산겨릅나무 줄기 추출물의 항당뇨, 알코올 대사 효소 및 간 보호 활성 Anti-Diabetic, Alcohol Metabolizing Enzyme, and Hepatoprotective Activity of Acer tegmentosum Maxim. Stem Extracts원문보기
본 연구에서는 간질환 치료제로 알려진 산겨릅나무 줄기 추출물의 새로운 기능성 소재로서의 개발을 위하여 생리활성을 탐색하였다. 산겨릅나무 열수 추출물의 총 페놀 함량은 198 mg tannic acid equivalents/g으로 나타났다. 항산화활성은 DPPH 및 SOD 활성 측정 방법을 이용하여 분석하였으며, 산겨릅나무 열수 추출물의 농도 0.5 mg/mL에서 각각 89%와 82%의 활성을 나타내었다. 산겨릅나무 추출물의 혈당 강하 효과는 ${\alpha}-glucosidase$ 활성 억제 효과를 측정하였으며, 추출물 $50{\mu}g/mL$ 농도에서 75%의 억제 효과를 나타내었다. 이러한 결과는 지금까지 항당뇨 소재로 사용된 약용작물보다 높은 항당뇨 효과가 있는 것으로 사료된다. 알코올 분해 효소alcohol dehydrogenase 및 aldehyde dehydrogenase 활성 촉진 효과는 농도 의존적으로 증가하였으며 5 mg/mL 농도에서 각각 260%와 123%를 나타내었다. Lipopolysaccharide에 의하여 유도된 nitric oxide(NO) 합성은 1 mg/mL 농도의 산겨릅나무 추출물을 처리함으로써 NO 합성률이 16.7% 정도 감소하였다. 산겨릅나무 추출물이 tacrine으로 유도된 Hep G2 세포주에 대하여 유의한 보호 활성을 나타냈다. 이러한 결과들은 산겨릅나무 추출물이 우수한 항당뇨, 항염증 효과 및 간세포 보호 효과가 높은 것으로 나타나 기능성 소재로서의 활용 가능성을 확인하였다.
본 연구에서는 간질환 치료제로 알려진 산겨릅나무 줄기 추출물의 새로운 기능성 소재로서의 개발을 위하여 생리활성을 탐색하였다. 산겨릅나무 열수 추출물의 총 페놀 함량은 198 mg tannic acid equivalents/g으로 나타났다. 항산화활성은 DPPH 및 SOD 활성 측정 방법을 이용하여 분석하였으며, 산겨릅나무 열수 추출물의 농도 0.5 mg/mL에서 각각 89%와 82%의 활성을 나타내었다. 산겨릅나무 추출물의 혈당 강하 효과는 ${\alpha}-glucosidase$ 활성 억제 효과를 측정하였으며, 추출물 $50{\mu}g/mL$ 농도에서 75%의 억제 효과를 나타내었다. 이러한 결과는 지금까지 항당뇨 소재로 사용된 약용작물보다 높은 항당뇨 효과가 있는 것으로 사료된다. 알코올 분해 효소 alcohol dehydrogenase 및 aldehyde dehydrogenase 활성 촉진 효과는 농도 의존적으로 증가하였으며 5 mg/mL 농도에서 각각 260%와 123%를 나타내었다. Lipopolysaccharide에 의하여 유도된 nitric oxide(NO) 합성은 1 mg/mL 농도의 산겨릅나무 추출물을 처리함으로써 NO 합성률이 16.7% 정도 감소하였다. 산겨릅나무 추출물이 tacrine으로 유도된 Hep G2 세포주에 대하여 유의한 보호 활성을 나타냈다. 이러한 결과들은 산겨릅나무 추출물이 우수한 항당뇨, 항염증 효과 및 간세포 보호 효과가 높은 것으로 나타나 기능성 소재로서의 활용 가능성을 확인하였다.
This study was carried out to investigate the antidiabetic, alcohol metabolism, anti-inflammatory, and hepatoprotective effects of Acer tegmentosum extracts (ATE). A. tegmentosum has been traditionally used as a folk medicine to treat hepatic disorders. The antioxidative activities of ATE were measu...
