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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 안전한 굴 섭취 요령의 기초자료로 활용하고자 가열온도 및 처리시간에 따라 인위감염 시킨 오염 굴 중의 male specific coliphage와 노로바이러스 농도변화를 파악하여 각굴 중의 노로바이러스를 제거 하기 위한 적절한 가열온도와 가열처리 시간을 조사하였다.
- 인간 분변 유래 장관계바이러스 오염의 잠정적인 지표로써 활용되고 있는 MSC가 각굴에서 가열처리 온도 및 시간에 따라 불활성화되는 정도를 파악하기 위하여 조사하였으며, 그 결과 를 표 3에 나타내었다. 가열처리전 오염굴 중의 MSC 농도는 4,107 PFU/100 g이었으나, 85℃에서 5분간만 가열처리 하여도 MSC는 모두 불활성화가 이루어지는 것으로 확인이 되었다.
- 추출된 RNA로부터 노로바이러스 유전자 검출과 가열온도 및 처리시간에 따른 노로바이러스 농도변화를 조사하기 위하여 다음과 같이 수행하였다. Real time RT-PCR 반응을 위하여 OneStep RT-PCR kit (QIAgen, USA) 및 RNase inhibitor (Ambion, USA) 시약을 사용하였다.
제안 방법
- 85℃ 및 100℃로 설정된 항온수조에 노로바이러스와 MSC가 오염되어 있는 각굴을 수침한 후 5분, 10분, 15분 및 20분 동안 각각 가열처리 하였다. 각 가열처리 조건에 따라 24개체의 각굴을 사용하였으며, 실험에 사용된 각굴의 평균 각장과 각고 그리고 평균 무게는 각각 9.
- 추출된 RNA로부터 노로바이러스 유전자 검출과 가열온도 및 처리시간에 따른 노로바이러스 농도변화를 조사하기 위하여 다음과 같이 수행하였다. Real time RT-PCR 반응을 위하여 OneStep RT-PCR kit (QIAgen, USA) 및 RNase inhibitor (Ambion, USA) 시약을 사용하였다. 폴리오바이러스의RNA를 internal control RNA (IC, US FDA 제공)로 첨가하여 반응이 적절히 이루어지는지 확인하였으며 음성대조군으로 RNase-free water를 사용하여 실험의 신뢰성을 확보하였다.
- 각굴을 가열처리하여 섭취할 경우 적절한 가열온도 및 가열시간을 파악하기 위하여 노로바이러스와 MSC의 오염이 확인된 각굴 속에 존재하는 굴에 영향을 미칠 수 있는 온도와 노로바이러스와 MSC가 열처리에 의해 파괴시킬 수 있는 온도를 고려하여 가열처리 온도를 설정하였다.
- 굴 중에 함유되어 있는 MSC는 Cabelli VJ (1988)의 한천 중첩법 (agar overlay method)을 일부 변형하여 사용하였다. 실험에 사용한 MSC 숙주세포는 Escherichia coli HS (pFamp) R (ATCC 700891)을 사용하였으며, 균질화된 굴 시료 20 g에 growth broth (tryptone 10 g, dextrose 1.
- 굴에서 노로바이러스 분리는 Jothikumar et al. (2005)의 방법을 일부 변형하여 사용하였다. 가열처리된 굴로부터 분리된 중장선에 3 g에 동량의 300 μg/mL Proteinase K solution (Promega, USA)을 첨가하였으며, 호모게나이저로 완전히 균질화하였다.
- 노로바이러스 유전자 검출을 위하여 Table 1의 primer와probe를 이용하여 25× enzyme mix 0.5 μL, 5×buffer 5 μL,10×dNTPs 1 μL, RNase inhibitor (5 units/ μL) 0.25 μL, 10μM primer (Forward 및 Reverse) 1 μL, 10 μM IC primer (Forward 및 Reverse) 0.5 μL, 10 μM probe (노로바이러스 및 IC) 0.5 μL, IC RNA 1 μL, 추출한 RNA 5 μL로 반응액을 조성한 후, 멸균증류수를 첨가하여 최종적으로 25 μL의 반응액을조성하였으며, 유전자 증폭을 위해서는 Thermal cycler dice TP800 (Takara, Japan)를 이용하여 50℃에서 50분간 reverse transcription을 수행하고, 95℃에서 15분간 DNA를 변성하였다.
- 노로바이러스에 오염된 각굴을 가열처리 온도 및 처리시간에 따른 노로바이러스 농도변화를 real time RT-PCR로 분석하였으며, 그 결과를 Table 4와 Table 5에 나타내었다. 노로바이러스 감염굴 중의 GⅠ형의 가열처리전 농도는 1.
