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문제 정의
- 본 연구는 상업적으로 시판되는 발효유제품과 LGG를 함유한 호상농후발효유의 저장 중 유산균의 생존성을 조사하여 probiotics로서의 이용성을 증진시키는 기초적 자료를 제공하고자 실시하였다.
제안 방법
- 5인 MRS 배지에 배양한다. 37℃에서 1 h, 12 h, 24 h 그리고 48 h 동안 배양한 후, cell pellet을 5,000 g에서 10분간 원심분리 하여 준비하였다. 이 pellet은 glycerol이 포함된 stock 상태로 －70℃에 저장하였다.
- Bifidobacteria 생균수 측정은 NPNL-BL medium을 사용하여 pour plating 법으로 도말하고, 혐기상태에서 37℃, 48시간 동안 배양한 다음 콜로니 수를 계수하고, S. thermophilus 생균수 측정은 M17 medium을 사용하여 pour plating 법으로 도말하고, 혐기상태에서 43℃, 24시간 동안 배양한 다음 콜로니 수를 계수하였다. 진행 과정 중 LGG 유산균과의 생균수 변화를 측정하였다.
- Fiske-Subbarow 방법을 이용하여 ATPase 활성을 측정하며, 조효소 용액 100 μL에 10 mM MgCl2 와 5 mM ATP(sigma)를 함유한 Tris maleate buffer(pH 7.5, 50 mM) 900 μL를 가하고, 37℃에서 10분 동안 효소반응 시킨 후, 3 mL 증류수와 1 mL의 3.5N 황산 용액을 가하여 효소 반응을 종결시켰다.
- L. rhamnosus GG의 Total RNA는 MRS broth에서 OD600 0.6에 도달할 때까지 배양하고, pH 7.0 조건이 control이며, pH 4.5 조건에서 1시간, 12시간, 24시간, 48시간 배양한 샘플을 RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 cell로부터 추출하고, genomic DNA를 제거하기 위해 RNase-free-DNaseⅠ(Qiagen, Valencia, CA)를 사용했다. 역전사를 하는 동안, total RNA 1,000 ng이 qRT-PCR kit(Intron, Seongnam, Korea)의 RT premix oligo(dt)를 반응 mixture에 첨가하였다.
- Primer는 qRT-PCR 분석을 위해 L. rhamnosus GG에 기반을 둔 Primer3plus software(http://www.bioinformatics.nl/cgibbin/primer3plus/primer3plus.cgi)를 사용하여 설계하였다. 이 primer는 작은 amplicon size(200~300 bp)를 포함하고 있으며, 45~55% 사이 범주의 GC 함량을 가지고, 60에서 64℃까지의 Tm 값을 측정하였다.
- rhamnosus GG의 유전자 발현은 relative expression software tool로 분석하였다. pH 4.5에서 clpC/E/L, atpA/D, dnaK--dnaJ-grpE, and groES-groEL의 산성 유도성 특성은 qRT-PCR을 이용하여 입증하였다(Fig. 8, 9). pH 4.
- qRT-PCR은 1μL cDNA 주형, 각 primer, SYBR Green을 사용하여 수행 했고, 처음 denaturation은 95℃에서 5분간 실행한 후, 95℃에서 10초(denaturation), 54℃에서 15초(annealing), 72℃에서 15초(extension)를 1 cycle로, CFX96TX(Bio-Rad, California, USA)를 사용하여 35 cycle을 반복 하였다.
- qRT-PCR은 1μL cDNA 주형, 각 primer, SYBR Green을 사용하여 수행 했고, 처음 denaturation은 95℃에서 5분간 실행한 후, 95℃에서 10초(denaturation), 54℃에서 15초(annealing), 72℃에서 15초(extension)를 1 cycle로, CFX96TX(Bio-Rad, California, USA)를 사용하여 35 cycle을 반복 하였다. 각 PCR cycle마다 melting curves는 비특이적 증폭을 피하기 위해 모니터링 했다. 증폭 효율의 연구는 primers가 CT 값을 기준으로 비교 분석하기에 적합한 것으로 나타났다.
