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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 산딸나무 열매로부터 phenolic compound를 추출하여 항산화 효과, 건강 기능성 식품 및 미용식품 활성을 검정하여, 기능성 소재로의 활용가능성을 알아보고자 하였다.
제안 방법
- Tyrosinase 저해효과 측정. Tyrosinase 저해효과 측정은 Vincent와 Hearing의 방법(1987)에 준하여 측정하였다.
- 냉각시킨 반응액에 발색시약 DMAB 시약 3 mL를 가하여 37℃에서 20분간 반응시킨 후 600 nm에서 투과율(%)을 측정하여, 저해율(%)은 (1−시료의 absorbance/대조구의 absorbance)×100으로 계산하였다.
- 산딸나무 열매 추출물의 제조. 생리활성 측정을 위한 추출물의 제조는 물 추출물의 경우 산딸나무 열매 분말 1g을 증류수 200mL에 침지하여 추출물이 100 mL가 될 때까지 가열한 후 냉각하여 24시간 동안 교반 추출하였으며, ethanol 추출물은 산딸나무 열매 분말 1g에 40% ethanol 100 mL를 첨가하여 4℃의 shaking incubator에서 24시간 동안 교반 추출하였다. 각 추출물은 Whatman No.
- 따라서 생리활성은 산딸나무 열매 추출물에 함유되어있는 phenolic성분에 의해 효과가 좌우 될 것으로 판단되었다. 위의 결과에 근거하여 산딸나무 열매로부터 생리활성에 관여하는 phenolic 화합물을 추출하기 위하여 추출용매를 달리하여 phenolic 화합물의 용출량을 알아보았다. 그 결과 Fig.
- 47 mg/g으로 가장 높은 함량을 나타내었다. 위의 결과에 따라 생리기능성 탐색을 위하여 산딸나무 열매추출물을 기능성식품에 적용하고자 추출 용매를 물과 ethanol을 이용하여 물 추출물과 40% ethanol을 이용하여 추출 한 후 생리활성 효과를 탐색하였다.
- 이때 생성된 ρnitrophenol을 흡광도 470 nm에서 OD값을 측정한 후 표준곡선에 대입하여 양을 환산하고, 저해율(%)은 (1−시료의 ρnitrophenol 함량/대조구의 ρ-nitrophenol 함량)×100으로 계산하였다.
대상 데이터
- 실험재료. 본 연구에서 사용된 산딸나무 열매는 시중에서 생과를 구입하여 45℃ dry oven에서 건조시킨 후 40 mesh로 분쇄하여 시료로 사용하였다.
데이터처리
- The data were expressed as the mean ± SD (n =6), Means with different superscript letters are significantly different at p <0.05 by Duncan’s multiple range tests.
- The data were expressed as the mean ± SD (n =6),Means with different superscript letters are significantly different at p <0.05 by Duncan’s multiple range tests.
- The data were expressed as the mean ± SD(n =6), Means with different superscript letters are significantly different at p <0.05 by Duncan’s multiple range tests.
- 본 실험의 결과는 3회 반복하여 측정한 평균값을 나타내었으며, 평균±표준편차로 나타내었다.
- 본 실험의 결과는 3회 반복하여 측정한 평균값을 나타내었으며, 평균±표준편차로 나타내었다. 통계처리는 SPSS 7.5 for windows 프로그램을 이용하여 통계처리 하였고 분산분석(analysis of variance) 및 duncan의 다중범위검정법(duncans multiple range test)으로 95% 수준에서 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- α-Glucosidase 저해효과 측정은 Tibbot과 Skadsen의 방법(1996)에 준하여 측정하였다.
- 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical에 대한 소거활성은 Blios의 방법(1958)에 준하여 측정하였으며, 전자공여능(%)은 1-(반응구의 흡광도/대조구의 흡광도)×100으로 나타내었다.
- 2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS) radical cation decolorization (ABTS)의 측정은 Pellegrin 등의 방법(1998)에 의해 측정하였고, 저해율(%)은 1−(반응구의 흡광도/대조구의 흡광도)×100으로 나타내었다.
