In the present study, vasorelaxant effect of the extract of seeds of Oenothera odorata (SOO) and its possible mechanism responsible for this effect were examined in vascular tissues isolated from rats. Changes in vascular tension, 3',5'-cyclic monophosphate (cGMP) levels were measured in thoracic ao...
In the present study, vasorelaxant effect of the extract of seeds of Oenothera odorata (SOO) and its possible mechanism responsible for this effect were examined in vascular tissues isolated from rats. Changes in vascular tension, 3',5'-cyclic monophosphate (cGMP) levels were measured in thoracic aorta rings from rats. Methanol extract of seeds of Oenothera odorata relaxed endothelium-intact thoracic aorta in a dose-dependent manner. A dose-dependent vascular relaxation was also revealed by treatment of ethylacetate, n-butanol, and H2O (aqua extract of seeds of Oenothera odorata , ASOO) extracts partitioned from methanol, but not by hexane extract. However, the vascular relaxation induced by ASOO were abolished by removal of endothelium of aortic tissues. Pretreatment of the endothelium-intact vascular tissues with NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) or 1H-[1,2,4]-oxadiazole-[4,3-α]-quinoxalin-1- one (ODQ) significantly inhibited vascular relaxation induced by ASOO. Moreover, incubation of endothelium-intact aortic rings with ASOO increased the production of cGMP. However, ASOO-induced increases in cGMP production were blocked by pretreatment with L-NAME or ODQ. The vasorelaxant effect of ASOO was attenuated by tetraethylammonium (TEA), 4-aminopyridine, and glibenclamide attenuated. On the other hand, the ASOO-induced vasorelaxation was not blocked by verapamil, and diltiazem. Taken together, the present study demonstrates that ASOO dilate vascular smooth muscle via endothelium-dependent NO-cGMP signaling pathway, which may be closely related with the function of K+ channels.
In the present study, vasorelaxant effect of the extract of seeds of Oenothera odorata (SOO) and its possible mechanism responsible for this effect were examined in vascular tissues isolated from rats. Changes in vascular tension, 3',5'-cyclic monophosphate (cGMP) levels were measured in thoracic aorta rings from rats. Methanol extract of seeds of Oenothera odorata relaxed endothelium-intact thoracic aorta in a dose-dependent manner. A dose-dependent vascular relaxation was also revealed by treatment of ethylacetate, n-butanol, and H2O (aqua extract of seeds of Oenothera odorata , ASOO) extracts partitioned from methanol, but not by hexane extract. However, the vascular relaxation induced by ASOO were abolished by removal of endothelium of aortic tissues. Pretreatment of the endothelium-intact vascular tissues with NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) or 1H-[1,2,4]-oxadiazole-[4,3-α]-quinoxalin-1- one (ODQ) significantly inhibited vascular relaxation induced by ASOO. Moreover, incubation of endothelium-intact aortic rings with ASOO increased the production of cGMP. However, ASOO-induced increases in cGMP production were blocked by pretreatment with L-NAME or ODQ. The vasorelaxant effect of ASOO was attenuated by tetraethylammonium (TEA), 4-aminopyridine, and glibenclamide attenuated. On the other hand, the ASOO-induced vasorelaxation was not blocked by verapamil, and diltiazem. Taken together, the present study demonstrates that ASOO dilate vascular smooth muscle via endothelium-dependent NO-cGMP signaling pathway, which may be closely related with the function of K+ channels.
분획의 특성상 용매의 극성에 따라 시료의 추출성분이 달라진다는 것을 착안하여 월견자 추출물의 유효성분이 어느 극성의 용매에서 효과를 보이는지 확인하고자 본 연구를 진행하였다. 그러므로 phenylephrine 전 처리로 수축시킨 백서의 흉부대동맥에 월견자 분획 추출물을 이용하여 혈관 이완효과를 확인하고 그 작용기전을 밝히고자 한다.
앞서 월견자는 수축기 혈압을 낮추는 항고혈압11) 효과가 있다고 보고 되었기 때문에 혈관이완을 효과 및 기전을 확인하는 것은 중요한 연구가 될 것이다. 따라서 ASOO의 혈관 이완효과가 내피세포 및 활성인자들에 의해 나타나는지 확인하기 위해서 실험을 진행하였다. 혈관 조직의 내피세포를 통한 이완 효과를 확인하기 위해 물리적으로 내피세포를 제거하고 실험을 진행한 결과, ASOO의 혈관 이완효과는 완전히 차단되었다.
