 nM로 control 그룹의 혈장에서 histamine의 농도가 통계적으로 유의성 있게 증가한 것으로 확인되었다(P<0.05).
- 먼저 세포 수준에서 cAMP level을 측정한 결과, vehicle 처리군 74.8±16.7 fmol/mg protein 에 비해 control 그룹에서 158.5±17.4 fmol/mg protein으로 cAMP level이 유의적으로 증가한 것으로 나타났다(P<0.05).
- 반면 MG50 그룹은 0.37±0.10, MG100 그룹은 0.42±0.01로 시험대조군에 비해 유의적으로 H2 수용체 발현이 감소한 것으로 나타났으며, 매스틱 검을 투여한 모든 그룹에서 효과적으로 감소되었음을 확인하였다(P<0.05)(Fig. 3B).
- 반면 MG50 그룹은 0.38±0.15, MG100그룹은 0.44±0.08로 control군에 비해 유의적으로 그 발현이 감소한 것으로 나타났으며, 매스틱검을 투여한 모든 그룹에서 효과적으로 감소되었음을 확인하였다(P<0.05)(Fig. 4A).
- 반면 매스틱 검 5 μg/mL를 처리한 세포에서 0.77±0.09, 매스틱 검 10μg/mL 처리 세포에서 0.61±0.11, 매스틱 검 20 μg/mL 처리 세포에서 0.57±0.17로 나타나 유의적으로 발현이 감소한 것을 확인하였으며, 특히 매스틱 검 처리에 따라 농도 의존적으로 감소되었음을 확인하였다(P<0.05)(Fig. 5C).
- 반면 매스틱 검 5 μg/mL를 처리한 세포에서 0.84±0.07, 매스틱 검 10 μg/mL 처리 세포에서 0.71±0.11, 매스틱 검 20 μg/mL 처리 세포에서 0.68±0.15로 시험대조군에 비해 유의적으로 그 발현이 감소한 것으로 나타났으며, 이러한 결과는 앞선 cAMP level 측정 결과와 비슷한 양상으로 농도 의존적으로 감소한 것으로 확인되었다(Fig. 6B).
- 반면 매스틱 검 5 μg/mL를 처리한 세포에서 134.1±10.6 fmol/mg protein, 매스틱 검 10 μg/mL 처리 세포에서 108.6±17.4 fmol/mg protein, 매스틱 검 20 μg/ mL 처리 세포에서 110.7±14.3 fmol/mg protein으로 histamine으로 자극시킨 세포에 비해 유의적으로 그 발현이 감소한 것으로 나타났으며, 매스틱 검 처리에 따라 농도 의존적으로 감소되었음을 확인하였다(P<0.05)(Fig. 6A).
- 반면 매스틱 검 50 mg/kg을 투여한 MG50 그룹은 2.63±0.38 nM, MG100 그룹은 2.03±0.31 nM로 control군에 비해 유의적으로 감소한 것으로 나타났으며, 매스틱 검을 투여한 모든 그룹에서 histamine 농도가 효과적으로 감소되었음을 확인하였다(P<0.05)(Fig. 3A).
- 실험 결과, 알코올로 위를 자극한 동물의 위 점막 조직이 현저히 손상되어 ulcer index(손상 면적)가 유의적으로 증가한 것으로 나타났으며, 위액 분비량 및 위액 산도 역시 유의적으로 높아진 것으로 나타나 알코올의 영향으로 위액 분비 증가와 위 점막 조직 손상이 심화된 것을 확인할 수 있었다. 반면 매스틱 검을 투여한 그룹에서는 control군과 비교하여 유의적으로 ulcer index가 낮아졌고 위액 분비량과 위액 산도 역시 유의적 감소를 보였으며, 이러한 결과는 알코올로 위를 자극한 동물 모델에서 매스틱 검 투여에 따라 위 점막의 보호 효과가 나타난 것으로 생각된다. 특히 실험농도인 50 mg/kg 투여 그룹과 100 mg/kg의 매스틱 검을 투여한 그룹에서 모두 유의적으로 효과가 나타났으며, 이는 이전 실험 결과와 동일한 것으로 확인되었다(25,26).
- 그 결과 알코올로 위를 자극한 동물의 위 조직의 CCK2r 및 H+/K+ ATPase의 발현 정도가 정상대조군에 비하여 유의적으로 높아져 알코올에 의한 위 점막의 손상에 영향을 준 것을 확인하였다. 반면 매스틱 검을 투여한 모든 실험군(MG50, MG100)에서 위산 분비 관련 수용체의 발현이 유의적으로 감소하여 위 점막 손상에 대한 보호 효과가 나타난 것을 확인하였다.
