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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 농산 부산물의 일종인 배추 겉잎의 이용성을 증진시키기 위하여 배추의 불용성 식이섬유소의 일종인 hemicellulose를 가수분해하여 기능성 식품소재 및 식품첨가물로서의 이용성이 높은 수용성 식이섬유를 함유한 가수분해물을 생산하고자 하였다. 먼저 이를 위해 효소에 의한 hemicellulose 분획의 최적 분해 조건을 설정하고, 생산된 식이섬유의 분자량을 변화를 측정하였다.
- 본 연구에서는 농산부산물인 배추 겉잎의 이용성을 증진시키기 위하여 배추의 불용성 식이섬유인 hemicellulose를 분획한 후 효소 처리하여 수용성 식이섬유를 함유한 가수분해물을 생산하고자 하였다. 이를 위해 다양한 pH, 온도, 기질농도 및 효소농도에서 hemicellulose 분획을 효소 처리한 후 환원당 함량을 측정한 결과, pH 5.
제안 방법
- 배추의 hemicellulose 분획을 분해하기 위한 효소의 최적 분해 조건을 설정하기 위해 pH (3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0), 온도(30, 40, 50, 60°C) 및 효소농도(Shearzyme plus; 15, 30, 45, 60 unit, Viscozyme L; 7, 14, 21, 28 unit)를 변화시키면서 가수 분해물인 xylose의 생성량을 DNS법을 이용해 측정하였다.
- 따라서 본 연구에서는 농산 부산물의 일종인 배추 겉잎의 이용성을 증진시키기 위하여 배추의 불용성 식이섬유소의 일종인 hemicellulose를 가수분해하여 기능성 식품소재 및 식품첨가물로서의 이용성이 높은 수용성 식이섬유를 함유한 가수분해물을 생산하고자 하였다. 먼저 이를 위해 효소에 의한 hemicellulose 분획의 최적 분해 조건을 설정하고, 생산된 식이섬유의 분자량을 변화를 측정하였다.
- , Seoul, Korea)를 이용하여 200 rpm으로 3시간 교반하였다. 반응액을 원심분리(Supra-21K, Hanil, Incheon, Korea)하여 얻은 상층액을 hemicellulose 분획으로 하였다. 상층액은 −40℃ deep freezer (MDF-415, Sanyo)에 보관하여 수용성 식이섬유소 함유 가수분해물 생산을 위한 효소 분해에 사용하였다.
- 알칼리 전처리된 시료로부터 수용성 식이섬유를 제조하기 위해 효소 가수분해를 시행하였으며, hemicellulose 분획의 최적 분해 조건하에서 72시간까지 효소 분해를 실시하였다. 즉, pH 5.
- 알칼리 전처리된 시료로부터 수용성 식이섬유를 제조하기 위해 효소 가수분해를 시행하였으며, hemicellulose 분획의 최적 분해 조건하에서 72시간까지 효소 분해를 실시하였다. 즉, pH 5.0으로 조절한 500 mL의 hemicellulose 분획을 최적 분해 온도인 50℃의 shaking incubator (KMC-8480SF, Vision Scientific Co., Daejeon, Korea)에서 1시간 동안 incubation 한 뒤, Shearzyme plus (45 unit)와 Viscozyme (21 unit)을 첨가하여 72시간 효소 분해하였다. 각 효소를 이용하여 반응 시간에 따른 수율을 측정하기 위해 24시간 간격으로 분해액을 채취하였고, 90℃의 waterbath에서 3분간 가열하여 효소를 불활성화시켰다.
- , Daejeon, Korea)에서 1시간 동안 incubation 한 뒤, Shearzyme plus (45 unit)와 Viscozyme (21 unit)을 첨가하여 72시간 효소 분해하였다. 각 효소를 이용하여 반응 시간에 따른 수율을 측정하기 위해 24시간 간격으로 분해액을 채취하였고, 90℃의 waterbath에서 3분간 가열하여 효소를 불활성화시켰다. 다음 분해액을 여과하여 미분해된 잔사를 제거한 후 얻은 여액을 동결건조 하여 수용성 식이섬유를 생산하였다.