앞서 2011년에 발표한 본 저자의 연구13)를 통하여 월견자 에탄올 추출물이 랫드 경동맥의 혈관이완에 효과적임을 보고하였다. 분획의 특성상 용매의 극성에 따라 시료의 추출성분이 달라진다는 것을 착안하여 월견자 추출물의 유효성분이 어느 극성의 용매에서 효과를 보이는지 확인하고자 본 연구를 진행하였다. 그러므로 phenylephrine 전 처리로 수축시킨 백서의 흉부대동맥에 월견자 분획 추출물을 이용하여 혈관 이완효과를 확인하고 그 작용기전을 밝히고자 한다.
고혈압 치료에 사용되어 온 organic nitrate의 작용은 가용성 guanylate cyclase (GC)를 활성화시켜 cGMP를 상승시킴으로써 이루어지며 비효소 작용 (nonenzymeatic reaction)에 의해 NO를 발생시키므로, EDRF의 혈관 이완작용도 GC의 활성에 의한 cGMP에 의한 것으로 밝혀졌다6,7). 이러한 기전을 통하여 달맞이꽃 종자 추출물이 GC에 매개된 NO/cGMP 경로에 따른 혈관이완 효과를 나타내는지 알아보기 위하여 연구를 진행하였다.
제안 방법
K+ 통로의 활성화에 의한 K+의 세포 내 유출은 세포막의 과분극을 일으켜, voltagesensitive Ca2+ 통로의 불활성화로 이어져 평활근세포 내 Ca2+ 농도 감소를 초래하게 되고 결국은 혈관 이완을 유발하게 된다19). ASOO가 이러한 이완기전에 관여하는지 살펴보기 위하여 K+통로에 대한 억제제로서 비 특이적 K+ 차단제인 4-aminopyridine, TEA와 K+ATP 만을 차단하는 sulfonylurea계 약물인 glibenclamide를 이용하여 이완효과를 살펴보았다. 그 결과, K+통로를 차단함으로써 ASOO의 이완효과가 억제되는 것을 확인하였고 K+ 통로 중 K+ATP 통하여 이완효과를 보이는 것으로 사료된다.
2 kg을 경북 영천에서 구입하여 12 L의 메탄올 (Voucher number; HBH 171-02)로 1주일간 추출한 후 회전식 감압농축기를 사용하여 농축하였다. 농축된 추출물을 물에 현탁 시킨 후 n-hexane 층 (1.1 g, HBH 171-02-H), ethyl acetate층 (14.73 g, HBH 171-02-EA), n-buthanol층 (13.43 g, HBH 171-02-B), H2O층 (6.22 g, HBH 171-02-W)을 각각 수득하였다 (Fig. 1).
본 연구는 월견자 메탄올 추출물을 n-hexane, ethyl acetate, n-butanol, H2O층으로 분획하여 얻은 추출물들의 백서의 흉부대동맥에서 혈관 이완효과를 측정하였다. 그 결과, hexane층을 제외한 분획 층에서 이완효과가 나타났으며, 그 효과는 내피세포 의존적으로 나타났다.
일정한 기저선이 유지되면 1 μM의 PE로 5분간 수축시키고 1 μM의 acetylcholine (ACh)으로 이완시켜 이완율이 90% 이상이었을 경우 혈관 내피세포가 손상 받지 않은 것으로 판정하고 실험을 진행하였다. 월견자 추출물의 이완효과의 기전을 밝히고자 여러 약물들을 20분간 전처리 하였고, PE으로 혈관 수축을 유도한 후 월견자 추출물의 농도 의존적인 이완 반응을 살펴보았다. 혈관 내피세포 비의존형 실험을 수행할 때에는 혈관 내피 세포를 물리적은 방법으로 제거하였으며, 이후 ACh에 의한 이완율이 10% 이하였을 경우 혈관 내피 세포의 손상으로 확신한 후 실험을 수행하였다.
흉부대동맥 조직에서 cGMP의 생성에 ASOO가 영향을 미치는지를 관찰하기 위하여 in vitro상태에서 cGMP 생성량을 측정하였다. 그 결과, ASOO를 처리하지 않은 군에 비해 투여한 군은 농도 의존적으로 cGMP를 생성이 증가했다(Fig.
월견자 1.2 kg을 경북 영천에서 구입하여 12 L의 메탄올 (Voucher number; HBH 171-02)로 1주일간 추출한 후 회전식 감압농축기를 사용하여 농축하였다. 농축된 추출물을 물에 현탁 시킨 후 n-hexane 층 (1.
