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문제 정의
- Allopurinol의 XOase 저해 효과를 측정한 결과 34~61%의 저해 효과를 나타내어 이와 비교하였을 때 OCS의 통풍 저해 효과 또한 확인할 수 있었다. 따라서 OCS의 통풍 예방 및 치료제로서의 개발 가능성을 확인하였다.
- 따라서 오래전부터 식용, 민간용법, 약용으로 다양한 용도로 사용되어 왔던 밤의 부산물인 밤송이(chestnut bur)에 여러 가지 유효성분이 함유되어 있는 것으로 보고되고 있어 이를 활용하기 위한 방안으로 생리활성 효과를 측정하여 고부가가치의 기능성 소재로서의 가능성을 살펴보았다.
제안 방법
- 각 추출물은 Whatman No. 1 filter paper(Whatman Inc., Piscataway, NJ, USA)로 여과한 후 필요에 따라 rotary vacuum evaporator(Eyela NE, Tokyo, Japan)에서 농축하였고, 동결건조기(FD8518, Ilshinbiobase Co., Dongducheon, Korea)를 사용하여 동결 건조한 옥광 밤송이 고형분(Okkwang chestnut bur solid, OCS)을 4°C에서 보관하면서 사용하였다.
- 생리활성 측정을 위한 추출물의 제조는 물 추출물의 경우옥광 밤송이 분말 1 g을 증류수 200 mL에 침지하여 추출물이 100 mL가 될 때까지 가열한 후 냉각하여 24시간 동안 교반 추출하였으며, 에탄올 추출물은 예비실험에서 추출 수율이 가장 높았던(data not shown) 40% 에탄올을 사용하여 옥광 밤송이 분말 1 g에 40% 에탄올 100 mL를 첨가하여 4°C의 shaking incubator에서 24시간 동안 교반 추출하였다.
- 위의 결과에 따라 생리활성 효과에 대한 기능성을 탐색하고 OCS를 식품산업에 적용하기 위해물과 40% 에탄올을 추출용매로 사용하여 추출한 고형분의 항산화 효과와 XOase, α-glucosidase, tyrosinase 저해 효과 등의 생리활성을 검증하였다.
- 이때 생성된 ρ-nitrophenol을 흡광도 470 nm에서 측정한 후 표준곡선에 대입하여 양을 환산하고, 저해율(%)은 (1－시료의 ρ-nitrophenol 함량/대조구의 ρ-nitrophenol 함량)×100으로 계산하였다.
- 즉 반응구는 0.1 M potassium phosphate buffer(pH 7.5)에 녹인 기질액 2 mM xanthine 3 mL에 효소액(0.05 U/0.1 mL) 0.1 mL와 시료 0.3 mL를 넣고 대조구에는 시료 대신 증류수를 0.3 mL 첨가하여 37°C에서 5분간 반응시키고 종료시약 20% trichloroacetic acid 1mL를 가한 후 반응액을 원심분리하여 단백질을 제거하고 생성된 요산(uric acid)을 흡광도 292 nm에서 측정하여, 저해율(%)은 (1－시료의 uric acid 함량/대조구의 uric acid 함량)×100으로 계산하였다.
대상 데이터
- 본 연구에서 사용된 밤 겉껍데기인 밤송이는 충청남도 공주지역에서 재배되고 있는 옥광(Okkwang) 품종의 밤나무로부터 수확한 후 밤송이에 들어있는 생밤과 속껍질 및 이물질을 제거한 다음 45°C dry oven(FO600M, Jeiotech, Daejeon, Korea)에서 건조시킨 후 40 mesh로 분쇄하여 시료로 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험은 6회 이상 반복 측정하였고 자료의 통계처리는 SPSS 23 for windows(Statistical Package for Social Science, Chicago, IL, USA)를 이용하여 평균±표준편차(mean±standard deviation)로 표시하였고 분산분석 Duncan’s multiple range test, one-way ANOVA를 실시하여 시료 간의 유의차를 P<0.05 수준으로 비교 분석하였다.
이론/모형
- α-Glucosidase 저해 효과 측정은 Tibbot과 Skadsen(20)의 방법에 따라 측정하였다.