- 즉, 분획 1 mL에 5% phenol 용액 1 mL를 가해 vortex한 후 진한 황산 5 mL를 넣어 실온에 20분 동안 방치한 다음 480 nm에서 흡광도를 측정하여 총당 함량에 대한 chromatogram을 작성하였다.
- 즉, 분획 1 mL에 5% phenol 용액 1 mL를 가해 vortex한 후 진한 황산 5 mL를 넣어 실온에 20분 동안 방치한 다음 480 nm에서 흡광도를 측정하여 총당 함량에 대한 chromatogram을 작성하였다. 분자량 분포는 분자량이 12,000, 25,000, 50,000, 80,000 Da인 dextran 표준품(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 사용하여 비교하였다. 먼저 위의 조건에 따라 표준품을 gel chromatography한 결과, 분자량 12,000 Da dextran 은 fraction number 82-92 사이에서 peak가 확인되었으며, 분자랑 25,000 Da dextran은 fraction number 60-68 사이에서 peak가 확인되었다.
- 식이섬유를 함유한 가수분해물의 생산을 위한 pH의 최적 조건을 설정하기 위하여 pH를 3.0에서 7.0까지 조절하여 효소 분해하였고, 분해물의 환원당량을 측정한 결과는 Table 1과 같다. 분해물의 환원당 함량은 반응 72시간까지 유의적으로 증가하였으며, 대체적으로 72시간에서 효소 분해에 의한 생성된 환원당량이 가장 높았다.
- 5에서 가장 높은 수율을 보였다고 보고하여 본 연구 결과와 유사하였다. 따라서 Viscozyme L을 이용한 hemicellulose 분해를 위한 pH는 유의적인 차이는 없으나 분해율이 가장 높은 pH 5.0을 최적 조건으로 설정하였다.
- 43 mg/L인 효소량 21 unit와는 유의적인 차이를 보이지 않았다. 따라서 효소의 효율성에 따른 식이섬유의 생산량을 감안하여 효소 농도를 21 unit으로 설정하였다. 대두 부산물인 okara를 Vicozyme L로 가수분해 하여 대두 올리고당을 제조한 결과(27), 10 unit의 효소 첨가가 올리고당의 최대 수율을 보여 본 연구와 약간의 차이가 있으나 이는 기질의 특성과 전처리 과정의 차이에서 오는 결과로 생각된다.
- 대두 부산물인 okara를 Vicozyme L로 가수분해 하여 대두 올리고당을 제조한 결과(27), 10 unit의 효소 첨가가 올리고당의 최대 수율을 보여 본 연구와 약간의 차이가 있으나 이는 기질의 특성과 전처리 과정의 차이에서 오는 결과로 생각된다. 따라서 Viscozyme L에 의한 hemicellulose의 분획의 최대 효소량을 21 unit으로 결정하였다.
- Hemicellulase의 일종인 Shearzyme plus, Viscozyme L은 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0)에 녹인 0.1% xylan (Sigma, St. Louis, MO, USA) 용액 0.4 mL에 0.1% 효소액을 가해 shaking waterbath (BS-11, Jeio Tech, Seoul, Korea)에서 최적 활성을 나타내는 조건인 25℃에서 30분간 반응시킨 후, DNS법(20)으로 환원당량을 측정하였다. 이 때 표준물질은 xylose (Tokyo Chemical, Industry Co.
대상 데이터
- 배추부산물의 hemicellulose 분획의 효소 분해를 위해 xylanase의 활성을 가지는 Shearzyme plus (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark)와 arabanase, β-glucanase, hemicellulase, xylanase의 활성을 나타내는 Viscozyme L (Novozymes A/S)을 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 배추(Brassica campestris L. ssp. pekinensis)는 전남 해남에서 재배한 국내산 품종으로 외관과 크기가 균일한 것을 사용하였다. 구입한 배추는 세척 후 60℃의 dry oven (VS-1202D3, Vision Scientific Co.
