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문제 정의
- 다른 이름으로 영유(零楡), 유피(楡皮), 유근피(楡根皮)가 있다. 본 연구는 위와 같은 효과를 가진 세 가지 한방약용식물의 추출물의 단독 및 혼합물의 tyrosinase 활성조절과 melanin 생성 및 항산화 메커니즘을 연구하고자 한다.
- Tyrosinase 는 인체내의 멜라닌 생합성 경로에서 가장 중요한 초기 속도결정단계에 관여하는 효소로서 많은 미백 성분이 이 효소를 억제하는 작용기전을 가지고 있다. 이 시험은 In vitro에서 tyrosinase의 활성을 저해하는 정도를 평가할 수 있다. Fig.
제안 방법
- B16F1 세포로부터 분리한 genomic DNA를 이용하여 F2SO4와 H2O2를 반응시켜 hydroxyl radical을 생성시키는 Fenton 반응에 의한 DNA의 산화적 손상에 대한 PGUE의 항산화 효과를 조사하였다. 대조군의 genomic DNA는 Fig.
- Brand-Williams [12] 실험방법을 변형하여 1,1-diphenyl2-picrylhydrazyl (DPPH) radical에 대한 GUEE 및 PGUE의 소거능력을 측정하였다. 각 시료를 시험농도로 처리하고 10 sec 동안 잘 혼합한 다음, 실온에서 20분 동안 반응시킨 후 525 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- DOPA자극을 통한 melanin 생성조절효과를 조사하기 위해 B16F1 세포를 사용하여 melanin 함량을 측정 하였다. 세포 내에 melanin 생성양을 측정하기 위해 1N NaOH를 이용하여 세포내 melanin을 측정한 결과 Fig.
- DPPH radical, lipid peroxidation의 소거능력에 대하여 GUEE 및 PGUE의 효과를 비교 조사하였다. DPPH radical소거법은 항산화 물질에 의한 DPPH radical의 탈색 정도를 지표로 하여 산화억제 정도를 예측할 수 있다.
- Oyaizu [19]의 방법에 따라 측정하였다. GUEE 및 PGUE를 각각 1 ml에 pH 6.6의 200 mM 인산 완충용액 및 1%의 potassium ferricyanide를 각 1 ml씩 차례로 가하여 교반한 후 50℃의 수욕상에서 20분 동안 반응시켰다. 여기에 10% TCA 용액 1 ml를 가하여 13,500× g에서 15분 동안 원심분리하여 얻은 상등액 1 ml에 증류수 및 ferric chloride 각 1 ml를 가하여 혼합한 후 700 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- GUEE 및 PGUE을 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 1%의 농도가 되게 linolenic acid emulsion과 30분 동안 혼합한 후 0.8 mM H2O2 및 0.8 mM FeSO4를 혼합한 용액을 5시간 동안 반응 시킨 후 0.4% TBA를 첨가하고 95℃에서 2시간 동안 반응시켜 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 그 다음, 15:1 비율의 n-butanol : pyridine 용액을 500 μl 첨가하고 1,000× g에서 10분 동안 원심분리하여 상등액을 532 nm에서 흡광도를 측정하였으며 지질과산화 정도는 시료 첨가 전후의 흡광도 비를 %값으로 환산하였다.
- Melanin 생성의 중요한 효소인 tyrosinase와 melanin 생성 신호전달기전에 중요한 tyrosinase related protein-1 (TRP-1) tyrosinase related protein-2 (TRP-2)와 항산화 효소 중에서 가장 중요한 Superoxide dismutase (SOD)인 SOD-1의 단백질 발현을 조사하였다. Fig.
- Western blot의 band는 LAS3000 ®image analyzer(Fujifilm Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다.
- 여기서 얻은 pellet에 1 N NaOH(10% DMSO) 200 μl를 첨가하고 vortex 후 405 nm에서 흡광도를 측정 하였다. melanin 표준품(Sigma, USA)으로 얻은 표준 검량선을 이용하여 각 well에 서 생성된 멜라닌 양을 산출하여 였다. 멜라닌은 단위세포(104 cells)에서의 멜라닌 생성량을 비교하였다.
