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문제 정의
- N-glycanase로서 기존에 여러 식물체에서 유전자 분리가 보고된 PNGase가 식물체의 발달과 분화 과정에서의 생리적 역할에 대하여 거의 연구된 바가 없기 때문에 이를 우선 조사하고자 한다.
- 다음으로는 과육이 숙성되는 노화과정에서 작용하는 caspase-like proteolytic 활성 증가가 나타나게 되는데 이때 관여하는 cysteine protease인 metacaspase type II 유전자의 전사체 양을 조사하여 보았다. Metacaspase는 식물에서 병원균이 감염되었을 때(Hoebericht et al.
- 탈당질화는 식물 세포에서 당단백질을 분해하는 과정으로서 단백질의 접힘 오류가 발생할 때 오류가 생긴 당단백질을 분해하는 과정에서 일어나지만 탈당질화 과정이나 혹은 이의 산물인 N-당사슬이 식물의 분화와 발달이나 생장 등의 생리적 과정에서 작용하는 역할에 대해서는 거의 연구된 바가 없다. 만노오즈의 연쇄결합이 긴 유형의 N-당사슬의 양이 토마토 과육의 숙성 과정에서 증가한다는 연구보고가 있어(Nakamura et al. 2009) PNGase의 생리적 기능을 연구하기 위하여 우선 토마토 과육으로부터 PNGase cDNA를 분리하고자 하였다.
- 이 논문에서는 분자농업에서 의약용단백질 생산에 많이 활용되고 있으며 PNGase의 염기서열 정보가 보고되어 있는 토마토로부터 PNGase의 유전자를 분리한 후 토마토의 과육에서 PNGase의 발현 정도를 분석하였다. 이는 PNGase의 근본적인 작용기작을 이해하는데 많은 도움이 될 것이며, 토마토를 이용한 분자농업에 활발하게 이용될 수 있을 것이다.
제안 방법
- 토마토 게놈(Locus: LOC100316898 [3,613,961 nucleotid (nt) ~ 3,616,373 nt, GenBank accession No. NC_015447)에 위치해 있는 PNGase 유전자 정보를 활용하여 PNGase 특이적 primer를 제작하여 토마토(Solanum lycopersicum L. cv Micro Tom) 잎에서 분리한 total RNA로부터 합성된 cDNA를 주형으로 사용하여 nested PCR을 수행하여 PNGase T의 full length cDNA를 분리하였다(Fig. 1). 분리된 PNGase T의 ORF는 는 총 1,767 bp, 588개의 아미노산으로 이루어져 있었으며 예상된 분자량은 65.
- PCR 조건은 95°C에서 15분 동안 holding 후 95°C에서 30초, 57°C에서 30초, 72°C에서 30초로 45 cycle 반응시킨 후 72°C에서 10 분간 처리하였으며, 95°C에서 65°C까지 0.2°C 간격으로 1초씩melt curve stage를 진행하였다.
- Real time qRT-PCR 분석을 위하여 토마토 열매의 성숙 과정을 6단계의 stage를 나누어 조직을 수확하였는데 1단계는 mature green (MG), 2단계는 Turning (T), 3단계는 Orange (O), 4단계는 Orange-Red (OR), 5단계는 Lignt-Red (LR), 6단계는 Mature Red (MR)로서 구분하였다. 각 단계의 토마토 열매에서 total RNA를 추출하여 cDNA 합성에 사용하였다.
- Strip PCR tube에 iQTM SYBR® Green supermix (2×, Bio-Rad, USA) 10 μl, Forward primer 0.25 μl, Reverse primer 0.25 μl, 합성한 cDNA 1 μl를 넣고 20 μl가 되도록 DEPC로 처리한 멸균수를 첨가하였다.
- cDNA 합성의 주형으로는 1 μg의 total RNA를 사용하였으며, oligo dT primer를 사용하여 1st strand cDNA를 합성하였다.
