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문제 정의
- 특히 천연물 중 생약재를 포함한 산채류, herb류가 가장 많이 연구되고 있다(Rhee 등, 1990). 따라서 주름조개풀로부터 생리활성에 관여하는 phenolic 화합물을 추출하기 위하여 다양한 추출용매와 농도에 따른 phenolic 화합물의 용출량을 알아보았다. 그 결과 water, ethanol로 추출하였을 때 Fig.
- 이와 같이 주름조개풀에 대한 연구가 거의 이루어지지 않았음에 착안하여 주름조개풀의 생리활성에 대한 기능성을 측정하여 기능성 식품 및 미용식품 분야에 고부가가치의 기능성 신소재로서의 개발가능성을 제시하고자 하였다.
제안 방법
- 4%의 전자공여능을 나타낸 것에 비해 상대적으로 매우 낮은 활성을 나타내었다. 위의 결과에 따라 생리활성에 대한 기능성 탐색을 위하여 주름조개풀을 water, 70% ethanol을 이용하여 추출한 후 phenolic 농도를 조절하여 생리활성 효과를 검정하였다.
- 이때 생성된 ρ-nitrophenol을 흡광도 470 nm에서 OD값을 측정한 후 표준곡선에 대입하여 양을 환산하고, 저해율(%)은 (1－시료의 ρ-nitrophenol 함량/대조구의 ρ-nitrophenol 함량)×100으로 계산하였다.
- 제작한 plate에 지름 10 mm disc paper를 올린 후 시료액 0.8 mL와 효소액 0.2 mL (1,000 U/mL)를 혼합해 disc paper에 각각 분주하고 대조구에는 시료액 대신 증류수를 넣어 37 oC에서 3일간 배양한 후 I2/KI (5 mM I2 in 3% KI) 3 mL를 가하여 15분간 발색시킨 후 저해율(%)은 (1－시료의 Area/대조구의 Area)×100으로 계산하였다.
대상 데이터
- 본 연구에서 사용된 주름조개풀은 실험을 위해 대구 팔공산 인근에서 직접 채취하여 이물질을 제거한 후 45 oC dry oven (FO600M, Jeiotech, Daejeon, Korea)에서 건조시킨 후 40mesh로 분쇄하여 시료로 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험은 3회 이상 반복 측정하였고 자료의 통계처리는 SPSS 23 for windows (Statistical Package for Social Science, Chicago, IL, USA)를 이용하여 평균±표준편차(mean ± standard deviation)로 표시하였고 분산분석 Duncan’s multiple range test one-way ANOVA를 실시하여 시료간의 유의차를 p <0.05 수준으로 비교 분석하였다.
이론/모형
- α-Glucosidase 저해효과 측정은 Tibbot과 Skadsen의 방법(1996)에 준하여 측정하였다.
- 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical에 대한 소거활성은 Blois의 방법(1958)에 준하여 측정하였으며, 전자공여능(%)은 1-(반응구의 흡광도/대조구의 흡광도)×100으로 나타내었다.
- 2,2’-Azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) radical cation decolorization (ABTS)의 측정은 Fellegrini 등의 방법(1999)에 준하여 측정하였고, 저해율(%)은 1-(반응구의 흡광도/대조구의 흡광도)×100으로 나타내었다.
- 2,2’-Azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) radical cation decolorization (ABTS)의 측정은 Fellegrini 등의 방법(1999)에 준하여 측정하였고, 저해율(%)은 1-(반응구의 흡광도/대조구의 흡광도)×100으로 나타내었다. Antioxidant protection factor(PF)는 Andarwulan과 Shetty의 방법(1999)에 준하여 측정하였으며, PF는 반응구의 흡광도/대조구의 비로 나타내었다. Thiobarbituric acid reactive substance (TBARs)측정은 Buege와 Aust의 방법(1978)에 준하여 측정하여 저해율(%)은 1-(반응구의 TBARs µM/대조구의 TBARs µM)×100으로 나타내었다.
- Astringent 활성은 Lee 등의 방법(2002)에 준하여 측정하였다. 피부 단백질과 유사한 혈액 단백질(hemoglobin)을 사용하여, 원심분리 용기에 각각의 시료와 헤모글로빈 용액을 1:1로 넣어서 진탕 혼합한 다음 2,000 rpm에서 원심분리 후 576 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 1 mL를 첨가하여 37 oC에서 20분간 반응시켜 ρ-nitroaniline 생성량을 흡광도 410 nm에서 측정하였다. Collagenase 저해효과 측정은 Wunsch와 Heidrich의 방법(1963)에 준하여 측정하였다. 반응구는 0.
- Elastase 저해효과 측정은 Kraunsoe 등의 방법(1996)에 준하여 측정하였다. 반응구는 0.
- HAase 저해활성은 Dorfman와 OTT의 방법(1948)에 준하여 측정하였다. 반응구는 시료 0.
- Pancreatin α-amylase 저해효과 측정은 agar diffusion 방법(Davidson과 Parish 1989)에 준하여 측정하였으며, plate는 agar 5 g과 soluble starch 5 g을 증류수에 녹여 끓인 후, 121 oC로 15분간 멸균하고 15 mL씩 petridish에 붓고 굳혀 사용하였다.