This study was carried out to investigate the antidiabetic, alcohol metabolism, anti-inflammatory, and hepatoprotective effects of Acer tegmentosum extracts (ATE). A. tegmentosum has been traditionally used as a folk medicine to treat hepatic disorders. The antioxidative activities of ATE were measured by using 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity and superoxide (SOD) assay. DPPH radical scavenging and SOD activities of ATE were about 89% and 82.9% at $0.5{\mu}g/mL$, respectively. Alcohol dehydrogenase and acetaldehyde dehydrogenase activities were 118.0% and 177% at 2 mg/mL, respectively. ${\alpha}-Glucosidase$ inhibitory activity of ATE was 75% higher at $50{\mu}g/mL$ and remarkably increased in a dose-dependent manner. Nitric oxide productions in macrophage RAW 264.7 cells stimulated by lipopolysaccharide was reduced to 16.7% by addition of ATE at 1 mg/mL. ATE showed significant protective effects against tacrine-induced cytotoxicity in Hep G2 cells at $100{\mu}g/mL$. Based on our results, we conclude that ATE may be used as a major pharmacological agent and anti-diabetic, anti-hepatitis, and anti-inflammatory remedy.
This study was carried out to investigate the antidiabetic, alcohol metabolism, anti-inflammatory, and hepatoprotective effects of Acer tegmentosum extracts (ATE). A. tegmentosum has been traditionally used as a folk medicine to treat hepatic disorders. The antioxidative activities of ATE were measured by using 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity and superoxide (SOD) assay. DPPH radical scavenging and SOD activities of ATE were about 89% and 82.9% at $0.5{\mu}g/mL$, respectively. Alcohol dehydrogenase and acetaldehyde dehydrogenase activities were 118.0% and 177% at 2 mg/mL, respectively. ${\alpha}-Glucosidase$ inhibitory activity of ATE was 75% higher at $50{\mu}g/mL$ and remarkably increased in a dose-dependent manner. Nitric oxide productions in macrophage RAW 264.7 cells stimulated by lipopolysaccharide was reduced to 16.7% by addition of ATE at 1 mg/mL. ATE showed significant protective effects against tacrine-induced cytotoxicity in Hep G2 cells at $100{\mu}g/mL$. Based on our results, we conclude that ATE may be used as a major pharmacological agent and anti-diabetic, anti-hepatitis, and anti-inflammatory remedy.
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문제 정의
Tacrine은 알츠 하이머 치료제로 사용되었으나, 간 독성을 나타내어 현재는 간세포 보호 효과 실험에 사용되고 있다. 본 연구에서는 tacrine으로 독성을 유발한 간암세포 유래의 Hep G2 세포주를 대상으로 산겨릅나무 추출물의 세포생존율에 대한 증가여부를 관찰하고 간암 세포주에 미치는 독성 및 간 보호 효과를 확인하였다. 먼저 tacrine이 간암 세포주에 미치는 효과를 조사한 후 tacrine과 산겨릅나무 추출물을 함께 처리하였을 때 세포의 생장이 tacrine만을 처리하였을 때보다 더 증가하였음을 확인하였다(P<0.
본 연구에서는 산겨릅나무 줄기의 열수 추출물의 항당뇨 활성과 알코올 분해능, 항염증 및 간 보호 효과에 대한 생리 활성을 조사하여 새로운 소재로의 가능성을 검토하고자 연구를 수행하였다.
제안 방법
ADH 효소 활성 측정은 Choi 등(26)과 Racker(27)의 방법을 변형하여 수행하였으며, 생성된 NADH의 양을 340 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시험관에 alcohol 0.
NO 소거 활성은 마우스의 대식세포 세포주인 RAW 264.7 세포를 배양판에 1.0×105 cells/mL의 세포가 되도록 분주하여 LPS 자극 하에 24시간 배양하고, 그 배양 상층액 내의 NO의 생성은 Griess 반응으로 세포 상등액에 축적되는 nitrite 양으로 측정하였다(29).
SOD 활성은 SOD assay kit(Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD, USA)을 사용하여 manufacturer's instruction에 기술된 방법에 따라서 수행하였다.