- 각 단계의 토마토 열매에서 total RNA를 추출하여 cDNA 합성에 사용하였다. qRT-PCR을 이용하여 분석하고자 하는 유전자들의 특이적 primer는 제조사의 제작방법을 이용하여 제작하였고(Tabel 1), real-time qRT-PCR 분석은 Chromo 4TM Continuous Fluorescence Detector (MJ Research, MA, USA)를 이용하여 수행하였다. Strip PCR tube에 iQTM SYBR® Green supermix (2×, Bio-Rad, USA) 10 μl, Forward primer 0.
- 4). 각각의 단계에서 수확된 과육으로부터 total RNA를 분리하여 cDNA를 제조한 후 PNGase T 유전자 특이적 primer를 이용하여 real-time quantitative RT-PCR을 수행하였다.
- 그러나 식물의 발달과 분화 과정에서 PNGase의 발현 조절에 대해서는 거의 알려진 바가 없다. 기존에 보고된 유전적 정보를 활용하여 토마토의 잎에서 제조된 cDNA library에서 nested RT-PCR을 통하여 PNGase T의 유전자(GenBank Accession number KM401550)를 분리하였는데 이의 ORF는 1,767 bp, 588개의 이미노산으로 이루어졌으며, 분자량은 65.8 KDa이었다. PNGase T의 유전자는 토마토 과육에서 높은 수준으로 항시적으로 발현되었으며, 특히 녹색과보다는 오렌지색으로 숙성되는 과정에서 PNGase T의 전사체량이 크게 증가하였다.
- 다음으로는 PNGase T의 발현량이 토마토 과육의 숙성과정에서 크게 증가함으로 토마토 과육의 숙성과정에서 중요한 역할을 하는 식물호르몬인 에틸렌의 생합성에 관여하는 ACC synthase 유전자군과의 발현 패턴과 비교하여 보았다. 토마토의 ACC synthase의 유전자군은 최소한 7개동형의 유전자 이상이 존재할 것으로 여겨진다(Nakatsuka et al.
- 완성된 plasmid를 열충격 방법으로 대장균 DH5α에 도입한 후, 항생제 screening을 거쳐 배양한 다음 plasmid midi kit (Qiagen, Germany)를 사용하여 plasmid를 추출하였다.
- 토마토 과육의 숙성 과정에 따른 PNGase의 역할을 조사하기 위하여 우선 PNGase T 유전자의 발현양을 조사하였다. 우선 토마토(Solanum lycopersicum L. cv Styx TY)의 과육의 성장이 완성된 이후 숙성 정도에 따라 녹색과에서부터 주황색 단계를 거쳐 짙은 주황색을 거쳐 진행된 적숙과로 구분하여 6단계로 나누어 과육을 수확하였다(Fig. 4). 각각의 단계에서 수확된 과육으로부터 total RNA를 분리하여 cDNA를 제조한 후 PNGase T 유전자 특이적 primer를 이용하여 real-time quantitative RT-PCR을 수행하였다.
- 토마토 과육의 숙성 과정에 따른 PNGase의 역할을 조사하기 위하여 우선 PNGase T 유전자의 발현양을 조사하였다. 우선 토마토(Solanum lycopersicum L.
- 합성된 cDNA를 이용하여 토마토 게놈 [Locus: LOC100316898 [3,613,961 nucleotid (nt) ~ 3,616,373 nt, GenBank accession No. NC_015447]에 위치해 있는 PNGase 유전자를 outer primer (forward, 5’-TCTACAGTATATTTTAGTCA-3’; reverse, 5’-AGCTTTAGCAGCAAATGAGTG-3’)와 inner primer (forward, 5’-CCATGGCTATGGCTGCCTCCTCTTCC–3’; reverse, 5’-TCTAGATCAACCAGGAAGAGACCGC-3)를 제조하여 nested PCR 반응을 통하여 증폭하였고 PCR®4-TOPO cloning kit (Invitrogen, USA)를 이용하여 plasmid에 삽입하였다.
대상 데이터
- cv Micro Tom) 잎에서 분리한 total RNA로부터 합성된 cDNA를 전남대학교에서 분양받아 토마토 PNGase 유전자 분리에 사용하였다. Quantitative real time RT-PCR 분석을 위한 재료는 부여 토마토시험장에서 분양받은 토마토(Solanum lycopersicum L. cv Styx TY) 과육으로부터 total RNA를 분리한 후 cDNA를 합성하여 사용하였다.