이 연구에 사용된 acetylcholine (ACh), phenylephrine HCl (PE), NG-nitroarginine L-methyl ester (L-NAME), 1H-[1,2,4]-oxadiazole-[4,3α]-quinoxalin-1-one (ODQ), glibenclamide, tetraethylammonium (TEA). (±)-verapamil HCl, diltiazem, 3-isobutyl-1- methylxanthine (IBMX)는 Sigma Chemical Co.
데이터처리
실험 결과의 유의성은 검증은 Sigma Plot 10.0 프로그램을 이용하였으며, 실험 결과는 Students t-test를 통하여 p-value가 0.05 이하인 경우 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
무게 (weight)를 측정한 혈관 조직을 6% trichloroacetic acid (TCA) 존재 하에서 균질화 시킨 후 13,000 g에서 15분간 원심 분리하여 얻은 상층액을 물이 포화된 diethyl ether를 이용하여 3회 추출하였다. 추출액은 Speed-vac 농축기를 이용하여 농축하고 cGMP 측정은 방사면역 분석법을 이용하여 분석하였다. 간단히 설명하면, 시료와 표준물질을 50 mM sodium acetate 완충용액 (pH 4.
성능/효과
따라서, NO/cGMP계가 ASOO에 의한 혈관 이완 효과에 관여한다면 NO와 NO에 의하여 활성화 되는 sGC 또한 ASOO에 의한 혈관 이완 효과에 관여할 것으로 사료되어 NO 합성억제제인 L-NAME와 sGC 억제제인 ODQ를 전 처리 한 후 혈관이완 효과를 측정한 결과, ASOO에 의한 혈관 이완 효과가 억제되었다. 게다가 in vitro 에서 혈관조직과 ASOO를 반응시킨 결과 혈관에서 cGMP의 생성량이 증가하였고, 이 역시 L-NAME와 ODQ에 의하여 억제되는 것으로 확인하였기에 ASOO는 NO/cGMP 계를 경유하여 일어나며 그 반응은 cGMP의 생성 증가에 의한 것임을 의미한다.
ASOO가 이러한 이완기전에 관여하는지 살펴보기 위하여 K+통로에 대한 억제제로서 비 특이적 K+ 차단제인 4-aminopyridine, TEA와 K+ATP 만을 차단하는 sulfonylurea계 약물인 glibenclamide를 이용하여 이완효과를 살펴보았다. 그 결과, K+통로를 차단함으로써 ASOO의 이완효과가 억제되는 것을 확인하였고 K+ 통로 중 K+ATP 통하여 이완효과를 보이는 것으로 사료된다.
본 연구는 월견자 메탄올 추출물을 n-hexane, ethyl acetate, n-butanol, H2O층으로 분획하여 얻은 추출물들의 백서의 흉부대동맥에서 혈관 이완효과를 측정하였다. 그 결과, hexane층을 제외한 분획 층에서 이완효과가 나타났으며, 그 효과는 내피세포 의존적으로 나타났다. 따라서 분획층에서 용매에 따라 이완효과가 달리 나타나는 것을 확인하였고, 본 연구에서는 월견자 H2O층 추출물 (ASOO)을 선택하여 백서의 흉부대동맥에서 혈관 이완효과 및 그 기전에 대해 알아보았다.
ASOO의 혈관 이완 효과가 혈관내피세포 유래 산화 질소계와 cGMP의 관련성을 알아보기 위하여 비 특이적인 산화질소 억제제인 L-NAME (100 μM)와 guanylate cyclase 억제제인 ODQ (10 μM)를 전 처리하고 ASOO의 혈관 이완 효과를 측정하였다. 그 결과, 월견자 추출물의 혈관 이완 효과는 L-NAME 및 ODQ에 의해 현저히 억제되었다(Fig. 4A).
혈관 조직의 내피세포를 통한 이완 효과를 확인하기 위해 물리적으로 내피세포를 제거하고 실험을 진행한 결과, ASOO의 혈관 이완효과는 완전히 차단되었다. 그러므로 기존 연구 보고와 실험결과를 근거로 할 때 ASOO의 혈관 이완 효과는 내피세포 의존적이며 이를 통해 항고혈압 효과가 있을 것으로 사료된다. 또한 혈관 내피세포 유래 혈관 이완 인자로서 혈압 강하 효과가 큰 NO는 L-arginine으로부터 산화질소 합성 효소(NOS)에 의하여 합성된다.