- Thiobarbituric acid reactive substance (TBARs)측정은 Buege와 Aust의 방법(1978)에 준하여 측정하여 저해율(%)은 1-(반응구의 TBARs µM/대조구의 TBARs µM)×100으로 나타내었다.
- Tyrosinase 저해효과 측정은 Vincent와 Hearing의 방법(1987)에 준하여 측정하였다. 반응구는 0.
성능/효과
- ABTS radical 소거능을 측정한 결과 Fig. 2B에서와 같이 주름조개풀 water, ethanol 추출물 모두 150 µg/mL phenolic의 농도에서 99, 95%의 radical 소거능을 나타내어 수용성 물질에 대한 항산화력 측정에서 높은 활성을 나타내었다.
- Astringent 효과를 측정한 결과 water, ethanol 추출물 200 μg/mL phenolic 농도에서 각각 13, 32%의 astringent 효과를 나타내었다.
- Astringent 효과를 측정한 결과 water, ethanol 추출물 200 μg/mL phenolic 농도에서 각각 13, 32%의 astringent 효과를 나타내었다. Hyaluronidae 저해활성을 측정한 결과 ethanol 추출물 200 μg/mL phenolic 농도에서 46%의 Hyaluronidae 저해효과를 나타내었다.
- 고형분과 phenolic 성분의 생리활성 효능을 비교를 위해 DPPH radical을 측정한 결과 Fig. 1D에서와 같이 주름조개풀 water, ethanol 추출물의 고형분 50 µg/mL 농도에서 각각 2.8, 8.3%의 전자공여능을 나타내어 50 µg/mL phenolic 농도에서 각각 73.9, 81.4%의 전자공여능을 나타낸 것에 비해 상대적으로 매우 낮은 활성을 나타내었다.
- 따라서 주름조개풀로부터 생리활성에 관여하는 phenolic 화합물을 추출하기 위하여 다양한 추출용매와 농도에 따른 phenolic 화합물의 용출량을 알아보았다. 그 결과 water, ethanol로 추출하였을 때 Fig. 1A에서와 같이 7.70, 5.84 mg/g의 함량으로 다른 유기용매를 사용하여 추출한 것에 비해 상대적으로 높은 phenolic 화합물의 용출량을 확인하였다. Water 추출물과 유기용매 중 추출 수율이 가장 높았던 ethanol을 다양한 농도로 이용하여 phenolic 함량을 측정한 결과 Fig.
- 기능성 식품 활성을 측정하는 α-Glucosidase 저해활성을 측정한 결과 ethanol 추출물 200 μg/mL phenolics 농도에서 44%의 억제력을 나타내었고, α-amylase 저해활성은 water 추출물 50-200 μg/mL phenolics 농도에서 37-88%의 효소 억제력을 나타내었다.
- Lee와 Lee(1994)는 phenol성 물질은 여러 식물체에 널리 분포되어 있지만 그들의 함량, 종류, 형태 등이 각각 다르므로, α-amylase 효소 활성의 저해는 polyphenol의 양과 종류에 따라 달라진다는 보고에 의하면 주름조개풀의 추출물에 용해되어 있는 phenolic 화합물 성분과 종류에 따라 ethanol 추출물에서는 억제력이 나타나지 않았지만 water 추출물에서 높은 억제력을 나타내었다. 따라서 주름조개풀 추출물의 당분해 억제 효과를 확인하였고 기능성 식품 분야에서 기능성 신소재로 적용 가능하다고 판단되었다.
- 또한 elastase 저해활성을 측정한 결과 water, ethanol 추출물에서 각각 4, 61%로 나타내었고, collagenase 저해활성을 측정한 결과 water, ethanol 추출물 200 μg/mL phenolics 농도에서 각각 39, 67%로 ethanol 추출물에서 높은 억제력을 나타내어 우수한 저해효과를 확인하였다.
- 또한 주름조개풀 추출물의 phenolic 함량이 생리활성에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해 고형분의 phenolic 함량을 측정한 결과 Fig. 1C에서와 같이 주름조개풀 water, ethanol 추출물의 고형분 50 µg당 각각 1.26, 1.68 µg/g의 함량을 나타내었다.
- 기능성 식품 활성을 측정하는 α-Glucosidase 저해활성을 측정한 결과 ethanol 추출물 200 μg/mL phenolics 농도에서 44%의 억제력을 나타내었고, α-amylase 저해활성은 water 추출물 50-200 μg/mL phenolics 농도에서 37-88%의 효소 억제력을 나타내었다. 미용 식품 활성을 나타내는 tyrosinase 저해활성을 측정한 결과 ethanol 추출물에서 82%의 tyrosinase 저해효과를 나타내었다. 또한 elastase 저해활성을 측정한 결과 water, ethanol 추출물에서 각각 4, 61%로 나타내었고, collagenase 저해활성을 측정한 결과 water, ethanol 추출물 200 μg/mL phenolics 농도에서 각각 39, 67%로 ethanol 추출물에서 높은 억제력을 나타내어 우수한 저해효과를 확인하였다.