- 이번 연구에서 알코올로 위를 자극한 동물의 위산 분비와 위 점막 조직 손상에 매스틱 검 투여에 대한 효과를 확인하기 위하여 위 점막 조직의 형태학적, 병리학적 변화, 위산 분비량 및 위액의 산도를 측정하였다. 실험 결과, 알코올로 위를 자극한 동물의 위 점막 조직이 현저히 손상되어 ulcer index(손상 면적)가 유의적으로 증가한 것으로 나타났으며, 위액 분비량 및 위액 산도 역시 유의적으로 높아진 것으로 나타나 알코올의 영향으로 위액 분비 증가와 위 점막 조직 손상이 심화된 것을 확인할 수 있었다. 반면 매스틱 검을 투여한 그룹에서는 control군과 비교하여 유의적으로 ulcer index가 낮아졌고 위액 분비량과 위액 산도 역시 유의적 감소를 보였으며, 이러한 결과는 알코올로 위를 자극한 동물 모델에서 매스틱 검 투여에 따라 위 점막의 보호 효과가 나타난 것으로 생각된다.
- 위 손상 면적은 매스틱 검 50 mg/kg 투여한 MG50 그룹에서 6.98±0.98%, 매스틱 검 100 mg/kg 투여한 MG100 그룹에서는 6.18±1.14%로 나타났으며 control 그룹과 비교하여 손상 면적이 유의적으로 감소된 것을 확인하였다(P<0.05)(Fig. 1B).
- 위 조직의 병리학적 상태를 수치화 후 평가하는 지표를 이용하여(Table 2) 위 조직의 병리학적 이상소견을 점수화한 결과에서 vehicle 처리군에서는 특이할 만한 조직병리학적 소견은 관찰되지 않았으나 control 그룹은 3.92±0.92로 유의적으로 가장 높았다(P<0.05).
- 본 연구는 위 벽세포 in vitro 실험모델과 알코올로 위를 자극한 in vivo 실험모델을 이용하여 매스틱 검의 위산 분비 억제 및 위장 점막 보호 효과를 확인하고자 하였다. 위 조직의 병리학적인 관찰을 통하여 효과를 관찰한 결과 알코올로 위를 자극한 군에서 위 점막 조직의 손상과 표면 상피세포의 손실을 관찰할 수 있었으나, 매스틱 검 50 및 100 mg/kg 투여한 군에서 모두 control 그룹과 비교했을 때 손상이 회복되었음을 확인할 수 있었다. 위액 분비량 및 위액 산도를 비교한 결과에서도 알코올의 자극으로 인하여 증가한 위액 분비량과 위액 산도를 매스틱 검이 유의적으로 감소시켰음을 확인할 수 있었다.
- 위산 분비에서 중요한 역할을 하는 H+/K+ ATPase 발현량에서도 역시 vehicle 처리군 0.70±0.01에 비해 control 그룹에서 1.00±0.01로 control군의 H+/K+ ATPase 발현이 통계적으로 유의성 있게 증가한 것으로 확인되었다(P<0.05).
- 위 조직의 병리학적인 관찰을 통하여 효과를 관찰한 결과 알코올로 위를 자극한 군에서 위 점막 조직의 손상과 표면 상피세포의 손실을 관찰할 수 있었으나, 매스틱 검 50 및 100 mg/kg 투여한 군에서 모두 control 그룹과 비교했을 때 손상이 회복되었음을 확인할 수 있었다. 위액 분비량 및 위액 산도를 비교한 결과에서도 알코올의 자극으로 인하여 증가한 위액 분비량과 위액 산도를 매스틱 검이 유의적으로 감소시켰음을 확인할 수 있었다. 혈장 histamine 농도와 그로 인해 영향을 받은 H2r 발현량 변화로 위산 분비 관련 인자를 확인한 결과에서도 매스틱 검을 투여한 그룹에서 유의적으로 그 농도가 감소한 것을 확인하였다.
- 위액 분비량 측정 결과 vehicle 처리군에서는 0.15±0.03 mL로 위액이 소량 분비되었으나 control 그룹에서는 위 점막 손상으로 위액 분비량이 증가하여 0.73±0.06 mL로 측정되었다.
- Histamine 자극에 따른 세포 내 cAMP 농도 변화를 측정한 결과에서 histamine 자극에 의해 높아진 세포 내 cAMP 농도가 매스틱 검의 처리에 따라 유의적으로 감소한 것으로 나타났으며, 세포 수준에서 H+/K+ ATPase 발현 변화량과 비슷한 결과가 나타났음을 확인하였다. 이러한 결과를 바탕으로 histamine에 의해 위산 분비와 관련된 인자의 활성이 조절되며, 매스틱 검이 이러한 인자의 발현 증가에 대한 자극을 감소시켜 결국 위산 분비를 저해하는 효과가 나타난 것으로 생각된다.