반면에, L-형 Ca2+ 통로를 통한 혈관 수축과 연관이 있는지 알아보기 위하여 L-형 Ca2+ 통로 차단제인 verapamil과 diltiazem을 전 처리 한 후 혈관 이완 효과를 측정한 결과, ASOO의 혈관 이완효과는 차단되지 않은 것으로 보아 L-형 Ca2+ 통로는 관여하지 않는 것으로 확인하였다. 따라서 ASOO는 내피세포에 존재하는 아드레날린성 α1 수용체에 대하여 직접 길항하는 효과를 통한 세포내 Ca2+ 유입을 억제시켜 혈관이완 효과를 보인다고 볼 수 있다.
그 결과, hexane층을 제외한 분획 층에서 이완효과가 나타났으며, 그 효과는 내피세포 의존적으로 나타났다. 따라서 분획층에서 용매에 따라 이완효과가 달리 나타나는 것을 확인하였고, 본 연구에서는 월견자 H2O층 추출물 (ASOO)을 선택하여 백서의 흉부대동맥에서 혈관 이완효과 및 그 기전에 대해 알아보았다.
한 실험 동물 모델에서 NO 합성 효소의 만성적인 억제는 고혈압, 혈관염 등을 유발한다고 알려져 있다18). 따라서, NO/cGMP계가 ASOO에 의한 혈관 이완 효과에 관여한다면 NO와 NO에 의하여 활성화 되는 sGC 또한 ASOO에 의한 혈관 이완 효과에 관여할 것으로 사료되어 NO 합성억제제인 L-NAME와 sGC 억제제인 ODQ를 전 처리 한 후 혈관이완 효과를 측정한 결과, ASOO에 의한 혈관 이완 효과가 억제되었다. 게다가 in vitro 에서 혈관조직과 ASOO를 반응시킨 결과 혈관에서 cGMP의 생성량이 증가하였고, 이 역시 L-NAME와 ODQ에 의하여 억제되는 것으로 확인하였기에 ASOO는 NO/cGMP 계를 경유하여 일어나며 그 반응은 cGMP의 생성 증가에 의한 것임을 의미한다.
이러한 이론을 바탕으로 phenylephrine의 수축반응이 ASOO에 의하여 농도 의존적으로 유의하게 억제됨을 확인한 결과, ASOO에 의하여 억제됨을 확인하여 아드레 날린성 α1 수용체 작용함을 확인 할 수 있었다. 반면에, L-형 Ca2+ 통로를 통한 혈관 수축과 연관이 있는지 알아보기 위하여 L-형 Ca2+ 통로 차단제인 verapamil과 diltiazem을 전 처리 한 후 혈관 이완 효과를 측정한 결과, ASOO의 혈관 이완효과는 차단되지 않은 것으로 보아 L-형 Ca2+ 통로는 관여하지 않는 것으로 확인하였다. 따라서 ASOO는 내피세포에 존재하는 아드레날린성 α1 수용체에 대하여 직접 길항하는 효과를 통한 세포내 Ca2+ 유입을 억제시켜 혈관이완 효과를 보인다고 볼 수 있다.
eNOS는 세포질의 가용성 구아닐산 고리화효소 (soluble guanylate cyclase, sGC) 를 활성화 시켜 cGMP의 생성을 증가시키는 신호 전달체계를 통해 혈관 평활근을 이완 시킨다17). 본 연구에서 비특이적인 NOS 억제제인 L-NAME의 전 처리에 의해 ASOO의 이완 효과가 현저히 억제되는 것으로 보아 혈관 이완 효과는 산화질소계를 경유하여 일어나는 것으로 사료된다.
월견자 메탄올 분획물 추출물은 내피 세포 의존적으로 혈관 평활근을 이완시켰고, 그 중 물층 분획물 추출물(ASOO)을 선택하여 기전을 알아본 결과, 혈관 이완효과는 농도 의존적으로 나타났다. 혈관 조직에서의 cGMP의 생성량의 증가로 혈관이완효과가 일어남을 확인하였고, 이러한 효과는 혈관 내피세포의 제거나 산화질소 합성효소 또는 세포질 구아닐산 고리화 효소 차단 시 나타나지 않았으며, K+ATP 통로의 차단시에도 이완효과가 나타나지 않았다.