- 10 μg의 세포용출액을 10% Tris–HCl gel에서 전기영동 후 단백질을 전기적으로 nitrocellulose membrane으로 전이시켰다. 그 다음 10% skim milk를 nitrocellulose membrane에 전처리하고 목적 단백질에 대한 1차 항체(anti-tyrosinase, anti-TRP -1, anti-TRP -2, anti-SOD -1, anti-beta-actin)를 처리한 다음 2차 항체를 처리 후, chemiluminescent ECL kit (Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 목적단백질을 검출하였다. Western blot의 band는 LAS3000 ®image analyzer(Fujifilm Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다.
- 그 다음, 15:1 비율의 n-butanol : pyridine 용액을 500 μl 첨가하고 1,000× g에서 10분 동안 원심분리하여 상등액을 532 nm에서 흡광도를 측정하였으며 지질과산화 정도는 시료 첨가 전후의 흡광도 비를 %값으로 환산하였다.
- 이에 대해 좀 더 정확한 기전을 조사하기 위하여 쥐의 melanoma cell인 B16F1 cells에서 백복령, 유백피, 감초 추출물 혼합용액의 tyrosinase와 함께 melanin 합성 단계에서 중요히 여겨지는 tyrosinase-realted protein (TRP)-2;DOPAchrome oxidase, tyrosinase-related protein (TRP)-1; DHICA oxidase의 단백질 발현[5] 조절효과를 조사하였다. 먼저 DOPA 자극 하에서 백복령 추출물을 단독으로 B16F1 cell에 처리하여 tyrosinase의 단백질 발현 수준을 조사하였다. 그 결과 tyrosinase의 단백질 발현 수준은 일정하게 나타났다.
- melanin 표준품(Sigma, USA)으로 얻은 표준 검량선을 이용하여 각 well에 서 생성된 멜라닌 양을 산출하여 였다. 멜라닌은 단위세포(104 cells)에서의 멜라닌 생성량을 비교하였다.
- 하지만 백복령, 유백피, 감초 추출물 혼합용액은 tyrosinase의 활성을 저해하였음에도 불구하고 arbutin과 달리 melanin 합성 저해효과는 나타나지 않았다. 이에 대해 좀 더 정확한 기전을 조사하기 위하여 쥐의 melanoma cell인 B16F1 cells에서 백복령, 유백피, 감초 추출물 혼합용액의 tyrosinase와 함께 melanin 합성 단계에서 중요히 여겨지는 tyrosinase-realted protein (TRP)-2;DOPAchrome oxidase, tyrosinase-related protein (TRP)-1; DHICA oxidase의 단백질 발현[5] 조절효과를 조사하였다. 먼저 DOPA 자극 하에서 백복령 추출물을 단독으로 B16F1 cell에 처리하여 tyrosinase의 단백질 발현 수준을 조사하였다.
대상 데이터
- 세포배양을 위한 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), Trypsin-EDTA, penicillin / streptomycin / amphotericin (각각 10,000 U/ml, 10,000 μg/ml 및 2,500 μg/ml), fetal bovine serum (FBS) 시약은 Gibco BRL, Life Technologies (Paisley, Scotland)로 부터 구입하였다. B16F1 cell line은 ATCC (American Type Culture Collection, USA)로부터 구입하였다. MTT reagent, gelatin, agarose와 기타시약은 Sigma Chemical Co.
- B16F1 cell line은 ATCC (American Type Culture Collection, USA)로부터 구입하였다. MTT reagent, gelatin, agarose와 기타시약은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.
- 세포배양을 위한 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), Trypsin-EDTA, penicillin / streptomycin / amphotericin (각각 10,000 U/ml, 10,000 μg/ml 및 2,500 μg/ml), fetal bovine serum (FBS) 시약은 Gibco BRL, Life Technologies (Paisley, Scotland)로 부터 구입하였다.
- 여기에 10% TCA 용액 1 ml를 가하여 13,500× g에서 15분 동안 원심분리하여 얻은 상등액 1 ml에 증류수 및 ferric chloride 각 1 ml를 가하여 혼합한 후 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로 0.01% vitamin C를 사용하였다. 시료의 환원력은 시료 첨가군와 대조군의 흡광도 비를 % 값으로 환산하여 나타내었다.
데이터처리
- Level of significance was identified statistically using Student’s t test.
- 각 시료 농도군에 대한 유의차 검정은 대조군과 비교하여 Student’s t test 한 후 p<0.05 값을 통계적으로 유의성 있는 결과로 간주하였다.
- 각 실험은 3회 이상 반복실험을 통하여 그 결과를 얻어 각각의 시료농도에 대해 평균±표준편차로 나타내었다.