- pekinensis)는 전남 해남에서 재배한 국내산 품종으로 외관과 크기가 균일한 것을 사용하였다. 구입한 배추는 세척 후 60℃의 dry oven (VS-1202D3, Vision Scientific Co., Seoul, Korea)에서 건조하고 Food Mixer (FM-681C, Hanil, Incheon, Korea)를 이용하여 마쇄한 후 45 mesh (No. 60, Chung Gye Indus. MFG. Co., Seoul, Korea)로 체질하였다. 이후 −40℃ deep freezer (MDF-415, Sanyo, Tokyo, Japan)에 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 즉, 최적 조건으로 효소 가수분해한 후 동결 건조한 hemicellulose 분획에 60℃로 가열한 80% ethanol을 분획의 20배에 해당하는 양을 가해 용해시켰다. Hemicellulose 분획 중 알코올에 용해된 부분을 제거하고 남은 분획을 알코올 불용성 식이섬유로 하였으며, 이를 동결하여 분자량 분포 측정을 위한 시료로 사용하였다.
데이터처리
- 각 실험군 평균치간의 유의적 차이는 Duncan’s multiple range test로 검증하였다.
- 실험결과는 3회 반복으로 수행한 평균값과 표준편차를 나타냈고, 각 실험결과에 대한 통계분석은 SPSS (Ver. 19, Chicago, IL, USA) 통계 프로그램을 이용하여 일원배치 분산분석을 시행하였 다. 각 실험군 평균치간의 유의적 차이는 Duncan’s multiple range test로 검증하였다.
이론/모형
- Hemicellulose는 식물 세포벽에서 cellulose를 제외한 다당류를 총칭하며 알칼리에 의해 용해되는 특성을 가진다. 따라서 배추로부터 hemicellulose를 분리하기 위해 Xu 등(19)의 방법에 따라 알칼리를 이용하여 추출하였다. 즉, 배추 30 g당 1M의 NaOH 300 mL를 가하여 homogenizer (AM-1, Nihonseiki Kaisha LDD, Nissei, Japan)로 180 rpm으로 3분간 균질화한 다음, 100 mL의 1M NaOH를 첨가하여 25℃, shaking incubator (KMC-8480SF, Vision Scientific Co.
- 효소분해에 의해 생산된 수용성 식이섬유 중 분자량이 다소 큰 수용성 식이섬유를 얻고자 Chau과 Haung(21)의 방법에 따라 알코올에 대한 용해도 차이를 이용하여 알코올 불용성 식이섬유를 분리하였다. 즉, 최적 조건으로 효소 가수분해한 후 동결 건조한 hemicellulose 분획에 60℃로 가열한 80% ethanol을 분획의 20배에 해당하는 양을 가해 용해시켰다.
- 알코올 불용성 식이섬유의 분자량 분포를 측정하기 위해 Yoon 등(14)의 방법에 준하여 gel permeation chromatography를 이용해 분자량의 분포를 측정하였다. 즉, 동결 건조한 50 mg의 알코올 불용성 식이섬유를 10 mL 증류수에 용해한 후, Sephacryl S-200 column (2.
- 5 mL/min의 유속으로 평형화된 column에 loading 하여 전개시켰다. 용출액은 분획 collector (Foxy Jr, Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA)를 이용해 4 mL씩 분취한 후 각 분획으로부터 당 함량을 phenol-sulfuric acid법(22)에 의해 측정하였으며, 그 수치를 chromatogram으로 나타내었다. 즉, 분획 1 mL에 5% phenol 용액 1 mL를 가해 vortex한 후 진한 황산 5 mL를 넣어 실온에 20분 동안 방치한 다음 480 nm에서 흡광도를 측정하여 총당 함량에 대한 chromatogram을 작성하였다.