- 2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS) radical cation decolorization (ABTS)의 측정은 Pellegrin 등의 방법(1998)에 의해 측정하였고, 저해율(%)은 1−(반응구의 흡광도/대조구의 흡광도)×100으로 나타내었다. Antioxidant protection factor (PF)는 Andarwulan과 Shetty의 방법(1999)으로 측정하였으며, PF는 반응구의 흡광도/대조구의 비로 나타내었다. Thiobarbituric acid reactive substance (TBARs) 측정은 Buege와 Aust의 방법(1978)에 따라 측정하여 저해율(%)은 1−(반응구의 TBARs µM/대조구의 TBARs µM)×100으로 나타내었다.
- Collagenase 저해효과 측정. Collagenase 저해효과 측정은 Wunsch와 Heindrich의 방법(1963)에 준하여 측정하였다. 반응구는 0.
- HAase 저해 활성 측정은 Reissig 등의 방법(1995)에 준하여 sodium-hyaluronic acid(HA)로 부터 형성된 N-acetylglucosamine을 glucoxazoline 유도체로 변형시킨 후 ñdimethylaminobenzaldehyde (DMAB)로 발색시켜 흡광도를 측정하였다.
- Thiobarbituric acid reactive substance (TBARs) 측정은 Buege와 Aust의 방법(1978)에 따라 측정하여 저해율(%)은 1−(반응구의 TBARs µM/대조구의 TBARs µM)×100으로 나타내었다.
- Tyrosinase 저해효과 측정. Tyrosinase 저해효과 측정은 Vincent와 Hearing의 방법(1987)에 준하여 측정하였다. 반응구는 0.
- Xanthine oxidase (XOase) 저해효과 측정. Xanthine oxidase 저해효과 측정은 Stirpe와 Della Corte의 방법(1969)에 준하여 측정하였다. 즉, 반응구는 0.
성능/효과
- α-Glucosidase의 억제효과를 나타내기 위해서는 ethanol 추출물 100 µg/mL 이상의 농도로 처리하여야 억제효과를 기대할 수 있을 것으로 나타났다.
- 위의 결과에 근거하여 산딸나무 열매로부터 생리활성에 관여하는 phenolic 화합물을 추출하기 위하여 추출용매를 달리하여 phenolic 화합물의 용출량을 알아보았다. 그 결과 Fig. 1C에서와 같이 물로 추출하였을 때 7.04 mg/g으로, 다른 유기용매를 사용하여 추출한 것에 비해 상대적으로 phenolic 화합물의 용출양이 높은 것을 알 수 있었으며, 용매에 따른 함량 차이는 크지 않은 것으로 나타났다. 산딸나무 열매의 기능성을 식품에 적용시키기 위하여 인체에 무해한 용매인 ethanol을 다양한 농도의 추출용매로 이용하여 용출된 phenolic 화합물의 함량을 측정한 결과 Fig.
- 1B). 따라서 생리활성은 산딸나무 열매 추출물에 함유되어있는 phenolic성분에 의해 효과가 좌우 될 것으로 판단되었다. 위의 결과에 근거하여 산딸나무 열매로부터 생리활성에 관여하는 phenolic 화합물을 추출하기 위하여 추출용매를 달리하여 phenolic 화합물의 용출량을 알아보았다.
- 97%의 전자공여능을 나타내었다. 또한 첨가되는 phenolics의 함량이 증가할수록 전자공여능도 높아져 농도의존적 양상을 나타내는 것으로 확인되었다. Cho 등(2008)은 진달래 꽃 추출물의 항산화 측정 결과, 열수 추출물과 ethanol 추출물에서 각각 83.
- 본 연구에서 산딸나무 열매추출물의 tyrosinase 저해활성을 측정한 결과 Fig. 5에서와 같이 물추출물에서는 미백 활성이 매우 낮았으며, ethanol 추출물 200 µg/mL phenolics 농도에서 18.74%의 저해활성을 나타내었으며, 한약재 추출물을 1.0 mg/mL phenolics의 농도로 처리했을 때 34%의 tyrosinase 저해 활성이 나타난다고 보고한 Kim 등(2011)의 결과에 비해 다소 낮은 활성을 나타내었다.
