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[국내논문] CRF1 길항제 스크리닝을 위한 에쿼린 기반 세포실험 개발연구
Development of an aequorin-based assay for the screening of corticotropin-releasing factor receptor antagonists 원문보기

한국산학기술학회논문지 = Journal of the Korea Academia-Industrial cooperation Society, v.16 no.11, 2015년, pp.7575 - 7581  

노효진 (상명대학교 의생명공학과) ,  이승호 (상명대학교 의생명공학과)

초록
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corticotropin releasing factor(CRF)는 스트레스에 의해 유도되는 신경펩타이드 물질들 중 하나로서 모발의 손실 및 재성장에 영향을 미친다고 광범위하게 제기되어 왔다. 이에 CRF1 수용체 길항제 개발을 위하여 세포 내 칼슘 신호전달 기전을 이용한 스크리닝 시스템을 개발하고 최적화 연구를 수행하고자 하였다. 이를 위하여 에쿼린 모체세포에 CRF1 수용체와 만능 G 단백질인 G${\alpha}$16 유전자를 동시에 발현시켜 안정화 세포주를 구축하였다(HEK293a16/hCRF1). 표준 효현제인 sauvagine의 반응이 임시 발현세포와 비교하여 안정화 세포주에서 농도 의존적 반응 범위가 12배 이상 증가하였으며($EC_{50}:15.21{\pm}1.83nM$), 이에 따라 길항제 스크리닝에 필수적인 안정적인 신호와 높은 용매 허용도를 확보할 수 있었다. CRF1 수용체에 대한 표준 길항제인 antalarmin과 CP154526에 대한 $IC_{50}$ 수치는 각각 $414.1{\pm}5.5$$290.7{\pm}1.9nM$로 확인되었는데 냉동보관세포의 경우에도 유사한 결과를 얻었다. 에쿼린 기반 세포 기능실험의 최적화 연구를 통해 구축된 CRF 수용체 안정화 세포주는 모발의 재형성과 관련된 신규의 기능성 화장품 및 조절물질 개발 연구에 적극적으로 활용 가능 할 것으로 판단된다.

Abstract AI-Helper 아이콘AI-Helper

Corticotropin-releasing factor(CRF), one of the stress driven neuropeptides, was widely proposed to influence hair loss and re-growth. For the development of receptor antagonists, the screening system based on intracellular calcium signal process was developed and optimized. The aequorin parental ce...

Keyword

AI 본문요약
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문제 정의

  • 이에 본 논문에서는 모발의 재형성에 관여하는 CRF 길항제 스크리닝 연구를 위하여 CRF1 수용체와 함께 만능 G 단백질을 동시발현 시킨 안정화 세포주를 개발하고, 이를 활용한 에쿼린 기반 세포 기능실험의 최적화 연구 결과를 보고하고자 한다.
  • 따라서 에쿼린 모체 세포주에 Gα16 cDNA와 함께 CRF1유전자를 삽입하면, Gs 유형의 신호전달을 이용하는 CRF1 수용체의 경우에도 세포 기능의 변화에 따른 칼슘이온의 변화도를 측정할 수 있게 되어 핵심 최적화 연구를 통하여 CRF1 길항제 스크리닝에 응용하고자 한다.
  • 스트레스에 의해 다양한 생리조절 물질들의 발현 패턴이 변화되고 이에 따라 생리 활성의 변화가 나타난다[1]. 본 연구에서는 스트레스에 의해 유도되는 신경 펩타이드 물질들 중 하나인 corticotropin releasing factor (CRF)에 대한 수용체 길항제 개발과 이의 산업적인 활용을 위하여 세포 내 칼슘 신호전달 과정을 통한 스크리닝 시스템을 개발하고 이를 최적화 하여 CRF1 수용체 조절물질의 개발에 활용하고자 하였다.

가설 설정

  • (a)Agonist dose-response curves of sauvagine(●) and acetylcholine(○). (b) Dose-response curve of antalarmin as a standard antagonist. Presented data were representative data set from at least two separate experiments performed in triplicate, and each data points were expressed as mean ± SD.
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질의응답

핵심어 질문 논문에서 추출한 답변
CRF는 무엇이며 어디에 영향을 미치는 물질인가? corticotropin releasing factor(CRF)는 스트레스에 의해 유도되는 신경펩타이드 물질들 중 하나로서 모발의 손실 및 재성장에 영향을 미친다고 광범위하게 제기되어 왔다. 이에 CRF1 수용체 길항제 개발을 위하여 세포 내 칼슘 신호전달 기전을 이용한 스크리닝 시스템을 개발하고 최적화 연구를 수행하고자 하였다.
사전 실험에서 CRF1 수용체만 도입했을 때에는 S/N ratio가 1.8 정도여서 스크리닝 실험에 적용하기가 어렵게 나왔는데 논문에서는 이 문제를 어떻게 해결했는가? 8 정도로 신호수준이 안정적이지 못하여 스크리닝 실험에 적용하기가 어렵다고 판단되었다. 이를 극복하기 위하여 에쿼린 모체 세포주에 CRF1과 Gα16[21] 유전자를 함께 전달하고 생성된 클론들로부터 S/N ratio가 58이상인 안정화 세포주(HEK293aeqα16/hCRF1)를 확보 하게 되었다.
에쿼린 기반 세포실험의 장점은 무엇이며 어디에 활용될 수 있는가? 특히 Gα16을 도입하지 않은 형광실험[23]의 경우 안정적인 신호의 확보를 위하여 100,000 cells/well 조건으로 실험을 했지만본 연구에서 확보한 안정화 세포주의 경우 5,000 cells/well 최소 조건으로도 충분한 신호 수준을 확보할수 있었다. 또한 에쿼린 기반 세포실험은 발광신호가 형광과 달리 시험물질들의 자체 형광 또는 간섭현상을 최소화할 수 있는 장점이 있어 최근에 논의되고 있는 천연물 유래 CRF1 길항제의 개발[24]에 적극적으로 활용될수 있을 것이라고 판단된다.
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참고문헌 (25)

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  2. Arborelius, L., Owens, M.J., Plotsky, P.M., Nemeroff, C. B. "The role of corticotropin-releasing factor in depression and anxiety disorders.", J Endocrinol, 160(1), 1-12, 1999. DOI: http://dx.doi.org/10.1677/joe.0.1600001 

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  24. Huang, H.J. and Chen, C.Y. "A possible solution for hair loss by inhibiting corticotropin-releasing factor (crf) receptor from traditional chinese medicine", J Biomol Str & Dynamics, 32, 1613-1623, 2014. DOI: http://dx.doi.org/10.1080/07391102.2013.831377 

  25. Zhang, J.H., Chung, T.D., Oldenburg, K.R. "A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays", J Biomol Screen, 4, 67-73, 1999. DOI: http://dx.doi.org/10.1177/108705719900400206 

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