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문제 정의
- 흡착되었던 물질이 용리되는 일어나 분석효율을 저하시키는 원인이 된다. 본 연구에서 적당한 카트리지를 선정하기위하여 카트리지의 고체상의 양에 따라, 분석하는 시료량에 따른 추출효율의 변화를 살펴보았다. 카트리지의 용량이 60 mg과 200 mg인 것을 사용하고 시료량을 300 mL에서 1500 mL까지 변화시키면서 회수율의 분석하여 그 결과를 Table 5에 나타내었다.
- 본 연구에서는 내분비계장애물질로 추정되는 페놀성 화합물의 전구물질이며 그 자체로도 많은 독성을 가지고 있는 페놀에 대하여 고체상추출법을 이용하여 전처리 및 농축하여, 형광검출기 (FLD, Fluorescence Detector)에 의한 HPLC법과 MSD(Mass Selective Detector)를 이용한 HPLC법으로 각각 분석방법을 설정하고 그 방법의 최적조건을 확립하고 회수율 등 신뢰도를 평가하여 보았다.
제안 방법
- 12-14 그러나 고속액체그로마토그래피법을 이용할 경우에는 이러한 유도체과정 없이 분석할 수 있기 때문에 최근에는 페놀 및 페놀성화합물의 분석에 많은 연구가 보고되고 있다.1, 2, 9 대부분의 경우는 UV등을 이용해서 분석하나 본 연구에서는 형광검출기와 질량선택성검출기를 이용하여 분석하였다. 이동상은 여러 가지가 보고되고 있으나 간단한 용매를 사용하기위하여 물/메탄올계를 사용하였으며, 추후에 클로로페놀등 페놀성 화합물과 동시분석에 이용하기위하여 아세트산이 첨가된 이동상을 이용하였다.
- 1. 페놀의 추출 및 농축방법으로 고체상 추출법을 사용하였고, 용출용매로는 회수율 뿐만 아니라 독성 및 차후의 응용성 등을 고려하여 메탄올을 선정하였으며, 용출용매량은 5 mL, 카트리지는 OasisTM HLB (60 mg/3 cc)를 사용하였다.
- Dichloromethane, acetone, acetonitrile, n-hexane, methyl t-butylether는 Wako사의 잔류농약시험용을, methanol 은 Fischer chemicals의 HPLC용을, acetic acide Wako사의 비수적정용을 사용하였다. Phenole Kanto Chemical, 1.
- 고체상에 흡착된 페놀을 용리시키는 용매의 최적량을 측정하기위하여 페놀 5.0 ng을 주입한 후 용출용매를 1 mL씩 순차적으로 받아서 분석하였다. 분석결과 4 mL까지의 용리액에서 90%이상 용출되었다.
- 8 순상기법에 사용되는 대표적인 카트리지가 ODS 계열이며, 수질시료와 같이 수용성시료에 대하여 C18카트리지가 일반적으로 사용되고 있다. 그러나 페놀과 같이 극성이 크고 이온성인 화합물의 경우에는 적합하지 않아 본 연구에서는 고분자 흡착제를 이용한 Oasis HLB(Hydrophilic-Lipophilic- Balance) 카트리지를 사용하였다.16 이는 친유기성 부분인 divinylbenzene과 친수성 부분인 N-vinyl pyrrolidone 의 두 단위체가 결합된 Copolymer를 사용한 것으로 일반적인 카트리지 충전제와는 달리 수용성과 지용성 시료에 모두 적용가능하다.
- 또한 페놀의 농도에 따른 정량성을 알아보기 페놀의 첨가량을 1.0 ng~10 ng 범위에서 변화시키면서 Scheme 1의 방법에 따라 정제 농축 분석을 하였다.분석결과 회수율은 89.
- 16 이는 친유기성 부분인 divinylbenzene과 친수성 부분인 N-vinyl pyrrolidone 의 두 단위체가 결합된 Copolymer를 사용한 것으로 일반적인 카트리지 충전제와는 달리 수용성과 지용성 시료에 모두 적용가능하다. 먼저 고체상에 흡착된 페놀을 가장 효과적으로 용출할 수 있는 용매를 선택하기 위해서 t-butyl methyl ether, acetone, acetonitrile, methanol로 각각 실험하였다. 활성화 시킨 각각의 cartridge에 페놀 표준용액 5.