간세포 보호 효과 연구를 위해 많이 사용되는 Hep G2(간암 세포주) 세포를 이용하여 산겨릅나무 추출물의 간세포 보호 효과를 in vitro assay로 확인하였다. Tacrine은 알츠 하이머 치료제로 사용되었으나, 간 독성을 나타내어 현재는 간세포 보호 효과 실험에 사용되고 있다.
건조시킨 산겨릅나무 줄기 100 g을 autoclave를 이용하여 100°C에서 2시간씩 2회 반복 추출하였으며, 추출물은 Whatman No. 2 filter paper(Whatman International Ltd., Maidstone, UK)로 여과한 후 rotary evaporator(EYELA N-1000, Rikakikai Co., Tokyo, Japan)로 농축하였다.
cells/well의 농도로 각 well에 분주하였다. 그리고 tacrine(Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, TX, USA) 및 다양한 농도의 산겨릅나무 줄기 추출물을 동시에 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 24시간의 배양 후 EZ-Cytox Cell viability assay solution WST-1® (Daeil Lab Service, Seoul, Korea)을 각 well에 넣고 37°C, 5% CO2 incubator에서 3시간 동안 반응시킨 다음 ELISA reader를 이용하여 460 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
대장균 LPS를 대식세포에 처리하여 NO를 유도시킨 다음 산겨릅나무 열수 추출물을 대식세포에 처리하여 NO 활성에 미치는 영향을 분석하였다(Fig. 5A). LPS에 의하여 유도된 대식세포의 NO 합성은 산겨릅나무 추출물의 농도가 증가할 수록 감소하였고, 추출물의 농도 1.
1 mL를 첨가하여 25°C 항온수조에서 5분간 반응시킨 후 340 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다. 대조구는 시료 대신 TE buffer(pH 8.0)를 첨가하여 상대 활성(%)으로 나타내었고, positive control과 활성 측정은 ADH 활성 측정식과 동일한 식을 사용하였다.
약용식물에 널리 분포되어 있는 폴리페놀 화합물들은 다양한 기능을 하는 phytochemical로서 항산화, 항돌연변이 및 phytoestrogen 효과 등의 생리활성이 있는 것으로 알려져 있다(22,30). 본 연구에서는 산겨릅나무 열수 추출물의 총 페놀 함량을 tannic acid 표준 곡선으로부터 측정하였다. 산겨릅나무 열수 추출물의 총 페놀 함량은 198 mg TAE/g으로 높게 나타났다(Table 1).
산겨릅나무 줄기 추출물의 전자공여능은 Blois(24)의 방법을 약간 변형하여 DPPH에 대한 수소공여 효과로 측정하였다. 96-well plate에 시료와 0.
산겨릅나무 추출물의 숙취 해소능을 분석하기 위해서 체내 알코올 대사 1차 효소인 ADH 활성 및 acetaldehyde를 분해하는 ALDH 활성에 대한 산겨릅나무 열수 추출물의 영향을 분석하였다(Fig. 4A, 4B). 알코올 분해와 숙취에 효과가 있는 것으로 알려진 Hepos를 대조구(positive control)로 하여 추출물의 활성을 분석한 결과 농도 의존적으로 증가하였다(P<0.
24시간의 배양 후 EZ-Cytox Cell viability assay solution WST-1® (Daeil Lab Service, Seoul, Korea)을 각 well에 넣고 37°C, 5% CO2 incubator에서 3시간 동안 반응시킨 다음 ELISA reader를 이용하여 460 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 성장 상태는 현미경을 사용하여 확인하였다.
세포의 성장과 cell viability를 확인하기 위해 96-well cell culture plate(SPL Lifesciences)에 Hep G2 세포를 배지 100 μL에 1×104 cells/well의 농도로 각 well에 분주하였다.
시료에 대한 대조군으로 10 μg/mL의 LPS를 처리하여 활성화를 유도한 세포를 사용하였다.
시험관에 alcohol 0.1 mL, NAD 수용액(2 mg/mL) 0.5 mL 및 시료 0.1 mL를 첨가하고 10 mM glycine-NaOH buffer(pH 8.8)를 총 부피가 1.8 mL가 되게 조절한 후 25°C 항온수조에서 10분간 반응시키고, ADH(10 unit/mL)를 가하여 340 nm에서 spectrophotometer(Amersham Pharmacia Biotech, Cambridge, UK)를 이용하여 흡광도의 변화를 측정하였다.