- Real time qRT-PCR 분석을 위하여 토마토 열매의 성숙 과정을 6단계의 stage를 나누어 조직을 수확하였는데 1단계는 mature green (MG), 2단계는 Turning (T), 3단계는 Orange (O), 4단계는 Orange-Red (OR), 5단계는 Lignt-Red (LR), 6단계는 Mature Red (MR)로서 구분하였다. 각 단계의 토마토 열매에서 total RNA를 추출하여 cDNA 합성에 사용하였다. qRT-PCR을 이용하여 분석하고자 하는 유전자들의 특이적 primer는 제조사의 제작방법을 이용하여 제작하였고(Tabel 1), real-time qRT-PCR 분석은 Chromo 4TM Continuous Fluorescence Detector (MJ Research, MA, USA)를 이용하여 수행하였다.
- 본 실험에서는 토마토(Solanum lycopersicum L. cv Micro Tom) 잎에서 분리한 total RNA로부터 합성된 cDNA를 전남대학교에서 분양받아 토마토 PNGase 유전자 분리에 사용하였다. Quantitative real time RT-PCR 분석을 위한 재료는 부여 토마토시험장에서 분양받은 토마토(Solanum lycopersicum L.
- 1% diethyl pyrocarbonate (DEPC) 증류수에 녹여 spectrophotometer (UV-1601; Shimadzu, Japan)를 이용하여 RNA 순수도 및 양을 확인한 후 실험에 사용할 때까지 -70°C에 보관하였다. 유전자 클로닝 및 유전자 발현 분석을 위해 필요한 1st strand cDNA는 PrimeScript TM1st strand cDNA synthesis kit (Takara Bio Inc. Japan)를 사용하여 합성하였다. cDNA 합성의 주형으로는 1 μg의 total RNA를 사용하였으며, oligo dT primer를 사용하여 1st strand cDNA를 합성하였다.
데이터처리
- 2°C 간격으로 1초씩melt curve stage를 진행하였다. 데이타 분석은 Opticon MonitorTMsoftware version 3.1 (MJ Research, MA, USA)을 이용하여 Applied Biosystems에서 제공한 Delta Delta CT 값을 기준으로 계산하여 비교하였다.
성능/효과
- Metacaspase II의 유전자인 LeMCA 유전자의 전사체 양을 조사하여 보면 역시 녹색과에서는 비교적 낮은 수준이었지만 과육이 숙성되어 노화되어 가는 과정에서 LeMCA의 전사체량이 크게 증가하였다(Fig. 5). 녹색과에서 오렌지색으로 전환되는 시기인 T 시기에 LeMCA의 전사체량이 2.
- 8 KDa이었다. PNGase T의 유전자는 토마토 과육에서 높은 수준으로 항시적으로 발현되었으며, 특히 녹색과보다는 오렌지색으로 숙성되는 과정에서 PNGase T의 전사체량이 크게 증가하였다. 이러한 발현 패턴은 토마토 과육에서 세포죽음의 과정에서 증가하는 단백질 가수분해 효소인 metacaspase의 전사체 증가 페턴과 유사하였으며, 이 시기에는 에틸렌의 생합성 효소 중 노화관련 ACC synthase의 유전자 members (LeACS2, LeACS4, LeACS6)의 발현 패턴과도 유사하였다.
- 4). 그러다가 이후 적색으로 전환되는 과정의 과육에서부터 PNGase T의 전사체 양이 증가하다가 오렌지색의 과육에서 2.3배 이상 증가하여 가장 높은 전사체 양을 보았다. 그러나 이후 적숙과로 이어지는 후숙되는 과정에서 PNGase T의 전사체 양은 점차 감소하였다.
- 기존에 보고된 여러 식물체로부터 분리된 PNGase 유전자를 비교하여 본 결과 아미노산 서열상의 동일성은 castor bean, 포플라, 포도 등과는 약 61 ~ 62%의 동일성을 나타내었으며, 애기장대의 2개의 gene members와는 각각 54%, 38%의 동일성을 나타내었다. 벼의 2개의 PNGase의 gene members와는 50%, 43%의 동일성을 나타내었다.