- 본 연구에서는 수질시료에 대하여 정제 농축하는 전처리 방법으로 카트리지를 사용하는 고체상추출법을 이용하고, HPLC/FLD 및 HPLC/MSD법을 이용하여 분리 정량하는 분석방법을 확립하였다.
- 수질중의 페놀을 고속액체크로마토그래피를 이용하여 분석하여 보았다. 페놀 및 페놀성 화합물은 극성이 크고 acidic hydroxy group을 가지고 있어 일반적인 가스크로마토그래피로는 미량분석이 어려워 보통 유도체를 만들어서 분석하는 것이 일반적인 방법이다.
- 시료는 0.45 µm GF/C filter(Whatman)를 이용하여 여과하고, 화합물의 변화를 방지하고 추출효율을 최적화시키기 위하여 묽은 인산으로 pH 3이 되도록 조정한 후 일정량을 취하여 분석용 시료로 한다.
- 후에 위에서 전처리된 시료를 활성화된 카트리지에 5~10 mL/min의 유속으로 흘려 통과시킨다. 시료를 모두 통과시킨 다음 수분이 제거되도록 충분히 air-aspiration한 후 메탄올 5 mL로용리시키고(Scheme 1), 용리액을 40 oC 항온수조에서 질소 기체를 이용하여 1 mL까지 농축한 다음 Table 1 과 2의 조건으로 조절된 HPLC/FLD와 HPLC/MSD에 주입하여 분석한다. 형광검출기의 검출한계는 s/n=5 일때 피크면적으로 계산하면 0.
- 1, 2, 9 대부분의 경우는 UV등을 이용해서 분석하나 본 연구에서는 형광검출기와 질량선택성검출기를 이용하여 분석하였다. 이동상은 여러 가지가 보고되고 있으나 간단한 용매를 사용하기위하여 물/메탄올계를 사용하였으며, 추후에 클로로페놀등 페놀성 화합물과 동시분석에 이용하기위하여 아세트산이 첨가된 이동상을 이용하였다. 분석에 사용된 고속액체크로마트그래프의 컬럼은 예비실험결과 ODS 컬럼보다 분리능이 좋고 피크 끌림이 적게 나타나는 Octyl(C8)의 역상컬럼을 사용하였다.
- 표에 나타난 바와 같이 pH 4일 때 회수율 83%를 정점으로 감소하는 경향을 나타내어 다른 문헌2의 결과와도 일치함을 알 수 있었다. 이러한 결과를 토대로 하여 실제 시험법에서는 시료 채취시 인산(1+10)을 가지고 pH를 3으로 조절한 후 실험실로 옮겨서 고체상 추출법 이용 시료를 정제 및 농축하여 분석하였다.
- 분석결과 4 mL까지의 용리액에서 90%이상 용출되었다. 이러한 결과에 따라 본 실험에서는 메탄올 5 mL를 사용하여 분석물질을 용리시키고 질소기체를 이용하여 1 mL로 농축하여 시험용액으로 하였다.
- 이와 같은 시험결과를 모두 고려하여 본 연구에서는 HLB 3 cc/60 mg cartridge를 사용하고 시료량은 1 1.이내로 하여 Scheme 1의 시험법에 따라 페놀을 전처리하여 분석하는 방법을 확립하였다.
- 페놀 표준용액을 이용하여 각 용액에 5.0 ng 씩을 첨가하여 카트리지에 주입한 후 용리시켜 분석하였다. 시험용액의 부피가 60mg 카트리지는 500mL, 200mge 1000 mL를 넘으면 흡착된 페놀이 용출되어 회수율이 떨어지는 것으로 시험결과에 나타났다.
- 6 mm, Length 250 mm)을 사용하였다. 형광검출기를 사용하는 system에선 λex 215 nm, λem 313 nm에서 검출하였으며, 이동상은 비저항값 18 MΩ 이상인 증류수에 1% acetic acid 용액과 HPLC용 methanol에 1% acetic acid를 첨가한 용액을 membrane filter하여 Table 1과 같이 gradient elution하였다. MSD를 사용하는 시스템에서 이동상은 단순히 75% methanol 사용하였으며 자세한 조건은 Table 2에 나타내었다.
- 이용하여 회수율 실험을 하였다. 활성화 시킨 cartridge에 phenol 표준용액을 5.0 ng을 첨가하고 methanol 5 mL로 용리시켜 분석하였다. 그 결과를 tC18를 사용한 경우는 회수율이 10.