- 본 연구에서는 산딸나무 열매추출물의 농도를 50−200µg/mL phenolics로 조절하여 collagenase 저해활성을 측정한 결과 Fig. 6에서와 같이 산딸나무 열매 물추출물에서 13.11−52.46%의 억제력을 나타내었고, ethanol 추출물에서는 51.23−76.64%의 높은 collagenase 억제효과를 나타내어 시중에 주름개선 화장료로 이용되고 있는 EGCG와 비슷한 효능을 나타내었다.
- 산딸나무 열매 물 추출물과 ethanol 추출물의 HAase 억제효과를 비교한 결과 Fig. 7에서와 같이 200 µg/mL phenolic의 농도에서 물 추출물에서는 34.21%, ethanol 추출물에서는 13.16%의 염증 억제효과를 보여주었다.
- 산딸나무 열매 추출물을 이용하여 전자공여능을 측정한 결과 Fig. 2A과 같이 50−200 µg/mL의 phenolic 화합물 농도 범위에서 물추출물의 경우 84.42−88.41%의 전자공여능을, ethanol 추출물에서 85.51−87.97%의 전자공여능을 나타내었다.
- 식물체에 존재하는 phenolic 화합물은 식물의 방어기작으로 생산되는 2차 대사산물의 한 종류이며, 분자구조 내에 존재하는 phenolic hydroxyl기에 의해 단백질 등 거대 분자들과 결합하는 특성을 나타내어 다양한 생리 기능을 가진다고 보고되어 있다(Choi 등, 2003). 산딸나무 열매(야여지) 추출물의 고형분에 포함된 phenolic 성분의 함량은 매우 낮게 나타났으며(Fig. 1A), phenolic 함량이 낮은 고형분의 생리활성 역시 매우 낮은 수준으로 나타났다 (Fig. 1B). 따라서 생리활성은 산딸나무 열매 추출물에 함유되어있는 phenolic성분에 의해 효과가 좌우 될 것으로 판단되었다.
- 04 mg/g으로, 다른 유기용매를 사용하여 추출한 것에 비해 상대적으로 phenolic 화합물의 용출양이 높은 것을 알 수 있었으며, 용매에 따른 함량 차이는 크지 않은 것으로 나타났다. 산딸나무 열매의 기능성을 식품에 적용시키기 위하여 인체에 무해한 용매인 ethanol을 다양한 농도의 추출용매로 이용하여 용출된 phenolic 화합물의 함량을 측정한 결과 Fig. 1D에서와 같이 40% ethanol 추출물에서 4.47 mg/g으로 가장 높은 함량을 나타내었다. 위의 결과에 따라 생리기능성 탐색을 위하여 산딸나무 열매추출물을 기능성식품에 적용하고자 추출 용매를 물과 ethanol을 이용하여 물 추출물과 40% ethanol을 이용하여 추출 한 후 생리활성 효과를 탐색하였다.
- 64%의 높은 collagenase 억제효과를 나타내어 시중에 주름개선 화장료로 이용되고 있는 EGCG와 비슷한 효능을 나타내었다. 산딸나무 열매추출물은 collagenase에 대해 농도 의존적으로 억제작용을 나타냄이 확인되었다. 이러한 결과로 보아 산딸나무 열매추출물이 가지는 collagenase 억제활성에 의해 진피층의 뼈대를 구성하는 collagen의 분해를 막아 주름개선을 위한 기능성 미용식품 소재로 활용이 가능할 것으로 판단되었다.
- 산딸나무 열매추출물의 XOase 저해 활성을 측정한 결과 Fig. 3과 같이 ethanol 추출물이 물 추출물에 비해 저해율이 상대적으로 높게 나타났으며, 50−200 µg/mL의 phenolics 농도 범위의 물 추출물에서 11.51−33.61%의 저해율을 나타내었고, ethanol 추출물에서 11.25−60.39%의 XOase 저해율을 나타내어, 통풍 억제약제인 allopurinol과 유사한 XOase 저해효과를 나타내었다.
- 산딸나무 열매추출물의 antioxidant protection factor의 차이를 측정한 결과 Fig. 2C에서와 같이 물 추출물의경우 1.93−2.21 PF를, ethanol 추출물에서는 1.82−2.18 PF의 항산화능을 나타내어, 산딸나무 열매추출물이 지용성물질에 대한 항산화력도 매우 우수하다고 판단되었다.