- 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼에 대한 소거 활성은 Blois(15)의 방법에 따라 측정하였으며, 전자공여능(%)은 1－(반응구의 흡광도/대조구의 흡광도)×100으로 나타내었다.
- 2,2’-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline6-sulfonic acid)(ABTS) radical cation decolorization의 측정은 Fellegrini 등(16)의 방법에 따라 측정하였고, 저해율(%)은 1－(반응구의 흡광도/대조구의 흡광도)×100으로 나타내었다.
- 2,2’-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline6-sulfonic acid)(ABTS) radical cation decolorization의 측정은 Fellegrini 등(16)의 방법에 따라 측정하였고, 저해율(%)은 1－(반응구의 흡광도/대조구의 흡광도)×100으로 나타내었다. Antioxidant protection factor(PF)는 Andarwulan과 Shetty(17)의 방법에 따라 측정하였으며, PF는 반응구의 흡광도/대조구의 비로 나타내었다. Thiobarbituric acid reactive substance(TBARS) 측정은 Buege와 Aust(18)의 방법에 따라 측정하여 저해율(%)은 1－(반응구의 TBARS μM/대조구의 TBARS μM)×100으로 나타내었다.
- Collagenase 저해 효과 측정은 Wunsch와 Heidrich(22)의 방법에 따라 측정하였다. 반응구는 0.
- HAase 저해 효과는 Dorfman와 OTT(24)의 방법에 따라 측정하였다. 반응구는 시료 0.
- Thiobarbituric acid reactive substance(TBARS) 측정은 Buege와 Aust(18)의 방법에 따라 측정하여 저해율(%)은 1－(반응구의 TBARS μM/대조구의 TBARS μM)×100으로 나타내었다.
- Tyrosinase 저해 효과 측정은 Hearing(21)의 방법에 따라 측정하였다. 반응구는 0.
- XOase 저해 효과 측정은 Stirpe와 Della Corte(19)의 방법에 따라 측정하였다. 즉 반응구는 0.
- 15 mL를 첨가하였다. 대조구에는 시료 대신 증류수 0.1 mL를 첨가하여 실온에서 20분간 방치한 후 6% citric acid 0.5 mL를 넣어 반응을 정지시킨 다음, ethyl acetate 2 mL를 첨가하여 320 nm에서 흡광도를 측정하였고, elastase 저해 효과 측정은 Kraunsoe 등(23)의 방법에 따라 측정하였다. 반응구는 0.
성능/효과
- Positive control로 사용한 allopurinol은 통풍의 예방 및 치료 방법인 요산을 낮춰 주는 치료제(urate-lowering therapy, ULT) 중 하나로써 60년대 미국에서 허가받은 후 약 50년간 사용됐지만,일부 환자들이 과민반응을 일으키며(34), 드물게 StevensJohnson syndrome(SJS), toxic epidermal necrolysis(TENS)와 같은 심각한 부작용이 나타나기도 한다고 알려져 있다. Allopurinol의 XOase 저해 효과를 측정한 결과 34~61%의 저해 효과를 나타내어 이와 비교하였을 때 OCS의 통풍 저해 효과 또한 확인할 수 있었다. 따라서 OCS의 통풍 예방 및 치료제로서의 개발 가능성을 확인하였다.
- DPPH 라디칼 소거능은 물, 에탄올 추출물 50 µg/mL solid 농도에서 각각 85, 87%의 전자공여능을 나타내었고, ABTS 라디칼 소거능은 물, 에탄올 추출물에서 각각 100, 86%의 전자공여능을 나타내었다.
- OCS를 이용하여 ABTS 라디칼 소거능을 측정한 결과 Fig. 2B와 같이 OCS 물, 에탄올 추출물은 100 μg/mL 이상의 농도에서 모두 100%의 매우 높은 활성을 나타내었다.
- OCS를 이용하여 PF를 측정한 결과 Fig. 2C와 같이 OCS 물 추출물에서는 50~200 μg/mL의 농도에서 1.17~1.22 PF를 나타내었고, OCS 에탄올 추출물에서는 50~200 μg/mL의 농도에서 1.13~1.45 PF를 나타내어 positive control로 사용한 BHT와 유사한 활성을 나타내었다.