4 mM DPPH 용액을 1:4 비율로 혼합하여 37°C에서 30분간 반응시킨 후, ELISA reader(Versa Max Microplate Reader, Molecular Device, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능(electron donating ability, EDA)은 시료를 첨가하지 않은 대조구와 흡광도 차를 비교하여 free radical의 제거 활성을 백분율로 나타내었다.
대상 데이터
8 mL가 되게 조절한 후 25°C 항온수조에서 10분간 반응시키고, ADH(10 unit/mL)를 가하여 340 nm에서 spectrophotometer(Amersham Pharmacia Biotech, Cambridge, UK)를 이용하여 흡광도의 변화를 측정하였다. 대조구는 시료 대신 증류수를 첨가하였으며, positive control로 사용한 Hepos는 약국에서 구입하여 처방전에 따라 1/2로 희석하여 사용하였다. ADH의 활성은 다음과 같은 식으로 상대적인 백분율로 계산하였다.
본 연구에 사용한 산겨릅나무(Acer tegmentosum Maxim.) 줄기는 강원도로부터 구입하여 시료로 사용하였다. 건조시킨 산겨릅나무 줄기 100 g을 autoclave를 이용하여 100°C에서 2시간씩 2회 반복 추출하였으며, 추출물은 Whatman No.
실험에 사용한 간암세포인 Hep G2는 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 구입하였으며 세포의 배양을 위해 10% heat-inactivated fetal bovine serum 및 100 U/mL penicillin과 100 μg/mL streptomycin이 첨가된 MEM(Cellgro by Mediatech, Inc., Manassas, VA, USA) 배지를 이용하여 37°C, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
데이터처리
실험 결과는 통계 SAS package(Version 9.1, Statistical Analysis System, Chicago, IL, USA)를 사용하여 각 시료의 평균과 표준편차를 사용하였고, 분산분석(ANOVA)과 Duncan's multiple range test를 실시하여 α=0.05 수준에서 유의차를 검정하였다.
이론/모형
NO release was measured using the method of Griess (nitrite). Cytotoxicity was determined by MTT assay. Results are presented as means±SD of three independent experiments.
7 cells were cultured for 24 h with various concentration of PBE in the presence of LPS (10 μg/mL). NO release was measured using the method of Griess (nitrite). Cytotoxicity was determined by MTT assay.
산겨릅나무 줄기 추출물의 α-glucosidase 활성 억제 효과 측정은 Tibbot와 Skadsen(25)의 방법에 따라 측정하였다.
세포독성 실험은 mitochondrial dehydrogenase activity의 index를 나타내는 MTT calorimetric reduction assay법으로 추출물이 세포생존율에 미치는 영향을 측정하였다. 96-well microtiter plate(SPL Lifesciences, Gyeonggi, Korea)에 RAW 264.
총 폴리페놀 함량은 Folin-Ciocalteu 법(18)을 약간 변형시켜 측정하였으며 표준물질로 tannic acid(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 사용하여 분석하였다. 일정 농도의 산겨릅나무 줄기 추출물을 시험관에 취한 후 FolinCiocalteu reagent 1 mL를 가하여 잘 혼합하고 3분간 실온에서 반응시켰다.
성능/효과
5A). LPS에 의하여 유도된 대식세포의 NO 합성은 산겨릅나무 추출물의 농도가 증가할 수록 감소하였고, 추출물의 농도 1.0 mg/mL에서 NO 합성은 83.3%로 현저히 감소되었다. 이러한 결과는 산겨릅나무 추출물의 항염증 효능이 높은 것으로 나타나고 있다.
6B). Tacrine을 처리하였을 경우에는 세포의 모양이 전체적으로 응축되어 있고 본래의 모양을 갖추지 못한 반면에, 산겨릅나무 추출물만을 처리하였거나 tacrine 및 산겨릅나무 추출물을 함께 처리한 경우에는 아무것도 처리하지 않은 대조군의 세포와 비슷한 모양을 나타내거나 더 증식한 것을 확인할 수 있었다.
5B). 또한 실험 결과에 나타난 NO의 생성량의 변화가 세포독성에 의한 영향과는 무관함을 확인할 수 있었다.