이론/모형
- Hansen [10]의 방법에 따라 B16F1 세포에 대한 GUEE 및 PGUE의 세포독성을 MTT (3-(4,5-dimethyl-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 이용하여 측정하였다.
- Oyaizu [19]의 방법에 따라 측정하였다. GUEE 및 PGUE를 각각 1 ml에 pH 6.
- 이 세포 독성에 미치는 농도를 조사하기 위하여 MTT assay 를 수행하였다. B16F1세포에 대한 각 시료의 세포 독성을 측정한 결과, Fig.
성능/효과
- B16F1세포에 대한 각 시료의 세포 독성을 측정한 결과, Fig. 1에서 보는 바와 같이 GUEE 및 PGUE는 3.12μg/ml 이하의 농도에서 대조군과 비교하였을 때 어떠한 독성 효과도 없는 것으로 나타났다.
- Fig. 2에서 보는 바와 같이 각각 단독으로 처리한 그룹과 혼합용액을 처리한 그룹의 DPPH radical에 대한 소거능이 농도에 비례하여 증가하는 것으로 나타났으며, 특히 이들 혼합물인 PGUE의 15.6μg/ml 농도 이상에서 78%의 DPPH radical 소거능을 나타냈다.
- Fig. 3에서 보는 바와 같이 각 시료들을 처리했을 때 GUEE 은 유효성 있는 억제효과를 나타내지 않았으나 PGUE는 7.8μg/ml 이상의 농도에서 지질과산화를 억제시켜 17%의 억제 효과를 나타내었으며 15.6 μg/ml의 농도에서는 양성대조군으로 사용된 1,000 μg/ml의 vitamin E와 유사한 20%의 지질과산화를 억제시켰다.
- 이 시험은 In vitro에서 tyrosinase의 활성을 저해하는 정도를 평가할 수 있다. Fig. 6에서 보는 바와 같이 PGUE의 tyrosinase 활성억제 효과는 시험농도가 증가함에 따라 비례하여 억제효능이 증가하는 것으로 나타났다. PGUE는 31.
- GUEE는 62.5 μg/ml 농도에서 150%의 환원력을 나타내었으며 PGUE는 62.5 μg/ ml 농도에서 270%의 환원력을 나타내어 양성대조군으로 사용된 10 μg/ml 의 vitamin C보다 환원력이 우수한 것으로 나타났다
- PGUE는 31.2 μg/ml농도에서 양성 대조군으로 사용된 2,000 μg/ml의 arbutin의 효능보다 tyrosinase 활성 억제효과가 더 우수한 것으로 나타났다.
- PGUE은 대조군에 비하여 3.12 μg/ml 농도에서 SOD-1의 발현을 감소시키며 뿐만 아니라 TRP-1의 단백질 발현은 0.39 μg/ml의 낮은 농도에서도 감소된다는 것을 확인할 수 있었다.
- 하지만 백복령, 유백피, 감초 추출물의 혼합 용액은 백복령 및 감초, 유백피 단독 처리에 비해 항산화 효과가 증가하는 것을 확인하였다. TBARS를 실시한 결과 각각의 단독 추출물은 눈에 띄는 산화억제능력을 나타내지 않았으나 혼합 용액의 경우 양성대조군으로 사용된 vitamin E와 유사한 지질과산화 억제능력을 보였다. 특히 DPPH radical 소거능과 환원력은 양성 대조군으로 사용된 vitamin C 보다 높은 효과를 나타내었다.
- 일반적으로, melanin 합성 조절에 대한 연구는 tyrosine을 DOPA로 전환하는 tyrosinase의 활성조절에 초점이 맞춰져 있으며 실제로도 피부 미백제 개발에 있어서 tyrosinase의 활성억제 실험은 유용한 평가방법이 되고 있다. 감초 추출물의 tyrosinase 활성 억제 효과를 조사해본 결과, 물에 잘 녹지 않는 특성으로 인해 뿌옇게 변하여 흡광도에 영향을 주어 농도에 비례해서 증가하는 양상을 보였다. 하지만 백복령, 유백피, 감초 추출물 혼합용액의 tyrosinase 저해 효과는 뛰어났으며 양성 대조군으로 사용된 arbutin 보다 더 높은 tyrosinase 저해 효과를 나타냈다.