- OCS를 이용하여 TBARS를 측정한 결과 Fig.2D와 같이 OCS 물 추출물에서는 50~200 μg/mL의 농도에서 22~83%의 활성을 나타내었고, OCS 에탄올 추출물에서는 50~200 μg/mL의 농도에서 27~73%의 활성을 나타내었다.
- OCS를 이용하여 멜라닌 합성을 조절하는 효소인 tyrosinase 저해 효과를 측정한 결과 Fig. 5와 같이 OCS 물 추출물에서는 50~200 μg/mL의 농도에서 3~8%의 저해 효과를 나타내었고, OCS 에탄올 추출물에서는 50~200 μg/mL의 농도에서 3~27%의 저해 효과를 나타내었다.
- OCS를 이용하여 염증 유발과 관련이 있는 효소인 HAase 저해 효과를 측정한 결과 Fig. 7과 같이 OCS 물 추출물에서는 50~200 μg/mL의 농도에서 40~96%의 저해 효과를 나타내었고, OCS 에탄올 추출물에서는 50~200 μg/mL의 농도에서 0~52%의 저해 효과를 나타내어 통풍 예방 및 치료에 대한 억제제로서의 개발 가능성을 확인하였다.
- OCS를 이용하여 통풍유발 물질인 요산을 생성하는 XOase 저해 효과를 측정한 결과 Fig. 3과 같이 OCS 물 추출물에서는 50~200 μg/mL의 농도에서 19~54%의 저해 효과를 나타내었고, OCS 에탄올 추출물에서는 50~200 μg/mL의 농도에서 20~43%의 저해 효과를 나타내었다.
- OCS를 이용하여 피부 세포의 뼈대 역할을 하는 collagen을 분해하는 효소인 collagenase 저해 효과를 측정한 결과 Fig. 6A와 같이 OCS 물 추출물에서는 50~200 μg/mL의 농도에서 47~93%의 저해 효과를 나타내었고, OCS 에탄올 추출물에서는 50~200 μg/mL의 농도에서 58~94%의 저해 효과를 나타내었다.
- OCS를 이용하여 피부 탄력을 유지하기 위해 세포 사이를 채우고 있는 elastin을 분해하여 주름을 발생시키는 효소인 elastase 저해 효과를 측정한 결과 Fig. 6B와 같이 OCS 물 추출물에서는 50~200 μg/mL의 농도에서 2~11%의 저해 효과를 나타내었고, OCS 에탄올 추출물에서는 50~200 μg/mL의 농도에서 7~56%의 저해 효과를 나타내어 피부 탄력에 영향을 주는 collagen과 elastin을 분해하는 collagenase, elastase에 대한 저해 효과를 확인하였다.
- OCS의 항산화 효과를 평가하기 위해 해당소재인 OCS의 DPPH 전자공여능을 측정한 결과 Fig.2A와 같이 OCS 물 추출물에서는 50~200 μg/mL의 농도에서 85~88%의 전자공여능을 나타내었고, OCS 에탄올 추출물에서는 87~100%의 활성을 나타내어 전자공여능이 농도 의존적으로 증가하였다.
- PF에서는 물, 에탄올 추출물 200 µg/mL solid 농도에서 각각 1.22, 1.45 PF를 나타내었고, TBARS는 물 추출물에서 83%, 에탄올 추출물에서는 73%의 효능을 나타내었다.