- 2D에서와 같이 water, ethanol 추출물 모두 50 µg/mL phenolic의 저농도에서 84, 99%로 나타내어 α-토코페롤과 β-카로틴과 같이 지용성 물질에 대한 항산화력 측정에서 높은 활성을 나타내었다. 이러한 결과로 보아 주름조개풀 추출물은 수용성, 지용성 항산화에 대한 우수한 효능을 나타내었고, 추출물의 phenolic 화합물 농도에 따라 농도의존적으로 증가하는 양상을 나타내는 것으로 확인하였다. 또한 천연 항산화제 개발에 대한 신소재로도 활용 가능할 것으로 판단되었다.
- 주름조개풀 추출물 50-200 µg/mL phenolics 농도로 collagenase 저해활성을 측정한 결과 Fig. 4C에서와 같이 water 추출물에서 3-39%의 저해활성을 나타내었고, ethanol 추출물에서는 20-67%의 저해활성을 나타내었다.
- 주름조개풀 추출물로 지용성 항산화능을 나타내는 TBARs를 측정한 결과 Fig. 2D에서와 같이 water, ethanol 추출물 모두 50 µg/mL phenolic의 저농도에서 84, 99%로 나타내어 α-토코페롤과 β-카로틴과 같이 지용성 물질에 대한 항산화력 측정에서 높은 활성을 나타내었다.
- 주름조개풀 추출물을 이용하여 전자공여능을 측정한 결과 Fig. 2A에서와 같이 50-200 µg/mL phenolic 농도에서 water, ethanol 추출물 각각 78-85, 82-100%의 높은 전자공여능을 나타내었다.
- 주름조개풀 추출물의 α-amylase 활성저해 효과를 측정한 결과 Fig. 3B에서와 같이 water 추출물에서 37-88%로 저해효과가 상대적으로 높게 나타내었으며, ethanol 추출물에서는 저해효과가 나타나지 않았다.
- 주름조개풀 추출물의 HAase 저해활성을 측정한 결과 Fig. 4E에서와 같이 ethanol 추출물 50-200 µg/mL phenolic 농도에서 12-46%의 HAase 저해효과를 나타내었으며, positive control로 사용한 pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC)보다는 낮은 억제효과를 나타내었지만, 주름조개풀 추출물의 항염증, 아토피 억제효과를 활용한 기능성 제품에 적용가능한 기초자료라고 판단되었다.
- 주름조개풀 추출물의 astringent 효과를 측정한 결과 Fig. 4D에서와 같이 water, ethanol 추출물 200 µg/mL 농도에서 각각 13, 32%의 효과를 나타내어 Kim 등(2011)이 호두 ethanol 추출물에서 55%의 수렴활성을 나타내었다고 보고한 바와 같이 주름조개풀 추출물의 astringent 효과를 확인하였고, 이러한 모공수축 효과를 활용한 기능성 화장품의 기초 원료로 활용될 것으로 판단되었다.
- 주름조개풀 추출물의 tyrosinase 저해활성을 측정한 결과 Fig. 4A에서와 같이 ethanol 추출물에서 47-82%의 저해활성을 나타내었으며, Jeong과 Oh(2014)는 마황 ethanol 추출물이 200 µg/mL 농도에서 38.8% 저해활성을 나타낸다고 보고한 것에 비해 주름조개풀의 tyrosinase 저해효과가 더 우수한 것으로 확인되었다.
- 주름조개풀 추출물의 효모기원 α-Glucosidase 활성저해효과를 측정한 결과 Fig. 3A에서와 같이 water 추출물에서는 저해효과가 나타나지 않았으며, ethanol 추출물에서만 11-44%로 첨가되는 phenolic 화합물의 농도에 따라 저해효과를 나타내었다.
- 추출물의 phenolic 농도를 50-200 μg/mL로 조절하여 항산화 효과를 측정한 결과, DPPH에서는 water, ethanol 추출물 50 μg/mL phenolics 농도에서 각각 78, 82%였고, ABTS radical decolorization는 100 μg/mL phenolics 농도에서 각각 92, 76%의 radical 소거능을 나타내었다.
- 피부조직의 탄력을 유지해주는 elastin의 결합을 분해하여 피부주름 유발에 원인이 되는 elastase 저해활성을 측정한 결과 Fig. 4B에서와 같이 water 추출물 200 µg/mL phenolics 농도에서 4%의 비교적 낮은 저해활성을 나타내었고, ethanol 추출물 200 µg/mL phenolics 농도에서 대조구인 EGCG (epigallocatechin3-gallate)와 비슷한 저해활성인 61%의 저해활성을 나타내었다.
후속연구
- 이러한 결과로 보아 주름조개풀 추출물은 수용성, 지용성 항산화에 대한 우수한 효능을 나타내었고, 추출물의 phenolic 화합물 농도에 따라 농도의존적으로 증가하는 양상을 나타내는 것으로 확인하였다. 또한 천연 항산화제 개발에 대한 신소재로도 활용 가능할 것으로 판단되었다.
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