대상 데이터
- 비수적정용을 사용하였다. Phenole Kanto Chemical, 1.0 mg/mL의 표준원액을 methanol로 희석해서 실험에 적당한 표준용액을 조제하여 사용하였다.
- 분석에 사용된 고속액체크로마트그래프의 컬럼은 예비실험결과 ODS 컬럼보다 분리능이 좋고 피크 끌림이 적게 나타나는 Octyl(C8)의 역상컬럼을 사용하였다. 검출기는 페놀에 대하여 감도가 훨씬 좋은 형광검출기를 선택하여 사용하였으며, 여기파장(λex) 215 nm, 형광파장(Em) 313 nm에서 측정하였다. Table 1의 조건에 따라 분석한 크로마토그램은 Fig.
- 고체상 추출 카트리지는 수질시료에 가장 보편적으로 사용되는 Water사의 Sep-pak tC18 Environmental cartridge과 Oasis HLB 3 cc/60 mg cartridge, 6 cc/200 mg cartridge 사용하였으며, 용출장치는 Alltech사의 Vacuum Manifold(Alltech Associates, Illinois, USA) system을 사용하였다.
- 8%로 비슷하였으며, HLB에서는 거의 모든 용매에서 80% 이상을 나타내었으나, 메탄올이 가장 높았다. 따라서 회수율도 좋고 사용하기도 편리한 메탄올을 용출용매로 선정하였다.
- 사용하였다. 분리 분석컬럼은 Alltech사(Alltech Associates, Illinois, USA)의 ADSORBOSPHERE XL C8 300A 5U(ID 4.6 mm, Length 250 mm)을 사용하였다. 형광검출기를 사용하는 system에선 λex 215 nm, λem 313 nm에서 검출하였으며, 이동상은 비저항값 18 MΩ 이상인 증류수에 1% acetic acid 용액과 HPLC용 methanol에 1% acetic acid를 첨가한 용액을 membrane filter하여 Table 1과 같이 gradient elution하였다.
- 이동상은 여러 가지가 보고되고 있으나 간단한 용매를 사용하기위하여 물/메탄올계를 사용하였으며, 추후에 클로로페놀등 페놀성 화합물과 동시분석에 이용하기위하여 아세트산이 첨가된 이동상을 이용하였다. 분석에 사용된 고속액체크로마트그래프의 컬럼은 예비실험결과 ODS 컬럼보다 분리능이 좋고 피크 끌림이 적게 나타나는 Octyl(C8)의 역상컬럼을 사용하였다. 검출기는 페놀에 대하여 감도가 훨씬 좋은 형광검출기를 선택하여 사용하였으며, 여기파장(λex) 215 nm, 형광파장(Em) 313 nm에서 측정하였다.
-
2. 분석기기 및 분리
분석에는 형광검출기(G1315B)와 Photodiode array detector(G1315B)가 부착된 Agilent Technologies 사의 HP1100 series HPLC system과 MSD(G1956B)와 UV(G1315B)가 부착된 HPLC system을 두 가지 system을 사용하였다
. 분리 분석컬럼은 Alltech사(Alltech Associates, Illinois, USA)의 ADSORBOSPHERE XL C8 300A 5U(ID 4. - 용리액으로 선정된 methanol을 이용하고 본 연구에 적당한 카트리지를 정하기 위하여 Sep-pak tC18 cartridge와 Oasis HLB cartridge 2종(60 mg과 200 mg)을 이용하여 회수율 실험을 하였다. 활성화 시킨 cartridge에 phenol 표준용액을 5.
이론/모형
- 본 연구에서는 페놀을 정제 농축하기 위한 방법으로 고체상추출법을 사용하였다. 고체상 추출법도 크로마토그래피와 같이 순상, 역상의 기법이 이용되며, 수질시료와 같이 극성이 큰 용매에 용해되어 있는 시료에 대하여 가장 일반적으로 사용되는 방법이 순상기법을 이용하는 것이다.
성능/효과
- 2. 본 연구에서 확립한 분석방법의 신뢰도를 확인하기 위한 회수율 실험결과 86.0~89.0%(평균 87.0%, RSD=1.2%(n=5))으로 좋은 결과를 얻을 수 있었다. 정량성과 직선성을 나타내는 상관계수는 0.