- 기준 유전자로 actin 유전자를 이용하여 비교한 PNGase T의 상대적 발현량을 보면 녹색과에서는 다른 유전자들에 비하여 비교적 높은 수준으로 항시적으로 발현되는 양상을 나타내었다(Fig. 4). 그러다가 이후 적색으로 전환되는 과정의 과육에서부터 PNGase T의 전사체 양이 증가하다가 오렌지색의 과육에서 2.
- 따라서 PNGase T의 전사체 발현량의 패턴은 세포 죽음과 관련된 가수분해 효소인 metacaspase의 전사체 발현과 과육의 숙성 및 노화와 관련된 ACC synthase의 유전자군의 발현과 유사한 패턴을 나타내는 것으로 보아 PNGase T는 식물체에서 노화 특이적으로 발현되는 유전자인 것으로 사료된다. 따라서 식물체 내에서 생성된 거대분자로서의 당단백질을 분해하는 효소로서도 작용하는 것으로 여겨진다.
- 다른 외떡잎 식물인 수수와 옥수수와 PNGase와는 42% 정도의 동일성을 나타내었다. 따라서 총 10종의 식물체로부터 분리된 12개의 PNGase 유전자의 단백질 서열을 분석한 계통수를 보면 PNGase T는 역시 PNGase-Le와 가장 높은 유연관계를 나타내었고 다음으로는 포도의 PNGase와 비교적 높은 유연관계를 나타내었다(Fig. 3).
- 이러한 발현 패턴은 토마토 과육에서 세포죽음의 과정에서 증가하는 단백질 가수분해 효소인 metacaspase의 전사체 증가 페턴과 유사하였으며, 이 시기에는 에틸렌의 생합성 효소 중 노화관련 ACC synthase의 유전자 members (LeACS2, LeACS4, LeACS6)의 발현 패턴과도 유사하였다. 따라서 토마토 과육에서 PNGase T의 유전자 발현은 거대분자가 분해되는 시기에서 과육의 숙성과 노화 과정에서 특이적인 생리적 기능을 나타내는 것으로 판단된다. 향 후 고가의 의약용 재조합단백질의 면역부작용을 완화하기 위하여 식물체 유래의 당단백질의 탈당질화과정에서 PNGase T를 활용함으로써 식물생명공학 분야에서 활용가치가 높을 것으로 사료된다.
- 1). 분리된 PNGase T의 ORF는 는 총 1,767 bp, 588개의 아미노산으로 이루어져 있었으며 예상된 분자량은 65.8 kDa이었으며, 예상된 pI 값은 8.69로 조사되었다.
- 6). 이중 기준 유전자인 actin 유전자와 비교한 상대적인 발현량이 가장 높은 동형의 유전자는 LeACS2 이었으며, LeACS4와 LeACS6인 것으로 나타났다. 이는 이들 세포내에서 노화 특이적인 ACC synthase의 유전자군과 함께 거대분자의 가수분해가 수반되는 노화과정에서 특이적으로 발현이 증가하는 ACC synthase의 유전자군과 발현 패턴이 유사하였다.
- 4배로 크게 증가하였다. 이후 점차 감소하였지만 적숙과에서 비교적 높은 수준의 LeMCA 전사체량을 보였다.
- 그러나 이후 적숙과로 이어지는 후숙되는 과정에서 PNGase T의 전사체 양은 점차 감소하였다. 전사체의 양에서 지속적으로 감소가 일어났음에도 불구하고 충분하게 숙성이 된 적숙과에서는 PNGase T의 전사체 양이 녹색과에 비하여 1.7배 높았다.
- 토마토 과육이 녹색과에서 적숙과까지 숙성과 함께 노화되는 과정의 6단계에서 조사하기 위하여 qRT-PCR을 수행하여 보면 녹색과에서는 LeACS2, LeACS4, LeACS6 모두 녹색과에서는 거의 발현이 이루어지지 않다가 점차 숙성이 진행되면서 오렌지과 상태에서 3가지 동형의 유전자가 모두 가장 높은 전사체량을 나타내었다(Fig. 6). 이중 기준 유전자인 actin 유전자와 비교한 상대적인 발현량이 가장 높은 동형의 유전자는 LeACS2 이었으며, LeACS4와 LeACS6인 것으로 나타났다.