성능/효과
- Louis, MO, USA)을 사용하여 비교하였다. 먼저 위의 조건에 따라 표준품을 gel chromatography한 결과, 분자량 12,000 Da dextran 은 fraction number 82-92 사이에서 peak가 확인되었으며, 분자랑 25,000 Da dextran은 fraction number 60-68 사이에서 peak가 확인되었다. 또 분자량 50,000 Da dextran은 fraction number 30-41, 분자량 80,000 Da은 fraction number 15-23 사이에서 peak가 확인되었다.
- 0까지 조절하여 효소 분해하였고, 분해물의 환원당량을 측정한 결과는 Table 1과 같다. 분해물의 환원당 함량은 반응 72시간까지 유의적으로 증가하였으며, 대체적으로 72시간에서 효소 분해에 의한 생성된 환원당량이 가장 높았다. 0시간과 24시간에서의 반응액은 pH 3.
- 분해물의 환원당 함량은 반응 72시간까지 유의적으로 증가하였으며, 대체적으로 72시간에서 효소 분해에 의한 생성된 환원당량이 가장 높았다. 0시간과 24시간에서의 반응액은 pH 3.0, 4.0, 5.0에 서 다른 pH에 비해 유의적으로 높은 분해율을 나타내었다. 48시간에서는 pH 4.
- 0에서 온도에 의한 효소 분해율은 Table 2와 같다. 30℃에서 60℃까지 10℃ 간격으로 시간별 분해율을 측정한 결과 72시간까지 유의적으로 증가하였고, 모든 시간대에서 40℃가 가장 높은 환원당함량을 나타내었다. 특히 40℃에서 48시간은 17.
- 30℃에서 60℃까지 10℃ 간격으로 시간별 분해율을 측정한 결과 72시간까지 유의적으로 증가하였고, 모든 시간대에서 40℃가 가장 높은 환원당함량을 나타내었다. 특히 40℃에서 48시간은 17.09 mg/L, 72시간은 17.22 mg/L로 다른 온도에 비해 비교적 높은 환원당 함량을 나타내어 효소분해 최적 반응의 조건임을 확인하였다. 밀겨와 껍질로부터 효소 분해에 의한 arabinoxylan을 생산한 Escarnot 등(24)의 연구에 따르면 Shearzyme plus의 활성은 40℃에서 최적이며, 24시간 분해 시 xylose와 glucose의 함량이 각각 48.
- 0, 40℃에서 효소량에 따른 분해율을 측정한 결과는 Table 3과 같다. 시간별 분해된 반응물의 환원당 함량은 72시간까지 시간이 지날수록 증가하였다. 특히, 45 unit에서의 환원당량은 0시간에서 12.
- 0까지 조절해 효소 분해하여 환원당량을 측정한 결과는 Table 4와 같다. 분해물의 환원당 함량은 0 시간부터 72시간까지 유의적으로 증가하였으며, 72시간의 경우 생성된 환원당량이 가장 높았다. 72시간 분해 후 pH 4.
- 분해물의 환원당 함량은 0 시간부터 72시간까지 유의적으로 증가하였으며, 72시간의 경우 생성된 환원당량이 가장 높았다. 72시간 분해 후 pH 4.0과 5.0이 각각 16.52, 16.67 mg/L로 다른 pH에 비해 유의적으로 높은 수치를 나타내었다. Winkler 등(25)은 자트로파(Jatropha curcas) 종자유를 추출하기위해 효소 처리한 결과, 물 추출에 비해 48% 높은 수율을 나타내었으며, pH 4.
- 0로 선정된 최적 조건에서 온도에 의한 효소 분해율은 Table 5와 같다. 시간별 효소 분해된 환원당량을 측정한 결과 72시간까지 유의적으로 증가하였고, 72시간에서 가장 높은 분해율을 나타내었다. 특히 40℃에서 모든 시간대의 환원당량이 유의적으로 높게 나타났다.