- 28 μg/50 μg solid의 phenolic 함량을 나타내었다. 따라서 옥광 밤송이의 고형분과 phenolic 성분의 함량이 생리활성 효과에 어떠한 영향을 미치는지 비교를 위해 DPPH 라디칼을 측정한 결과, Fig.1B에서와 같이 옥광 밤송이 phenolic(Okkwang chestnut bur phenolic, OCP) 물, 에탄올 추출물에서 각각 84.6, 87.4%의 전자공여능을 나타내었고, OCS 물, 에탄올 추출물에서는 각각 71.8, 70.9%의 전자공여능을 나타내어 OCP와 OCS의 물, 에탄올 추출물 모두 높은 전자공여능을 확인할 수 있었다. 그 결과 OCP와 OCS 물, 에탄올 추출물에서는 생리활성물질인 phenolic 화합물의 함량의 차이에도 불구하고 유사한 생리활성 효과를 나타내는 것으로 보아 phenolic 화합물 외의 다른 유효성분이 함유된 것으로 예상하였으며, Kim(26)의 보고에 의하면 밤송이에 다양한 phenolic 화합물(ellagic acid, 1-O-galloyl-β-D-glucose, quercetin 3-O-β-D-glucopyranoside, (+)-catechin, quercetin)과 morin, naringenin 등의 화합물이 다량 함유되어있다고 보고한 바 있다.
- 식물체의 생리활성물질로 알려져 있는 total phenolic 성분의 함량을 측정한 결과, Fig. 1A에서와 같이 물과 에탄올 추출물의 고형분에서 각각 11.24 μg/50 μg solid, 10.28 μg/50 μg solid의 phenolic 함량을 나타내었다.
- 위 결과와 같이 우수한 α-glu-cosidase 저해 효과를 나타낸 OCS를 이용하여 당단백질, 당지질이 합성하는 대사경로나 당뇨병 치료와 관련된 작용 기작에 적용시켰을 때 질병 치료에 대한 가능성이 있다는 것을 확인할 수 있었다.
- 주름개선을 보여주는 collagenase 저해 효과는 200 µg/mL solid 농도에서 물, 에탄올 추출물 각각 93, 94%의 우수한 주름개선 효과를 나타내었으며, elastase 저해 효과는 200µg/mL solid 농도에서 에탄올 추출물은 56%의 효능을 나타내었다.
- 체내의 당을 분해하여 당뇨에 영향을 줄 수 있는 효소인 α-glucosidase의 저해 효과를 평가하기 위해 OCS를 이용하여 저해 효과를 측정한 결과 Fig. 4와같이 OCS 물, 에탄올 추출물은 50~200 μg/mL의 농도에서 모두 95% 이상의 높은 저해 효과를 나타내었다.
- 항염증 효과를 나타내는 HAase 저해 효과를 측정한 결과 200 µg/mL solid 농도에서 물, 에탄올 추출물에서 각각 96, 52%의 항염증 효과를 나타내었다.
후속연구
- 18 PF의 항산화능을 나타내었고, TBARS에서는 에탄올 추출물 200μg/mL의 농도에서 95%의 높은 효과를 나타내었다고 보고하여 OCS의 지용성 항산화능 또한 높은 효과를 나타내는 것으로 확인할 수 있었다. 따라서 OCS는 수용성, 지용성 항산화에 대한 높은 활성을 나타내어 합성항산화제를 대신할 수 있는 천연물 소재로 개발 가능성이 크다고 판단되었다.
- α-Glucosidase는 체내의 소장 내 말단에 존재하는 당분해효소로서, 탄수화물로부터 α-glucose를 방출하는 α-glucosidic bond의 분해를 촉진하여 포도당을 흡수하는 데 관여하는 생체 내 필수 효소이다. 또한, 당단백질과 당지질이 합성하는 경우와 같은 다양한 대사 경로에도 관여하므로 이를 조절함으로써 대사 질환의 치료 가능성을 기대할 수 있다. α-Glucosidase inhibitor는 제2형 당뇨병의 치료에 이용되고 있지만, 장기간 복용할 경우 일부환자에게서 복부팽만감, 구토, 설사 등의 부작용이 나타날 수 있어서 사용이 제한될 수 있다(35).
- 항염증 효과를 나타내는 HAase 저해 효과를 측정한 결과 200 µg/mL solid 농도에서 물, 에탄올 추출물에서 각각 96, 52%의 항염증 효과를 나타내었다. 이러한 결과로 보아 OCS 추출물은 항산화 활성, 통풍 억제, 항당뇨, 미백, 주름개선, 항염증 효과가 우수하므로 기능성 소재로서 사용이 가능할 것으로 기대된다.
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