후속연구
- 2007). 그러나 AtPNG1은 세포질에 존재하는 transglutaminase-like superfamily에 속하는 단백질로서(Suzuki et al. 2002) N-당질화 부위를 절단함으로써 ER AD 과정을 통하여 단백질의 3차구조의 정확성을 유지하는데 관여한다고 보고되었지만 실제 식물체 내에서 ERAD 과정에서 N-glycanase의 역할을 할지에 대해서는 더욱 많은 연구가 필요하다. AtPNG1과 PNGase는 peptide-N(4)-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) asparagine amidase로 알려져 있지만 서로 염기서열의 동일성이 존재하지 않는 동형의 유전자로 여겨진다.
- 이러한 결과는 protease 일종인 metacaspase의 유전자 발현 패턴과 PNGase T의 발현 패턴이 모두 오렌지과 상태에서 가장 높은 전사체 량을 유지하는 점에서 서로 유사하였다. 따라서 PNGase T에 의해 당사슬이 절단되는 과정이 당단백질이나 그 외의 단백질 분자들이 노화나 PCD 등의 과정에서 분해되기 위해 일어나는 과정인지 혹은 이의 생성물인 당사슬이 어떤 의미있는 생리적 역할의 필요에 의해 일어나는 과정인지에 대한 보다 심도 깊은 연구가 필요할 것으로 여겨졌다.
- 따라서 재조합 단백질을 생산하는 분자농업 과정에서 의학용 고부가가치 단백질을 생산하기 위하여 인체에서의 면역 부작용을 초래할 가능성이 있는 아스파라긴산 잔기에 부착되어 있는 당사슬을 제거하기 위해서 PNGase를 활용할 때 PNGase가 식물의 노화를 유도할 가능성이 있어 PNGase 생산을 위한 재조합 단백질 생산용 식물체를 제조할 때 생산시기에 특이적으로 유도하여 발현되는 유도 프로모터를 사용하는 것이 더 바람직할 것이다.
- 또한 다른 활용방안으로는 특정 시기에 발현되는 특이적 프로모터를 사용하여 일차적으로 형질전환함으로써 PNGase 발현 유도 작물을 제조한 후 이에 다시 특정 의학용 재조합 단백질 유전자를 도입하여 PNGase와 특정 의약용 단백질을 동시에 발현되는 식물체를 제조한다면 단백질 분리 후 N-당사슬을 제거하는 공정을 생략할 수 있을 것이며, 이는 재조합단백질의 처리 공정을 단순화시켜 보다 경제적으로 의학용 재조합 단백질을 생산할 수 있을 것이다.
- 이 논문에서는 분자농업에서 의약용단백질 생산에 많이 활용되고 있으며 PNGase의 염기서열 정보가 보고되어 있는 토마토로부터 PNGase의 유전자를 분리한 후 토마토의 과육에서 PNGase의 발현 정도를 분석하였다. 이는 PNGase의 근본적인 작용기작을 이해하는데 많은 도움이 될 것이며, 토마토를 이용한 분자농업에 활발하게 이용될 수 있을 것이다. 즉, 토마토의 과육에서 PNGase의 활성이 높은 시점에서 분리 정제된 재조합단백질은 비교적 당질화 정도나 낮아졌을 가능성이 있어 추가적인 탈당질화 과정을 수행하지 않아도 될 것을 가정해 볼 수 있다.
- 따라서 토마토 과육에서 PNGase T의 유전자 발현은 거대분자가 분해되는 시기에서 과육의 숙성과 노화 과정에서 특이적인 생리적 기능을 나타내는 것으로 판단된다. 향 후 고가의 의약용 재조합단백질의 면역부작용을 완화하기 위하여 식물체 유래의 당단백질의 탈당질화과정에서 PNGase T를 활용함으로써 식물생명공학 분야에서 활용가치가 높을 것으로 사료된다.
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