- 또한 AW2 완충액 500 μL를 각각 첨가하여 20,000g에서 3분간 원심분리 하였으며, 원심분리 후 spin column에 걸러진 용액은 제거하였다.
- 반응액에 95-100% 에탄올1,120 μL을 첨가하여 혼합하였으며, 혼합액을 630 μL를 spin column tube로 옮겨 6,000 g에서 1분간 원심분리 하였다.
- 이 후 95℃에서 10초, 53℃에서 25초, 62℃에서 70초로 45 cycles를 반복하였다. 양성대조군으로 노로바이러스 RNA (Takara, Japan)를 사용하고, 음성대조군으로 멸균증류수를 사용하였다.
- 참굴(Crassostrea gigas)의 여과섭이 활동이 저해 받지 않게 사각 채롱에 참굴을 넣은 후 대규모 주거시설과 상업시설이 위치하고 있으며 하수처리장의 배출수가 유입되고 있는 부산시 용호항 부근의 해상구조물에 참굴이 들어 있는 사각 채롱을 설치한 후 노로바이러스 및 MSC가 참굴에 자연적으로 오염되도록 14일간 인위감염을 실시하였으며, 각굴 중의 노로바이러스와 MSC의 오염 정도를 확인하기 위하여 7일 간격으로 각각 12개체를 채취하여 실험에 사용하였다.
- Real time RT-PCR 반응을 위하여 OneStep RT-PCR kit (QIAgen, USA) 및 RNase inhibitor (Ambion, USA) 시약을 사용하였다. 폴리오바이러스의RNA를 internal control RNA (IC, US FDA 제공)로 첨가하여 반응이 적절히 이루어지는지 확인하였으며 음성대조군으로 RNase-free water를 사용하여 실험의 신뢰성을 확보하였다.
- 가열처리전 오염굴 중의 MSC 농도는 4,107 PFU/100 g이었으나, 85℃에서 5분간만 가열처리 하여도 MSC는 모두 불활성화가 이루어지는 것으로 확인이 되었다. 한편 노로바이러스 정량분석을 위한 표준곡선은 GⅠ 및 GⅡ양성 RNA(Takara, Japan)를 105-101copies/reaction으로 희석하여 분석하였다. 표준곡선의 선형분석 결과, GⅠ형은 상관계수(R2) 0.
- 한편, 가열처리된 각굴은 즉시 패각을 분리하여 알굴을 무균적으로 회수하여 즉시 노로바이러스 및 MSC 분석을 실시하였다.
대상 데이터
- 각 가열처리 조건에 따라 24개체의 각굴을 사용하였으며, 실험에 사용된 각굴의 평균 각장과 각고 그리고 평균 무게는 각각 9.7±1.4 cm, 4.6±0.9 cm, 61.8±15.9 g이었다.
- 굴 중에 함유되어 있는 MSC는 Cabelli VJ (1988)의 한천 중첩법 (agar overlay method)을 일부 변형하여 사용하였다. 실험에 사용한 MSC 숙주세포는 Escherichia coli HS (pFamp) R (ATCC 700891)을 사용하였으며, 균질화된 굴 시료 20 g에 growth broth (tryptone 10 g, dextrose 1.0 g, NaCl 5.0 g, water 1,000 mL) 10 mL 첨가하여 혼합한 후 9,000 g에서 15분간 원심분리하고, 상징액을 회수하여 MSC 분석 시료로 사용하였다.
- 인위감염 7일차에는 굴 중의 MSC와 노로바이러스(GⅠ & GⅡ) 오염정도는 1,380 PFU/100 g, 9.24×101 copies/g 및 2.30×102 copies/g으로 확인되었으며, 인위감염 14일차때는 MSC와 노로바이러스 오염정도는 4,107 PFU/100 g, 1.04×104 copies/g및 5.73×104 copies/g으로 나타나, 가열처리 온도 및 시간에 따라 오염굴 중의 MSC와 노로바이러스 농도변화 조사 시료로 사용하였다.
이론/모형
- 가열온도 및 가열시간에 따른 각굴 중의 노로바이러스 및 MSC 농도변화를 조사하기 위한 노로바이러스 및 MSC 감염은 naturally-contamination 방법을 이용하여 인위적으로 감염시켰다(Shin et al., 2014).