- 먼저 DOPA 자극 하에서 백복령 추출물을 단독으로 B16F1 cell에 처리하여 tyrosinase의 단백질 발현 수준을 조사하였다. 그 결과 tyrosinase의 단백질 발현 수준은 일정하게 나타났다. 하지만 흥미롭게도 DOPA 자극 하에서 B16F1에서는 매우 낮은 수준의 TRP-1 단백질 발현을 나타냈다.
- 2 μg/ml농도에서 양성 대조군으로 사용된 2,000 μg/ml의 arbutin의 효능보다 tyrosinase 활성 억제효과가 더 우수한 것으로 나타났다. 따라서 PGUE는 각각 단독으로 처리한 군보다 tyrosinase활성 억제에 대한 상승효과가 있는 것 나타났다.
- 백복령, 감초, 유백피의 혼합물를 처리한 그룹의 SOD-1 단백질 발현을 확인한 결과 SOD-1의 단백질 발현이 농도에 따라 약간 낮게 조절됨을 확인 할 수 있었다. 따라서 감초 단독 추출물과 백복령, 유백피, 감초 추출물 혼합용액의 미백기능 효과를 조사한 결과는 감초추출물을 단독으로 처리할 때 보다 혼합용액이미백 기능 효과가 훨씬 뛰어나며 melanin 생성 초기 단계에 관여하는 단백질인 tyrosinase의 활성을 억제시키고 TRP-1를 유의성 있게 감소시켜 in vitro에서 미백 기능성 성분인 arbutin 보다 더 뛰어난 효과를 나타낸다. 또한 항산화 효과 역시 감초추출물 단독일 때는 미미하였으나 혼합용액은 vitamin C 보다도 뛰어난 효과를 나타내었다.
- 체내 제거기전에 의해 제거되지 못하는 유해 활성산소종은 세포질, DNA, 단백질 등에 손상을 주어 주름, 색소침착 등을 유발한다[16]. 따라서 백복령, 감초, 유백피 추출물의 항산화 효과를 조사한 결과, DPPH radical 소거능력, 지질과산화 억제능력, 환원력 등은 눈에 띄게 뛰어나지 않았다. 하지만 백복령, 유백피, 감초 추출물의 혼합 용액은 백복령 및 감초, 유백피 단독 처리에 비해 항산화 효과가 증가하는 것을 확인하였다.
- 특히 DPPH radical 소거능과 환원력은 양성 대조군으로 사용된 vitamin C 보다 높은 효과를 나타내었다. 또한 OH radical에 의한 DNA 산화로부터의 보호능력을 확인한 결과 혼합용액의 농도가 증가할수록 DNA 산화를 억제하는 것을 확인 할 수 있었다. 특히 OH radical를 이용한 지질과산화억제실험과 DNA oxidation에서의 OH radical 로부터의 보호효과는 tyrosine을 OH radical로부터 보호하여 DOPA에서 DOPA quenon으로 산화되는 과정을 억제하여 과한 melanin 합성억제 효과를 기대할 수 있다.
- 따라서 감초 단독 추출물과 백복령, 유백피, 감초 추출물 혼합용액의 미백기능 효과를 조사한 결과는 감초추출물을 단독으로 처리할 때 보다 혼합용액이미백 기능 효과가 훨씬 뛰어나며 melanin 생성 초기 단계에 관여하는 단백질인 tyrosinase의 활성을 억제시키고 TRP-1를 유의성 있게 감소시켜 in vitro에서 미백 기능성 성분인 arbutin 보다 더 뛰어난 효과를 나타낸다. 또한 항산화 효과 역시 감초추출물 단독일 때는 미미하였으나 혼합용액은 vitamin C 보다도 뛰어난 효과를 나타내었다. 따라서 백복령, 유백피, 감초 추출물이 뛰어난 효과의 미백기능성 화장품으로의 개발이 기대된다.
- 하지만 축적된 활성산소들과 외부자극이 효과적으로 제거되면 SOD1의 단백질 발현은 다시 정상적인 수준으로 내려간다. 백복령, 감초, 유백피의 혼합물를 처리한 그룹의 SOD-1 단백질 발현을 확인한 결과 SOD-1의 단백질 발현이 농도에 따라 약간 낮게 조절됨을 확인 할 수 있었다. 따라서 감초 단독 추출물과 백복령, 유백피, 감초 추출물 혼합용액의 미백기능 효과를 조사한 결과는 감초추출물을 단독으로 처리할 때 보다 혼합용액이미백 기능 효과가 훨씬 뛰어나며 melanin 생성 초기 단계에 관여하는 단백질인 tyrosinase의 활성을 억제시키고 TRP-1를 유의성 있게 감소시켜 in vitro에서 미백 기능성 성분인 arbutin 보다 더 뛰어난 효과를 나타낸다.