먼저 tacrine이 간암 세포주에 미치는 효과를 조사한 후 tacrine과 산겨릅나무 추출물을 함께 처리하였을 때 세포의 생장이 tacrine만을 처리하였을 때보다 더 증가하였음을 확인하였다(P<0.05, Fig. 6A) 이러한 결과는 산겨릅나무 추출물이 간세포에 있어 독성에 의한 손상에 대해 보호 효과가 있는 것으로 사료된다.
05). 산겨릅나무 추출물의 ADH 활성은 5 mg/mL 농도에서 약 254.2%로 대조구에 비해 높게 나타났지만, ALDH 활성은 같은 농도에서 약 126.3%로 대조구인 Hepos 보다 다소 낮게 나타났다. 이러한 결과는 산겨릅나무 추출물이 에탄올을 acetaldehyde로 분해하는 ADH 활성은 높지만 상대적으로 ALDH 활성은 매우 낮은 것으로 나타났다.
세포독성 실험은 MTT 분석을 통해서 측정하였으며 산겨릅나무 추출물로 처리된 대식세포의 세포생존율이 90% 정도를 나타내어 세포독성은 거의 없는 것으로 관찰되었다(Fig. 5B). 또한 실험 결과에 나타난 NO의 생성량의 변화가 세포독성에 의한 영향과는 무관함을 확인할 수 있었다.
알코올 분해와 숙취에 효과가 있는 것으로 알려진 Hepos를 대조구(positive control)로 하여 추출물의 활성을 분석한 결과 농도 의존적으로 증가하였다(P<0.05).
3%로 대조구인 Hepos 보다 다소 낮게 나타났다. 이러한 결과는 산겨릅나무 추출물이 에탄올을 acetaldehyde로 분해하는 ADH 활성은 높지만 상대적으로 ALDH 활성은 매우 낮은 것으로 나타났다. 이에 반해 Hepos의 ADH 및 ALDH의 활성은 별다른 차이를 보이지 않았다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
염증은 무엇에 의해 생성되는가?
간의 주요한 병태 생리적인 증상이나 간질환은 염증반응에 의해서 야기되기 때문에 항염증 연구는 중요하다(19). 염증은 많은 염증 유도 cytokines, prostaglandin E2(PGE2), inducible nitric oxide synthase(iNOS) 및 cyclooxygenase-2(COX-2)에 의해서 생성된다. 특히 iNOS는 interferon-γ, lipopolysaccharide(LPS) 및 다양한 염증 유도 cytokines에 노출되는 경우에만 발현된다(20).
민간에서 산겨릅나무를 부르는 이름은?
산겨릅나무(Acer tegmentosum Maxim.)는 단풍나무과(Aceraceae)의 낙엽 소교목으로 민간에서는 벌나무 혹은 산청목으로 불리며, 항산화 활성 및 간질환에 효능이 있어 식용 및 약용 소재로 활용 가능성이 매우 높은 것으로 알려져 있다(1,2). 산겨릅나무에 대한 연구는 줄기와 수피 등 추출물의 유효성분 분석 및 항산화 작용에 대한 연구가 주로 수행되었으며, 산겨릅나무의 유효성분은 다양한 페놀성 화합물(1,3), isoprenoid 화합물(4), phenolic glycoside(5) 및 salidroside(6) 등이 존재하며 항산화 작용은 매우 높은 것으로 알려져 있다(1,3,7).
inducible nitric oxide synthase는 어떤 경우에 발현되는가?
염증은 많은 염증 유도 cytokines, prostaglandin E2(PGE2), inducible nitric oxide synthase(iNOS) 및 cyclooxygenase-2(COX-2)에 의해서 생성된다. 특히 iNOS는 interferon-γ, lipopolysaccharide(LPS) 및 다양한 염증 유도 cytokines에 노출되는 경우에만 발현된다(20). 이러한 nitric oxide(NO) 합성은 세균을 죽이거나 종양을 제거하는 중요한 역할을 하지만 병리적인 원인에 의해서 과도한 NO 형성은 염증을 유발시켜 조직의 손상, 유전자 변이 및 신경 손상 등을 유발한다(21).
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