- 0, 40℃에서 효소농도에 따라 분해된 당 함량은 Table 6에 나타내었다. 분해물의 환원당 함량은 72시간까지 시간이 지남에 따라 증가하였고, 72시간에는 28 unit에서 17.55 mg/ L로 7과 14 unit에 비해 유의적으로 높은 분해율을 보였으나, 환원당량이 17.43 mg/L인 효소량 21 unit와는 유의적인 차이를 보이지 않았다. 따라서 효소의 효율성에 따른 식이섬유의 생산량을 감안하여 효소 농도를 21 unit으로 설정하였다.
- 3%가 증가하였다. 알코올 불용성 식이섬유의 수율은 가수분해 전 0.37%로 매우 낮았으나 24시간 가수분해 후 2.14%로 증가하였으며, 72시간 가수분해 후에는 4.10%로 크게 증가하였다.
- Viscozyme L에 의한 수용성 식이섬유의 수율도 Shearzyme plus에 의한 가수분해와 비슷한 경향으로 효소처리에 의해 크게 증가하였다. 특히, 가수분해 24시간 후 15.18%로 Shearzyme plus 처리에 비해 약 3% 높은 수율을 보였다. 72시간 가수분해 후에는 24.
- 이상의 결과에서 가수분해 시간이 증가할수록 수용성 식이섬유의 수율을 증가하였으며, Viscozyme L 처리 시 Shearzyme plus 처리에 비해 높은 수율을 보였다. 이러한 결과는 Shearzyme plus 및 Viscozyme L의 cellulase, arabanase, β-glucanase, hemicellulase, xylanase의 다양한 작용으로 인해(23) 불용성의 hemicellulose가 저분자화 되어 수용성의 식이섬유로 전환됨을 확인할 수 있었다.
- 1과 같다. 효소 분해되지 않은 식이섬유의 분자량은 25,000-50,000 Da에서 가장 큰 peak를 나타냈으며, 분자량 80,000 Da에서 다음으로 큰 peak를 나타냈다. 분자량 12,000-25,000 Da에서도 작은 peak가 확인되었다.
- 분자량 12,000-25,000 Da에서도 작은 peak가 확인되었다. 효소 처리 후 24시간 이 지났을 때는 분자량 25,000-50,000 Da에서 가장 크고 넓은 peak 가 나타났고, 50,000-80,000 Da에서 작은 peak가 나타내어 효소 분해가 진행되고 있음을 확인하였다. 48시간에서는 분자량 50,000- 80,000 Da 사이에 peak 하나와 25,000-50,000 Da에서 peak가 확인되어 24시간 분해 후 chromatogram과 유사하였으며, peak가 낮고 주위에 여러 개의 작은 peak가 나타났다.
- 효소 처리가 되지 않은 0시간에서의 식이섬유의 분자량은 50,000 Da 부근에서 가장 큰 peak를 나타냈으며, 분자량 80,000 Da에서 다음으로 큰 peak를 나타냈다. 효소 분해 후 24시간이 지났을 때도 분자량 50,000 Da 부근의 25,000-50,000 Da에서 가장 큰 peak가 나타났고, 50,000- 80,000 Da에서 다음으로 큰 peak가 나타났다. 48시간에서는 24시간과 큰 차이가 없었으나 분자량 12,000 Da 이하에서 peak가 확인되어 저분자량의 당이 생성되고 있음을 확인하였다.
- 효소 분해 후 24시간이 지났을 때도 분자량 50,000 Da 부근의 25,000-50,000 Da에서 가장 큰 peak가 나타났고, 50,000- 80,000 Da에서 다음으로 큰 peak가 나타났다. 48시간에서는 24시간과 큰 차이가 없었으나 분자량 12,000 Da 이하에서 peak가 확인되어 저분자량의 당이 생성되고 있음을 확인하였다. 72시간에 는 분자량 12,000-80,000 Da의 전범위에서 여러 개의 작은 peak를 확인하였고, 12,000 Da 이하의 분자량에서 확인된 peak가 증가함을 확인하여 효소의 분해로 인한 당의 저분자화가 활발히 진행됨을 알 수 있었다.