- 제품은 4℃에서 저장하며, 15 일 간격으로 6개월 이상 생균수 측정을 진행했다. 균주의 보존을 위해 모든 균주를 MRS 배지에 3회 계대 배양한 후, 원심 분리한 다음 cell pellet에 skim milk 10%, glucose 3%, yeast extract 0.3%의 배지를 제조하여 혼합한 후－80℃의 냉동고에 보관하면서 사용하였다
- 5 MRS 배지에서 배양하여 준비하였다. 그 샘플을 at 0 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h, 48 h 간격으로 두고, 단계적으로 희석한 후 MRS agar 배지에 도말하였다. 배양된 plate를 48 h 동안 37℃ 에서 배양하고, 콜로니 수를 계수하였다.
- 샘플은 지역 마트에서 구입할 수 있는 3가지 브랜드의 요거트를 준비했다(Table 1). 샘플은 냉장 온도(5℃)에 저장 하며, 52주 동안 15일 간격으로 생균수 계수와 pH 변화를 측정하였다.
- 7% Developer(Kodak, D-76)를 혼합한 용액 1 mL를 첨가했다. 실온에서 20분간 반응시킨 후 spectrophotometer를 이용하여 660 nm에서 흡광도를 측정하고, ATPase에 의해 ATP로부터 유리된 inorganic phosphate의 양을 standard curve로부터 환산하였다.
- 제품 내 LGG 생균수 측정에 배지는 vancomycin을 첨가한 BL(glucose-blood-liver) medium을 사용하여 pour plating 법으로 도말하고, 혐기상태에서 37℃, 48시간 동안 배양한 다음 콜로니 수를 계수하였다. 제품은 4℃에서 저장하며, 15 일 간격으로 6개월 이상 생균수 측정을 진행했다.
- 이 primer는 작은 amplicon size(200~300 bp)를 포함하고 있으며, 45~55% 사이 범주의 GC 함량을 가지고, 60에서 64℃까지의 Tm 값을 측정하였다. 증폭된 결과물을 1% agrose gel에서 확인하고, 뒤이어 primer 이량체 형성 가능성을 배제하기 위한 PCR-amplified products의 melt 곡선 분석을 확인했다(Table 2).
- thermophilus 생균수 측정은 M17 medium을 사용하여 pour plating 법으로 도말하고, 혐기상태에서 43℃, 24시간 동안 배양한 다음 콜로니 수를 계수하였다. 진행 과정 중 LGG 유산균과의 생균수 변화를 측정하였다.
대상 데이터
- 샘플은 지역 마트에서 구입할 수 있는 3가지 브랜드의 요거트를 준비했다(Table 1). 샘플은 냉장 온도(5℃)에 저장 하며, 52주 동안 15일 간격으로 생균수 계수와 pH 변화를 측정하였다.
데이터처리
- Duncan’s multiple range test를 이용하여 시료간의 유의적 차이(p<0.05)를 검정하였다.
이론/모형
- Value method는 다른 샘플로부터 유전자 발현을 비교하기 위해 사용했다(Livak and Schmittgen, 2001; Meng et al., 2007). Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)는 PCR 증폭에서 internal control로 사용했다.
- pH에 따른 각 시간대 별 L. rhamnosus GG의 유전자 발현은 relative expression software tool로 분석하였다. pH 4.
성능/효과
- 5에 나타난 바와 같다. L. rhamnosus GG가 가장 높은 생존율을 나타냈고, 특히 12시간 이상 산성 조건에 노출되었을 때, 다른 Lactobacillus strains보다 높은 생존율을 보였다. 이 결과는 L.