- 또한 위 벽세포에서 위산 분비 증가와 관련된 수용체인 CCK2r과 H+/K+ APTase 발현 변화도 역시 매스틱 검의 투여가 효과적으로 발현을 억제한 것으로 나타났다. 이러한 동물실험 결과를 바탕으로 세포 수준에서의 기전 규명을 위한 연구를 추가적으로 진행하였으며, 세포 내 cAMP 농도, H+/K+ APTase 및 H2r의 발현 변화를 관찰한 결과 매스틱 검의 처리가 효과적으로 이들의 발현을 감소시켰음을 확인하였다. 따라서 매스틱 검의 위산 분비 억제 및 점막 보호 활성 효과는 형태학적 및 병리학적 관찰, histamine 분비 억제, 수용체 발현 억제효과 등으로 확인한 결과, histamine을 통한 위산 분비 경로를 조절함으로써 위산 분비 및 위장 점막 손상에 대해 보호 효과를 나타내었으며 이는 이전 실험 결과들과 동일한 농도에서 효과가 나타났음을 확인하였다.
- Histamine 분비에 의해 조절되는 H2r의 유전자 발현량을 비교한 결과에서도 역시 혈장 histamine 농도와 비슷한 양상으로 매스틱 검 투여 그룹에서 그 발현이 유의적으로 감소한 것을 확인하였다. 이러한 실험 결과는 앞서 확인한 위 점막 조직의 손상, 위액 분비량 및 위액 산도를 확인한 결과와 일치하였으며, 이는 매스틱 검의 투여가 histamine 분비를 조절함으로써 위산 분비 증가와 관련된 H2r의 발현에도 영향을 미쳐 결국 위산 분비를 감소시키고 위 점막 조직의 보호 효과가 나타난 것으로 생각된다.
- 그러므로 수용체 활성을 조절하는 것이 위 조직의 손상을 치료하고 보호하는 데 중요한 역할을 하고, 이와 관련된 약물을 치료에 사용하고 있다(13). 이번 연구에서 실험동물의 혈장에서 histamine 농도를 측정한 결과 알코올로 위를 자극시킨 동물의 혈장 histamine 농도가 정상 대조군에 비하여 유의적으로 높아진 반면, 매스틱 검 투여 그룹에서는 control 그룹과 비교하여 혈장 histamine 농도가 유의적으로 낮아진 것을 확인하였다. Histamine 분비에 의해 조절되는 H2r의 유전자 발현량을 비교한 결과에서도 역시 혈장 histamine 농도와 비슷한 양상으로 매스틱 검 투여 그룹에서 그 발현이 유의적으로 감소한 것을 확인하였다.
- 이상의 실험 결과를 살펴보면 매스틱 검의 위산 분비 억제 및 위장 점막 보호 효능이 나타난 것으로 생각되는데, 이러한 효능은 식이섬유가 풍부한 매스틱 검의 물질적 특성을 고려할 때 직접적 조절 효과라고 할 수 있는 결과는 아직 확실치 않지만 최소한 간접적인 조절 효과가 함께 작용했을 것으로 보인다. 즉 풍부한 식이섬유가 위장 점막을 덮어 보호함으로써 자극이 감소하게 되고, 이러한 자극 감소는 histamine 분비를 감소시켜 결국 위산의 생성 및 분비가 줄어들어 위 점막 조직을 자극으로부터 보호하는 효과를 더욱 증가시키는 것으로 생각된다.
- 위염은 위 점막 염증성 질환을 총칭하는 것으로 Helicobacter pylori 균 감염, NSAID(non-steroid anti-inflammatory drugs), 스트레스, 알코올 등에 의해 위 점막을 보호하는 방어인자와 손상시키는 공격인자 사이의 균형이 깨져 발생이 된다(1,2). 최근 5년간 실시된 국민건강영양조사의 자료를 분석한 결과에 따르면 위 점막 염증성 질환에 대한 진료환자가 연 평균 4.9% 증가하였으며, 20대 여성에서 더 높은 빈도로 발생한 것으로 나타났다. 특히 한국인에서 맵고 짠 자극적인 음식을 선호하는 식습관, 스트레스, 과도한 음주 문화, 약물 오남용, 국물요리를 함께 섭취하는 식습관 등으로 인해 위 장관의 염증성 질환 발생이 빈번하고 만성적으로 발생하는 것으로 나타났다(3-5).