- 면역력이 약한 노약자 등이 오염된 굴 섭취로 인한 식중독 사고 예방을 위한 적절한 가열처리 온도 및 시간을 권고하기 위하여 각굴을 naturally-contamination 방법으로 노로바이러스와 MSC를 오염시켰으며, 그 결과를 Table 2에 나타내었다. 인위감염 7일차에는 굴 중의 MSC와 노로바이러스(GⅠ & GⅡ) 오염정도는 1,380 PFU/100 g, 9.
성능/효과
- 인간 분변 유래 장관계바이러스 오염의 잠정적인 지표로써 활용되고 있는 MSC가 각굴에서 가열처리 온도 및 시간에 따라 불활성화되는 정도를 파악하기 위하여 조사하였으며, 그 결과 를 표 3에 나타내었다. 가열처리전 오염굴 중의 MSC 농도는 4,107 PFU/100 g이었으나, 85℃에서 5분간만 가열처리 하여도 MSC는 모두 불활성화가 이루어지는 것으로 확인이 되었다. 한편 노로바이러스 정량분석을 위한 표준곡선은 GⅠ 및 GⅡ양성 RNA(Takara, Japan)를 105-101copies/reaction으로 희석하여 분석하였다.
- 노로바이러스 감염굴 중의 GⅠ형의 가열처리전 농도는 1.04×104 copies/g이었지만, 85℃에서 5분간 가열처리에는 3.95×103 copies/g,20분간 가열처리에는 1.40×103 copies/g으로 0.87 log만 감소하였지만, 100℃에서 5분간 가열처리에는 2.33×102 copies/g로 1.65 log 감소하였고, 10분간 가열처리 후부터는 오염굴에서 노로바이러스 GⅠ는 불검출이었으며, Shin et al. (2014)이노로바이러스에 오염된 알굴을 70℃에서 15분간 가열처리 하였을 때 노로바이러스 GⅠ의 농도는 약 1.0 log 감소하였고,100℃에서 15분간 가열처리 했을 경우에는 GⅠ은 불검출 되었다는 조사결과하고 비슷하였다.
- 본 연구에서 사용된 각굴은 인위감염을 통해 다소 높은 농도의 바이러스가 감염된 굴이므로 굴 생산해역에서의 각굴 중의 노로바이러스 농도와 같이 노로바이러스 오염 정도가 낮은 각 굴에 대한 가열처리 효과는 가열처리온도 및 시간에 따라 노로바이러스 농도의 감소율이 더 높아질 것으로 추정된다.
- 한편 노로바이러스 정량분석을 위한 표준곡선은 GⅠ 및 GⅡ양성 RNA(Takara, Japan)를 105-101copies/reaction으로 희석하여 분석하였다. 표준곡선의 선형분석 결과, GⅠ형은 상관계수(R2) 0.999, 기울기는 -3.300으로 나타났고, GⅡ형은 상관계수(R2) 0.999, 기울기는 -3.315으로 나타났으며, 표준곡선에 real time RT-PCR 결과의 Ct value를 대입하여 시료 중의 노로바이러스 농도를 정량하였으며, 최종 결과값은 시료당 3회 실험 결과의 평균으로 나타내었다.
후속연구
- 이상의 결과, 노로바이러스에 의한 굴 양식장 오염은 위생처리되지 않은 분변 유입에서 기인된 것으로 관리조치가 이행되지 않은 오염원이 굴 양식장 주변에 존재한다면 노로바이러스에 오염된 굴 섭취로 인한 식중독 사고는 언제든지 발생할 위험성이 상존해이기 때문에 안전한 굴 생산을 위해서는 굴 양식장 주변에 위치하고 있는 육ㆍ해상오염원의 관리조치가 반드시 이루어져야 한다.
- 한편, 오염굴 중의 노로바이러스 감염농도에 따라 가열처리온도 및 시간에 따른 오염굴 중의 노로바이러스 농도변화에 대한 추가적인 연구가 필요하지만, Hewitt and Greening (2006)은 뉴질랜드 담치(Greenshell mussels Perna canaliculus) 섭취에 따른 노로바이러스 식중독을 예방하기 위해서는 100℃ 물에서 최소 3분간 가열처리해야 한다는 연구결과와 상기의 조사결과를 종합해 볼 때, 면역력이 약한 노약자나 어린아이들이 굴을 안전하게 섭취하기 위해서는 날 것으로 섭취하기 보다는 100℃ 물에서 10분 이상 충분하게 가열 조리한 후 섭취하는 것이 굴 섭취로 인한 노로바이러스 식중독 사고를 예방을 할수 있을 것으로 사료된다.
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