- 48시간에서는 24시간과 큰 차이가 없었으나 분자량 12,000 Da 이하에서 peak가 확인되어 저분자량의 당이 생성되고 있음을 확인하였다. 72시간에 는 분자량 12,000-80,000 Da의 전범위에서 여러 개의 작은 peak를 확인하였고, 12,000 Da 이하의 분자량에서 확인된 peak가 증가함을 확인하여 효소의 분해로 인한 당의 저분자화가 활발히 진행됨을 알 수 있었다. 식용달팽이 유래 조효소의 분해반응을 통해 당근으로부터 얻은 수용성 식이섬유소를 sephacryl S-200 column에 주입하여 분획한 결과에 따르면(14), 효소 처리 1일째부터 10,000 Da 부근에서 peak를 나타났으며 반응 4일째에는 10,000 Da 이하의 peak가 크게 나타나 본 연구와 유사함을 확인하였다.
- 본 연구에서는 농산부산물인 배추 겉잎의 이용성을 증진시키기 위하여 배추의 불용성 식이섬유인 hemicellulose를 분획한 후 효소 처리하여 수용성 식이섬유를 함유한 가수분해물을 생산하고자 하였다. 이를 위해 다양한 pH, 온도, 기질농도 및 효소농도에서 hemicellulose 분획을 효소 처리한 후 환원당 함량을 측정한 결과, pH 5.0, 40℃, 효소농도 45 unit (Shearzyme plus), 21 unit (Viscozyme L)의 조건으로 가수분해 했을 때 가장 높은 분해율을 나타내었다. 선정된 조건으로 72시간 가수분해하여 수율을 측정한 결과, Shearzyme plus 및 Viscozyme L 처리 시 각각 22.
- 0, 40℃, 효소농도 45 unit (Shearzyme plus), 21 unit (Viscozyme L)의 조건으로 가수분해 했을 때 가장 높은 분해율을 나타내었다. 선정된 조건으로 72시간 가수분해하여 수율을 측정한 결과, Shearzyme plus 및 Viscozyme L 처리 시 각각 22.64%와 24.73%의 수율을 보였다. 또한 알코올 불용성 식이섬유의 겔 크로마토그래피에 의한 분자량 분포를 확인한 결과, Shearzyme plus 및 Viscozyme L에 의해 생성된 식이섬유는 반응 시간이 증가함에 따라 저분자화 되는 것을 확인 할 수 있었다.
- 73%의 수율을 보였다. 또한 알코올 불용성 식이섬유의 겔 크로마토그래피에 의한 분자량 분포를 확인한 결과, Shearzyme plus 및 Viscozyme L에 의해 생성된 식이섬유는 반응 시간이 증가함에 따라 저분자화 되는 것을 확인 할 수 있었다. 이상의 결과에서 배추 부산물 hemicellulose 분획을 효소로 가수분해함으로 써 불용성 식이섬유가 저분자화 되어 수용성 식이섬유로 전환됨을 확인하였으며, 생산된 식이섬유소 함유 가수분해물은 기능성 식품 및 식품가공 분야에 다양하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.
후속연구
- 또한 알코올 불용성 식이섬유의 겔 크로마토그래피에 의한 분자량 분포를 확인한 결과, Shearzyme plus 및 Viscozyme L에 의해 생성된 식이섬유는 반응 시간이 증가함에 따라 저분자화 되는 것을 확인 할 수 있었다. 이상의 결과에서 배추 부산물 hemicellulose 분획을 효소로 가수분해함으로 써 불용성 식이섬유가 저분자화 되어 수용성 식이섬유로 전환됨을 확인하였으며, 생산된 식이섬유소 함유 가수분해물은 기능성 식품 및 식품가공 분야에 다양하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.
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