- Lactobacillus strain의 세포막 ATPase 활성은 Fig. 6에 나타난 바와 같으며, 다른 유산균들에 비해 L. rhamnosus GG 의 ATPase 활성이 가장 높게 나타났다.
- 8, 9). pH 4.5에서 clpC/E/L, atpA/D, dnaK--dnaJ-grpE, and groES-groEL의 유전자가 높게 발현되는 것을 확인하였다. clpC와 clpE gene은 pH 4.
- qRT-PCR 결과로 볼 때, clpC, clpE, atpA, dnaK 유전자 발현이 증가하였는데, 이는 낮은 pH 환경에서 L. rhamnosus GG의 생존율을 향상시키는데 도움을 주며, L. rhamnosus GG가 다른 유산균 보다 산성 조건에서 잘 적응하도록 기여하는 것으로 생각된다.
- 5에 노출되는 동안 증가함을 보였는데, 이는 세포막에 연결된 F0F1 ATPase가 산성 조건에 대한 내성에 중요한 역할을 하는 것으로 추정된다. 궁극적으로 L. rhamnosus GG는 산성 환경에 노출되었을 때, 내산성이 증가되는 것으로 보아, 발효유와 같은 비교적 낮은 pH에서 적응이 된 유산균은 다른 조건에서 적응된 경우보다 내산성이 높을 것으로 판단 된다.
- , 2010). 또한 장내의 산도를 낮추어 장 점막을 손상시킬 수 있는 세균의 증식을 억제하고, 손상된 장 점막의 재생을 촉진시키며, 또한 독성이 있는 세균에 대한 항체의 생성을 유도하거나, 장 점막을 보호하는 점액 생성을 조절하는 등의 여러 작용을 통하여 장염을 치료하거나 예방할 수 있다.
- 유산균에 있어서 stress 조건이나 정상 조건에서 단백질의 항상성을 유지하는 것이 매우 중요하다. 본 연구결과, dnaK 유전자는 pH 4.5에서 과 발현되었고, L. rhamnosus GG는 산 조건일 때 보호 기능을 지니는 것으로 나타났다.
- , 2007). 본 연구에서는 산 조건의 반응초기에 CLPC/E 유전자의 발현이 증가했다. CLP 유전자는 배양초기에 발현되며 산 스트레스 하에서 세포 생존성을 유지하기 위해 기여하는 것으로 추정된다.
- rhamnosus GG가 가장 높은 생존율을 나타냈고, 특히 12시간 이상 산성 조건에 노출되었을 때, 다른 Lactobacillus strains보다 높은 생존율을 보였다. 이 결과는 L. rhamnosus GG가 in vitro 산성 조건에서 가장 높은 내산성을 가진다는 것을 의미한다.
- rhamnosus GG에서는 atpA 유전자 발현이 산성 조건에 노출된 시간이 증가된 후에 F1F0 ATPase의 알파 subunit이 높은 수준을 나타내었다. 이 결과는 산성 조건에서 F1F0 ATPase 활성이 증가했고, 이것이 장시간 동안 산성 환경에서 다른 유산균과 비교해서 높은 생존율을 가지게 하는 것으로 생각된다.
- 반면에 Lactobacillus rhamnosus GG는 저장 기간 동안 제품에서 가장 높은 생존성을 나타냈다. 저장 52주 후에도 107 CFU/mL를 유지하며, 매우 높은 생존성을 보이는 것으로 확인되었다.
- 각 PCR cycle마다 melting curves는 비특이적 증폭을 피하기 위해 모니터링 했다. 증폭 효율의 연구는 primers가 CT 값을 기준으로 비교 분석하기에 적합한 것으로 나타났다.
후속연구
- LGG 균을 포함한 다양한 유산균들은 발효유와 음료에 주로 사용되고 있고, 이들의 건강 기능성 관련 연구는 점점 늘어가는 추세이며, 이를 토대로 유산균의 건강 기능성 식품에서의 활용 범위를 넓힐 수 있는 계기가 될 것이다.
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