- TRP-1은 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid (DHICA)를 산화시켜 최종적으로 melanin을 생성하는 DHICA oxidase로 melanin 생성에 있어 매우 중요한 역할을 하는 단백질 중 하나이다[18]. 백복령, 감초, 유백피의 혼합물을 B16F1 cell에 처리한 결과 대조 군과 비교하였을 때 TRP-1의 발현을 감소시켰음을 확인하였다. 이는 혼합물로써 작용하는 것이 체내 melanin합성의 항상성을 더 우수하게 유지시킬 수 있다는 것을 기대할 수 있다[17].
- 세포 내에 melanin 생성양을 측정하기 위해 1N NaOH를 이용하여 세포내 melanin을 측정한 결과 Fig. 7에서 보는 바와 같이, 본 실험에서 양성대조군을 사용된 2,000 μg/ml의 arbutin은 melanin 합성을 25%억제 시켰다.
- 이는 혼합물로써 작용하는 것이 체내 melanin합성의 항상성을 더 우수하게 유지시킬 수 있다는 것을 기대할 수 있다[17]. 우리의 결과는 백복령, 유백피, 감초 추출물 혼합용액의 tyrosoinase 활성 저해효과는 tyrosinase의 단백질 발현 수준과는 관계없으나 체내 melanin합성의 항상성유지 및 효소의 활성조절에 관여한다고 나타낸다.
- 이것은 양성대조군인 100 μg/ml의 vitamin C와 비교하였을 때 PGUE의 소거능이 10% 더 높다는 것을 확인 할 수 있었다.
- TBARS를 실시한 결과 각각의 단독 추출물은 눈에 띄는 산화억제능력을 나타내지 않았으나 혼합 용액의 경우 양성대조군으로 사용된 vitamin E와 유사한 지질과산화 억제능력을 보였다. 특히 DPPH radical 소거능과 환원력은 양성 대조군으로 사용된 vitamin C 보다 높은 효과를 나타내었다. 또한 OH radical에 의한 DNA 산화로부터의 보호능력을 확인한 결과 혼합용액의 농도가 증가할수록 DNA 산화를 억제하는 것을 확인 할 수 있었다.
- 감초 추출물의 tyrosinase 활성 억제 효과를 조사해본 결과, 물에 잘 녹지 않는 특성으로 인해 뿌옇게 변하여 흡광도에 영향을 주어 농도에 비례해서 증가하는 양상을 보였다. 하지만 백복령, 유백피, 감초 추출물 혼합용액의 tyrosinase 저해 효과는 뛰어났으며 양성 대조군으로 사용된 arbutin 보다 더 높은 tyrosinase 저해 효과를 나타냈다. Arbutin은 L-tyrosine과 경쟁적으로 작용하는 저해제로서 tyrosinase 활성 부위의 작용을 막아 tyrosine에서 DOPA와 DOPA quinone으로의 진행을 막는다[2].
- 따라서 백복령, 감초, 유백피 추출물의 항산화 효과를 조사한 결과, DPPH radical 소거능력, 지질과산화 억제능력, 환원력 등은 눈에 띄게 뛰어나지 않았다. 하지만 백복령, 유백피, 감초 추출물의 혼합 용액은 백복령 및 감초, 유백피 단독 처리에 비해 항산화 효과가 증가하는 것을 확인하였다. TBARS를 실시한 결과 각각의 단독 추출물은 눈에 띄는 산화억제능력을 나타내지 않았으나 혼합 용액의 경우 양성대조군으로 사용된 vitamin E와 유사한 지질과산화 억제능력을 보였다.
후속연구
- 또한 항산화 효과 역시 감초추출물 단독일 때는 미미하였으나 혼합용액은 vitamin C 보다도 뛰어난 효과를 나타내었다. 따라서 백복령, 유백피, 감초 추출물이 뛰어난 효과의 미백기능성 화장품으로의 개발이 기대된다. 사람의 피부색을 결정하는데 있어 멜라닌은 가장 근본적인 요인이다.
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