- 산딸나무 열매추출물의 thiobarbituric acid reactive substance를 측정한 결과 Fig. 2D에서와 같이 물 추출물보다 ethanol 추출물에서 상대적으로 더 높은 활성을 나타내었으며, ethanol 추출물에서는 200 µg/mL의 농도에서 95.26%의 높은 저해력을 나타내어 지용성 물질의 항산화 효과 측정 지표로 활용되고 있는 PF와 TBARs 측정(Andarwulan과 Shetty, 1999) 결과에서 높은 억제력이 측정되어 산딸나무 열매 추출물은 지용성 물질에 대한 항산화력도 매우 높다는 것을 확인할 수 있었다.
- 산딸나무 열매추출물의 효모기원 α-glucosidase 활성저해 효과를 측정한 결과, Fig. 4에서와 같이 물 추출물에서는 12.19−29.31%의 비교적 낮은 효소억제 효과를 나타내었으며, ethanol 추출물에서는 15.12−86.75%로 첨가되는 phenolic 화합물의 농도에 따라 억제효과는 큰 격차를 나타내었다.
- 2B와 같이 산딸나무 열매는 저 농도에서는 물 추출물보다 ethanol 추출물에서 상대적으로 더 높은 활성을 나타내었으나 150 µg/mL 이상의 고농도에서는 물추출물과 ethanol 추출물의 효능이 비슷한 것으로 측정되었으며, 첨가되는 phenolics에 농도 의존적으로 항산화능이 증가하는 양상을 나타내었다. 이러한 결과로 보아 산딸나무 열매추출물은 친수성 및lipophilic 물질에 대한 항산화력이 우수한 것을 알 수 있었다. 산딸나무 열매추출물의 antioxidant protection factor의 차이를 측정한 결과 Fig.
- 추출물들의 상대적인 항산화 측정은 hydrogen-donating antioxidant와 chain breacking antioxidant 모두를 측정할 수 있으며, 항산화 물질이 potassium persulfate와의 반응에 의해 생성된 ABTS+ free radical을 제거하여 radical의 청록색을 탈색시키는 원리(Pellegrin 등, 1998)를 이용하여 ABTS를 측정한 결과, Fig. 2B와 같이 산딸나무 열매는 저 농도에서는 물 추출물보다 ethanol 추출물에서 상대적으로 더 높은 활성을 나타내었으나 150 µg/mL 이상의 고농도에서는 물추출물과 ethanol 추출물의 효능이 비슷한 것으로 측정되었으며, 첨가되는 phenolics에 농도 의존적으로 항산화능이 증가하는 양상을 나타내었다.
후속연구
- 16%의 염증 억제효과를 보여주었다. 따라서 산딸나무 열매추출물의 농도를 높여 적용한다면 항염증 효과나 아토피 억제효과를 활용하는 제품에 적용할 수 있을 것이라 판단되었다.
- Lee 등(2004b)은 phenol성 물질인 proanthocyanidin이 α-amylase 및 α-glucosidase의 활성을 저해한다고 보고하였으며, 산딸나무 열매추출물의 phenolic 화합물도 이러한 탄수화물 분해 효소의 활성을 억제하는 것으로 확인되었다. 또한 물추출물의 phenolic 함량이 높은데도 불구하고 동일한 용량의 phenolic을 적용 시켰을 때 물추출물보다 ethanol 추출물의 억제활성이 더 높은 것은 추출물에 존재하는 phenolic의 profile이 다르기 때문인 것으로 추측하였으며, 향후 이에 대한 연구가 진행되어야 할 것으로 판단되었다.
- 산딸나무 열매추출물은 collagenase에 대해 농도 의존적으로 억제작용을 나타냄이 확인되었다. 이러한 결과로 보아 산딸나무 열매추출물이 가지는 collagenase 억제활성에 의해 진피층의 뼈대를 구성하는 collagen의 분해를 막아 주름개선을 위한 기능성 미용식품 소재로 활용이 가능할 것으로 판단되었다. Lee 등(2004a)의 유백피 추출물의 collagenase 저해활성 측정결과, 100 ppm에서 27.
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