- 3. HPLC/FLD와 HPLC/MSD의 분석법을 비교한 결과 검출한계는 0.05 ng과 0.4 ng으로 나타나 형광검출기에서 더 낮게 나타나 일상적인 분석법으로 사용할 수 있음을 확인할 수 있었으며, 메트릭스(방해물질) 가 복잡한 시료에서는 질량분석기를 이용한 방법으로 정확한 분석을 할 수 있는 시험방법을 확립하였다.
- 9%(n=3)로 낮게 나타나 본 연구에는 사용할 수 없었다. HLB cartridge 경우 두 종류 cartridge 모두에서 100%의 희수율을 보여 본 연구에 사용하기에 적합한 것으로 판단되었다.
- 0 ng을 첨가하고 methanol 5 mL로 용리시켜 분석하였다. 그 결과를 tC18를 사용한 경우는 회수율이 10.8±2.9%(n=3)로 낮게 나타나 본 연구에는 사용할 수 없었다. HLB cartridge 경우 두 종류 cartridge 모두에서 100%의 희수율을 보여 본 연구에 사용하기에 적합한 것으로 판단되었다.
- 본 연구에서 확립한 고체상추출법을 이용한 HPLC 분석방법의 신뢰도를 확인하기 위하여 농도가 0.5 µg/mL인 페놀 표준용액을 증류수에 첨가하여 Scheme 1 의 방법에 따라 5회 반복하여 실험하였으며, 그 결과 전체적인 회수율은 86~89%±1.2(평균 87.0%, n=5)로 좋은 결과를 얻을 수 있었다.
- 0 ng~10 ng 범위에서 변화시키면서 Scheme 1의 방법에 따라 정제 농축 분석을 하였다.분석결과 회수율은 89.9±7.1%(n=3)이었고, 이때에 상관계수 R2=0.999로 좋은 직선성 및 정량성도 있음을 확인할 수 있었다(Fig. 5). 이와 같은 결과를 종합하여 볼 때 본 연구에서 설정 확립한 Scheme 1에 나타낸 페놀분석법은 실제로 수질시료에 적용하여 분석할 수 있을 것으로 판단된다.
- 5). 이와 같은 결과를 종합하여 볼 때 본 연구에서 설정 확립한 Scheme 1에 나타낸 페놀분석법은 실제로 수질시료에 적용하여 분석할 수 있을 것으로 판단된다.
- LC에서는 현재 API(atmospheric pressure ionization) sources에 의하여 분석이 이루어지기 때문에 molecular ion peak나 M-1 또는 M+23 피크가 base peak로 나타난다. 페놀의 분석에서도 M-1(m/z=93) 피크를 base peak로 하여 M·(m/z=94), M-(OH group) (m/z=77)이 정확하게 나타나 페놀임을 확인할 수 있었다.
- 0 ng을 주입시키고 선택된 각각의 용매 5 mL로 elution시켜 분석하고 그 결과를 Table 3에 나타내었다. 표에 나타난 바와 같이 tC18에서는 모든 용매에서 평균이 6.2%~7.8%로 비슷하였으며, HLB에서는 거의 모든 용매에서 80% 이상을 나타내었으나, 메탄올이 가장 높았다. 따라서 회수율도 좋고 사용하기도 편리한 메탄올을 용출용매로 선정하였다.
후속연구
- 4 ng(s/n=5)로 측정되어 10배 정도 질량분석기의 감도가 낮은 것을 확인할 수 있었다. 그러나 메트릭스(방해물질)가 복잡한 오·폐수등의수질시료에서는 페놀의 검출시간대에서 피크가 나타나는 등 겹침피크가 나타날 가능성이 높아 정확한 분석을 위하여 질량분석기를 이용하는 것이 바람직할 것으로 판단되었다.
- 내분비계장애물질 및 priority pollutants의 전구물질이면서 살균소독제로 많이 사용되는 페놀은 그 독성 및 환경지속성 때문에 앞으로 더 엄격한 규제가 이루어 질 것이며, 이를 위해 정확한 분석법이 필요할 것이다. 본 연구에서는 수질시료에 대하여 정제 농축하는 전처리 방법으로 카트리지를 사용하는 고체상추출법을 이용하고, HPLC/FLD 및 HPLC/MSD법을 이용하여 분리 정량하는 분석방법을 확립하였다.
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