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문제 정의
- 본 연구에서는 천연에 광범위하게 존재하는 성분인 caffeic acid에 대해서 배의 polyphenol oxidase를 활용하여 간편한 효소적 산화반응을 유도하고 neolignan 및 관련 화합물을 생합성하였으며 이들 얻어진 화합물에 대해서 강한 pancreatic lipase 저해 활성을 확인하였기에 그 결과를 보고하고자 한다.
가설 설정
- 2)Orlistat was used as a positive control.
제안 방법
- 이동상 용매로는 10% HCOOH(solvent A)와 acetonitrile(solvent B)을 사용하여 gradient elution을 다음과 같이 수행하였다. 0~1 min, 90% A; 2~40 min, 10% A, 90% B로 물질 분석 및 분리를 하였으며, 이동상의 유속은 1.0 mL/min을 유지하였고 280 nm에서 화합물을 검출하였다. 분리한 화합물을 caffeic acid 반응 생성물과 분석하여 phellinsin A(2)(tR 12.
- 1H, 13C NMR과 1H－1H COSY, NOESY, HSQC, HMBC 스펙트럼은 CD3OD 용매 (δH 3.35, δC 49.0)를 이용하여 600 MHz FT-NMR spectrometer( Varian VNS600, Palo Alto, CA, USA)로 측정하였으며, 분석 및 column chromatography용 용매는 특급시약을 사용하였다.
- 4종의 순수 분리 화합물에 대해서 1H, 13C NMR 및 DEPT, 1H－1H COSY, HMBC, HMQC, OESY 등의 2D NMR, MS, CD 스펙트럼을 측정 후 문헌치(27-29)와 비교하여 화합물 2는 phellinsin A, 화합물 3은 caffeicinic acid, 화합물 4는 isocaffeicinic acid, 화합물 5은 7,8-erythro-caffeicin으로 동정하였다.
- 8 μg/mL)을 확인하였으며, 이는 caffeic acid와 비교하였을 경우 활성이 상승함을 알 수 있었다. Caffeic acid 산화반응물에 대해서 C18 겔을 활용한 column chromatography를 수행하여 4종의 리그난 화합물을 분리하였고, 각 화합물의 화학구조는 NMR 스펙트럼 데이터 해석 및 표품과의 HPLC 직접 비교를 통하여 phellinsin A(2), caffeicinic acid(3), isocaffeicinic acid(4), 7,8-erythro-caffeicin(5)으로 동정하였다. 이들 화합물중 phellinsin A(2)는 IC50 값이 66.
- EtOAc 가용분획 100 mg을 YMC gel ODS AQ 120S(1.1 cm i.d.×38 cm)를 이용한 칼럼크로마토그래피를 수행하여 phellinsin A(2)(21.2 mg; 2.4%), caffeicinic acid(3)(8.5 mg; 1.7%), isocaffeicinic acid(4)(6.7 mg; 1.3%), 7,8-erythro-caffeicin(5)(7.3 mg; 1.5%)을 순수 분리하였다 (Fig. 1).
- Pancreatic lipase 저해 활성 측정은 Kim 등(26)이 행한 방법을 변형하여 실시하였다. Enzyme buffer(10 mM MOPS, 1 mM EDTA, pH 6.
- 현재 시판중인 비만치료제로서 orlistat(상품명: Xenical)은 triglyceride를 분해하는 역할의 췌장 지방분해효소인 lipase에 비가역적인 결합을 하여 불활성화시킴으로써 triglyceride 및 cholesterol의 흡수를 적절히 감소시킴과 동시에 배설시키는 기작으로 항비만 효능을 나타내는 것이 알려져 있으나 복부고통 및 설사 등의 부작용이 문제시되고 있어(9), 이들 부작용이 없는 천연 항비만 소재 개발을 위한 연구가 활발하게 이루어지고 있다(11). Pancreatic lipase 저해 활성을 나타낸 배 유래 polyphenol oxidase 활용 caffeic acid 산화반응물에 대해서 EtOAc 분획 후 그 가용부에 대해서 ODS 칼럼크로마토그래피를 이용한 물질의 분리 및 정제를 수행하였다. 얻어진 화합물의 구조는 furan-type 리그난(2) 1,4-benzodioxane- type 네오리그난(3~5)으로 구조를 결정하였으며, 입체구조에 대해서도 기기분석의 결과를 통하여 결정하였다.
- 얻어진 결과물인 효소원 200 mL와 500 mg의 caffeic acid를 50 mL EtOH에 용해하여 실온에서 2시간 반응한다. 반응물은 필터 후 reversed-phase HPLC를 활용하여 반응을 관찰하였다. 반응물은 감압 농축 후 300 mL의 10% MeOH로 희석 하여 300 mL의 ethyl acetate(EtOAc)로 3회 분획하여 EtOAc 가용부(470 mg)를 얻었다.
- 본 연구에서 항비만 소재의 개발을 위해 배 유래의 polyphenol oxidase를 활용한 caffeic acid의 산화 생성물에 대해서 pancreatic lipase에 대한 저해 활성을 평가한 결과 161.2±2.8 μg/mL의 우수한 IC50 값을 나타내어, ODS gel을 이용한 column chromatography를 수행하여 4종의 caffeic acid oligomer를 분리하였으며 분리한 단일물질에 대해서 지방분해효소인 pancreatic lipase에 대한 저해 활성을 평가하였다(Table 2).
- 반응물은 감압 농축 후 300 mL의 10% MeOH로 희석 하여 300 mL의 ethyl acetate(EtOAc)로 3회 분획하여 EtOAc 가용부(470 mg)를 얻었다. 얻어진 EtOAc 가용부에 대해서 지방분해효소 저해 활성을 평가하였고 활성물질 동정을 위한 분리를 실시하였다.