따라서 근육의 수축에 가장 중요한 인자인 평활근 세포내 Ca2+은 농도가 증가하면 calmodulin과 결합하여 myosine light chain (MLC)의 인산화를 촉진시켜 평활근을 수축시킨다20,21). 이러한 이론을 바탕으로 phenylephrine의 수축반응이 ASOO에 의하여 농도 의존적으로 유의하게 억제됨을 확인한 결과, ASOO에 의하여 억제됨을 확인하여 아드레 날린성 α1 수용체 작용함을 확인 할 수 있었다. 반면에, L-형 Ca2+ 통로를 통한 혈관 수축과 연관이 있는지 알아보기 위하여 L-형 Ca2+ 통로 차단제인 verapamil과 diltiazem을 전 처리 한 후 혈관 이완 효과를 측정한 결과, ASOO의 혈관 이완효과는 차단되지 않은 것으로 보아 L-형 Ca2+ 통로는 관여하지 않는 것으로 확인하였다.
이상의 결과를 종합해보면 ASOO의 혈관 평활근 이완 기전은 내피세포에서의 NO/cGMP 경로를 활성화 시키고, K+ATP 통로를 통한 혈관이완효과를 나타낸다고 할 수 있다. 따라서, 본 실험을 통하여 혈관이완에 탁월한 효과를 확인하였으므로 앞으로 심혈관계 질환의 연구에 유용한 정보를 제시해 줄 수 있을 것으로 사료된다.
혈관 조직에서의 cGMP의 생성량의 증가로 혈관이완효과가 일어남을 확인하였고, 이러한 효과는 혈관 내피세포의 제거나 산화질소 합성효소 또는 세포질 구아닐산 고리화 효소 차단 시 나타나지 않았으며, K+ATP 통로의 차단시에도 이완효과가 나타나지 않았다. 이와 같은 결과로 볼 때, ASOO의 혈관 평활근 이완 기전은 내피세포에서의 NO/cGMP 경로를 활성화 시켜 나타나며, KATP 통로를 통한 것으로 사료된다.
월견자 메탄올 분획물 추출물은 내피 세포 의존적으로 혈관 평활근을 이완시켰고, 그 중 물층 분획물 추출물(ASOO)을 선택하여 기전을 알아본 결과, 혈관 이완효과는 농도 의존적으로 나타났다. 혈관 조직에서의 cGMP의 생성량의 증가로 혈관이완효과가 일어남을 확인하였고, 이러한 효과는 혈관 내피세포의 제거나 산화질소 합성효소 또는 세포질 구아닐산 고리화 효소 차단 시 나타나지 않았으며, K+ATP 통로의 차단시에도 이완효과가 나타나지 않았다. 이와 같은 결과로 볼 때, ASOO의 혈관 평활근 이완 기전은 내피세포에서의 NO/cGMP 경로를 활성화 시켜 나타나며, KATP 통로를 통한 것으로 사료된다.
따라서 ASOO의 혈관 이완효과가 내피세포 및 활성인자들에 의해 나타나는지 확인하기 위해서 실험을 진행하였다. 혈관 조직의 내피세포를 통한 이완 효과를 확인하기 위해 물리적으로 내피세포를 제거하고 실험을 진행한 결과, ASOO의 혈관 이완효과는 완전히 차단되었다. 그러므로 기존 연구 보고와 실험결과를 근거로 할 때 ASOO의 혈관 이완 효과는 내피세포 의존적이며 이를 통해 항고혈압 효과가 있을 것으로 사료된다.
후속연구
이상의 결과를 종합해보면 ASOO의 혈관 평활근 이완 기전은 내피세포에서의 NO/cGMP 경로를 활성화 시키고, K+ATP 통로를 통한 혈관이완효과를 나타낸다고 할 수 있다. 따라서, 본 실험을 통하여 혈관이완에 탁월한 효과를 확인하였으므로 앞으로 심혈관계 질환의 연구에 유용한 정보를 제시해 줄 수 있을 것으로 사료된다.
혈관 활성물질들은 혈관 이완에 영향을 미치므로 혈압조절에 있어 정상 혈압을 유지하는데 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 앞서 월견자는 수축기 혈압을 낮추는 항고혈압11) 효과가 있다고 보고 되었기 때문에 혈관이완을 효과 및 기전을 확인하는 것은 중요한 연구가 될 것이다. 따라서 ASOO의 혈관 이완효과가 내피세포 및 활성인자들에 의해 나타나는지 확인하기 위해서 실험을 진행하였다.
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