- 반면 매스틱 검을 투여한 그룹에서는 control군과 비교하여 유의적으로 ulcer index가 낮아졌고 위액 분비량과 위액 산도 역시 유의적 감소를 보였으며, 이러한 결과는 알코올로 위를 자극한 동물 모델에서 매스틱 검 투여에 따라 위 점막의 보호 효과가 나타난 것으로 생각된다. 특히 실험농도인 50 mg/kg 투여 그룹과 100 mg/kg의 매스틱 검을 투여한 그룹에서 모두 유의적으로 효과가 나타났으며, 이는 이전 실험 결과와 동일한 것으로 확인되었다(25,26).
- 위액 분비량 및 위액 산도를 비교한 결과에서도 알코올의 자극으로 인하여 증가한 위액 분비량과 위액 산도를 매스틱 검이 유의적으로 감소시켰음을 확인할 수 있었다. 혈장 histamine 농도와 그로 인해 영향을 받은 H2r 발현량 변화로 위산 분비 관련 인자를 확인한 결과에서도 매스틱 검을 투여한 그룹에서 유의적으로 그 농도가 감소한 것을 확인하였다. 또한 위 벽세포에서 위산 분비 증가와 관련된 수용체인 CCK2r과 H+/K+ APTase 발현 변화도 역시 매스틱 검의 투여가 효과적으로 발현을 억제한 것으로 나타났다.
후속연구
- 그러나 M3r 및 CCK2r의 발현에서는 histamine으로 자극한 세포와 매스틱 검을 처리한 세포 사이에 유의적인 차이가 나타나지 않았으며, 이는 수용체의 특성에 따른 것으로 보인다. CCK2r과 M3r에서는 각각 gastrin과 acetylcholine에 의한 자극에 더욱 민감하게 반응할 것으로 생각되며, 이러한 부분은 추후 실험을 통해 확인되어야 할 것이다. Histamine 자극에 따른 세포 내 cAMP 농도 변화를 측정한 결과에서 histamine 자극에 의해 높아진 세포 내 cAMP 농도가 매스틱 검의 처리에 따라 유의적으로 감소한 것으로 나타났으며, 세포 수준에서 H+/K+ ATPase 발현 변화량과 비슷한 결과가 나타났음을 확인하였다.
- 동물실험 결과를 바탕으로 세포 수준에서 위산 분비와 관련된 기전적 연구를 추가적으로 진행하였다. 동물의 위 조직에서 분리한 parietal cell에서 histamine 자극에 의한 수용체 발현을 확인하였으며, 실험 결과 H2r과 H+/K+ ATPase 는 정상세포에 비해 histamine으로 자극한 세포에서 발현량이 유의적으로 증가하였고, 반면 매스틱 검 처리에 따라 농도 의존적으로 H2r과 H+/K+ ATPase의 발현을 유의적으로 감소시킨 것으로 나타났다.
- 즉 풍부한 식이섬유가 위장 점막을 덮어 보호함으로써 자극이 감소하게 되고, 이러한 자극 감소는 histamine 분비를 감소시켜 결국 위산의 생성 및 분비가 줄어들어 위 점막 조직을 자극으로부터 보호하는 효과를 더욱 증가시키는 것으로 생각된다. 따라서 매스틱 검 섭취 시 위산 분비 억제 및 점막 보호 활성 효능을 지니는 기능성 소재로써 활용가치 및 실용가능성이 있을 것으로 기대할 수 있다.
- 또한 동물에서 aspirin, phenyl-butazone, reserpine, cold stress에 의한 위장 점막 손상으로부터 보호 효과가 있으며, 위 염증 및 궤양 정도를 유의적으로 감소시키는 데 효과적인 것으로 보고되고 있다(23). 이러한 매스틱 검의 위장 보호 효과에 대한 연구 결과를 바탕으로, 매스틱 검이 알코올로 유도한 위 손상에 대한 위산 분비 억제 및 위장 점막 보호 효과를 나타낼 수 있을 것으로 기대된다. 그러나 매스틱 검을 이용한 위장 점막의 손상과 관련된 메커니즘 규명 연구가 미미한 실정이며, 따라서 본 연구에서는 매스틱 검의 투여가 알코올 처리로 유도된 위점막 손상 동물모델에서 위액 분비, 위 점막 손상, 위산 분비 촉진 인자 발현 변화에 미치는 영향을 관찰하고, 매스틱 검의 처리에 따라 parietal cell에서 관련 수용체 발현 및 cAMP 농도 변화를 관찰하여 매스틱 검의 위산 분비 억제를 통한 위장 보호 기전을 확인하고자 하였다.
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