- Pancreatic lipase 저해 활성을 나타낸 배 유래 polyphenol oxidase 활용 caffeic acid 산화반응물에 대해서 EtOAc 분획 후 그 가용부에 대해서 ODS 칼럼크로마토그래피를 이용한 물질의 분리 및 정제를 수행하였다. 얻어진 화합물의 구조는 furan-type 리그난(2) 1,4-benzodioxane- type 네오리그난(3~5)으로 구조를 결정하였으며, 입체구조에 대해서도 기기분석의 결과를 통하여 결정하였다. 얻어진 순수한 화합물에 대해서 pancreatic lipase 저해 능을 평가하였고, 그중에서도 furan-type 리그난인 phellinsin A(2)가 66.
- 흡광도 측정을 위한 spectrophotometer는 Infinite F200 (Tecan Austria GmBH, Grödig, Austria)을 사용하였다.
대상 데이터
- Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. HPLC는 Shimadzu LC-10A(Tokyo, Japan)를 사용하였다. 1H, 13C NMR과 1H－1H COSY, NOESY, HSQC, HMBC 스펙트럼은 CD3OD 용매 (δH 3.
- , Kyoto, Japan)를 이용하여 순수 물질 분리를 하였다. 발색시약으로는 vanillin-sulfuric acid 시액, 10% sulfuric acid 시액을 사용하였고, TLC spot 검출 시 UV lamp의 파장은 254 및 360 nm를 사용하였다. 흡광도 측정을 위한 spectrophotometer는 Infinite F200 (Tecan Austria GmBH, Grödig, Austria)을 사용하였다.
데이터처리
- 실험 결과는 SPSS package program(version 20.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 평균과 표준편차를 구하였으며 실험군 간 차이의 유의성은 one-way ANOVA와 Student t-test에 의하여 P<0.05 수준에서 검증하였다.
성능/효과
- 또한 1,4-benzodioxane-type 네오리그난 중에서는 caffeicinic acid(3)가 109.6±3.7 μM의 IC50 값을 나타내었으며, 구조 이성질체인 isocaffeicinic acid(4)가 158.4±3.2 mM의 IC50 값을 나타냄을 확인하였다.
- 7 μM의 저해능을 나타내었다. 배에 존재하는 polyphenol 산화효소에 의해 생합성된 caffeic acid 이량체가 pancreatic lipase 저해 활성 물질임을 확인하였으며, 이들 활성은 caffeic acid가 결합 양상에 따른 화합물의 구조에 따라 다름이 시사되었다. 향후 이들 활성물질의 활성 기작에 대한 연구가 필요하며 본 연구 결과는 보다 우수한 pancreatic lipase 저해능을 가지는 새로운 선도화합물 발굴을 위한 기초자료로 이용될 수 있을 뿐만 아니라 항비만 물질의 상업화를 위한 기초자료로 이용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 0 mL/min을 유지하였고 280 nm에서 화합물을 검출하였다. 분리한 화합물을 caffeic acid 반응 생성물과 분석하여 phellinsin A(2)(tR 12.2 min), caffeicinic acid(3)(tR 13.2 min), isocaffeicinic acid(4)(tR 13.9 min), 7,8-erythro-caffeicin(5)(tR 14.3 min)에서 존재하는 것으로 확인하였다(Fig. 2).
- 얻어진 순수한 화합물에 대해서 pancreatic lipase 저해 능을 평가하였고, 그중에서도 furan-type 리그난인 phellinsin A(2)가 66.3±2.6 μM의 가장 강한 IC50 값을 나타내었다.
- 천연식물에 광범위하게 존재하는 대표적인 페닐프로파노이드 화합물인 caffeic acid에 대해 배 유래의 polyphenol oxidase로 산화반응을 수행하여 상대적으로 높은 pancreatic lipase 저해 활성(IC50; 161.2±2.8 μg/mL)을 확인하였으며, 이는 caffeic acid와 비교하였을 경우 활성이 상승함을 알 수 있었다.
후속연구
- 또한 물푸레나무로부터 강한 지방분해효소 활성을 나타내는 lignan 화합물인 acernikol, dihydrobuddlenol B가 동정되었으며(31), 태국의 열대우림식물인 Cotyleobium melanoxylon으로부터 강한 지방분해효소 활성을 나타내는 stilbene 유도체인 vaticanol A, vaticanol E, vaticanol G가 동정되었다(32). 최근 본 연구 팀에서 천연물 유래 산화효소를 활용한 caffeic acid의 산화 반응 생성물에 대한 cyclooxygenase-2에 대한 저해 활성 (29)을 확인하였으며, 항비만 소재 개발 관련 효소인 pancreatic lipase에 대한 lignan 화합물의 저해활성에 대한 보고는 이번이 처음이고 효능을 나타낸 본 화합물 등에 대하여 세포실험 및 동물실험을 통해 추가적인 항비만 효능 검증을 실시하여 새로운 기능성 물질로서의 가능성을 모색할 필요가 있다고 사료된다.
- 배에 존재하는 polyphenol 산화효소에 의해 생합성된 caffeic acid 이량체가 pancreatic lipase 저해 활성 물질임을 확인하였으며, 이들 활성은 caffeic acid가 결합 양상에 따른 화합물의 구조에 따라 다름이 시사되었다. 향후 이들 활성물질의 활성 기작에 대한 연구가 필요하며 본 연구 결과는 보다 우수한 pancreatic lipase 저해능을 가지는 새로운 선도화합물 발굴을 위한 기초자료로 이용될 수 있을 뿐만 아니라 항비만 물질의 상업화를 위한 기초자료로 이용될 수 있을 것으로 사료된다.
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