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문제 정의
- 현재, 쪽 전초에 대한 항산화 활성16) 및 쪽 뿌리의 항염증 활성18) 등의 연구는 진행되어있지만 각 부위별 비교 분석은 미비하다. 따라서 본 연구에서는 우리나라에서 전통적인 염료 및 한약재로 사용되어지고 있는 쪽의 부위별 항산화 활성 및 항염증 활성을 비교 분석함으로써 향후 고부가가치의 기능성 식품소재 및 향장소재로서의 개발 가능성을 입증하고자 한다.
- 본 연구에서 쪽의 에틸아세테이트 분획물의 부위별 항산화 효과, 산화적 DNA 손상억제 활성 그리고 항염증 효과를 연구하였다. 항산화 효과를 확인하기 위하여 DPPH, ABTS radical 소거활성, Fe2+ 킬레이팅 활성 및 환원력을 평가하였다.
- 본 연구에서는 φ X-174 RF I plasmid DNA를 이용하여산화적 스트레스에 의한 DNA 손상 그리고 이러한 손상에 대한 억제 활성을 확인하였다. 정상적인 plasmid DNA는 supercoiled (SC) 형태로 존재하나 H2O2와 철의 fenton 반응에 의해 생성된 하이드록실 라디칼 또는 철 이온 존재 하에서는 산화적스트레스에 의한 손상을 받아 open-circular(OC)형태로 전환된다.
- 7 세포에 내독소로 LPS를 사용하여 염증을 유발시켜 항염증 효과를 확인하였는데, LPS는 macrophage 및 monocyte와 같은 그람 음성균에서 IL-6, TNF-α, IL-1β 와 같은 pro-inflammatory cytokine을 증가시키는 것으로 알려져 있다41). 이를 통해 염증 유발의 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는 NO의 억제효과를 확인 하였다. NO는 세포독성, 면역기능, 신경전달 및 혈관이완 등의 다양한 생물학적 과정에 영향을 미쳐 세포 기능 유지에 중요한 작용을 하는 것으로 알려져 있으며, 생체 내에서 NO synthase(NOS)에의해 L-arginine으로부터 생성되는 활성산소의 일종이다.
제안 방법
- 7 세포는 한국 세포주 은행에서 분양 받아 사용하였으며, 10 % fetal bovine serum (FBS)과 1 % antibiotics (penicillin/streptomycin) 를 첨가한 Dulbecco's modified Eagle'smedium (DMEM) 배지를 이용하여 5 % CO2, 37 ℃ incubator에서 배양하였다. RAW 264.7 세포를 48 well plate에 2×105 cells/well 이 되도록 분주한 후 12 h 배양하고, 각출물 150 µg/mL의 농도가 되도록 500㎕/well를 동시 처리 또는 LPS 단독 처리하여 20 h 배양한 후, 세포 배양액을 얻어 배양액 중에 함유된 NO의 양을 Griess Reagent System (Promega, Madison, WI, USA)을 이용하여 측정하였다.
- 70이 되게 희석하였다. 각 농도별 추출물 40 ㎕에 ABTS solution을 760 ㎕씩 각각 첨가한 후 20분간 37℃에서 반응시킨 후 UV/Visible spectrophotometer(Human Cop, Xma- 3000PC)을 이용하여 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료처리에 의한 소거활성률은 DMSO 처리 대조구와 비교하여 계산하였고, 추출물의 소거활성은 다음 식으로 %를 구하였다.
- 00이 되도록 Ethanol을 이용하여 희석 준비하였다. 각 농도별 추출물 40 ㎕에 DPPH solution 760 ㎕를 첨가한 후 20분 간 37℃에서 반응시켜 UV/Visible spectrophotometer(Human Cop, Xma-3000PC)을 이용하여 515nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료처리에 의한 소거활성률은 DMSO 처리 대조구와 비교하여 계산하였고, 추출물의 소거활성은 다음 식으로 %를 구하였다.
- 5 ㎖ 넣고 40분간 실온에서 반응시켰다. 반응물을 흔들지 않고 맑은 액체를 UV/Visible spectrophotometer(Human Cop, Xma- 3000PC)을 이용하여 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. Standard는 Tannic acid으로 정량 직선방정식을 사용하였다.
- 각 농도별 추출물 40 ㎕에 DPPH solution 760 ㎕를 첨가한 후 20분 간 37℃에서 반응시켜 UV/Visible spectrophotometer(Human Cop, Xma-3000PC)을 이용하여 515nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료처리에 의한 소거활성률은 DMSO 처리 대조구와 비교하여 계산하였고, 추출물의 소거활성은 다음 식으로 %를 구하였다.
- 후 3일간 침지하였다. 여과 농축한 추출물을 200 ㎖로 농축한 다음 50 ㎖ 증류수를 첨가하고, 이를 petroleum ether로 분획하여 분리하고 이를 다시 ethyl acetate로 분획한 다음, 유기 용매 층을 sodium sulfate anhydrous로 탈수시킨 다음 농축·건조 하였다. 각 부위별 에틸아세테이트 분획물은 잎 0.
- 쪽 부위별 추출물은 FeCl2(ferric chloride)의 산화적 스트레스와 FeSO4 (ferrous sulfate)와 H2O2의 fenton 반응을 이용한 산화적 스트레스를 이용하여 DNA 손상 억제 활성을 평가하였으며, φX-174 RF I plasmid DNA cleavage assay 를 이용한 비 세포적 시스템으로 평가하였다.
- 3 ㎖에 혼합하여 실온에서 40분 방치한 뒤 415 nm에서 흡광도를 측정하여 구하였다. 총 플라보노이드 함량은 quercetin을 표준물질로 이용하여 검량선을 작성한 다음 총 플라보노이드 함량을 구하였다.
- 항산화 효과를 확인하기 위하여 DPPH, ABTS radical 소거활성, Fe2+ 킬레이팅 활성 및 환원력을 평가하였다.
대상 데이터
- 본 연구에 사용된 쪽(Persicaria tinctoria)은 2011년 8월 경북 안동시 성곡동에서 재배한 것을 채취하여 사용하였다. 쪽의 전초를 채취하여 세절 한 다음, 잎, 줄기, 뿌리로 분리하였다.
- 실험에 사용된 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 한국 세포주 은행에서 분양 받아 사용하였으며, 10 % fetal bovine serum (FBS)과 1 % antibiotics (penicillin/streptomycin) 를 첨가한 Dulbecco's modified Eagle'smedium (DMEM) 배지를 이용하여 5 % CO2, 37 ℃ incubator에서 배양하였다. RAW 264.
데이터처리
- 모든 실험 결과는 3번 이상 수행하였으며, 통계분석은 각 실험의 평균과 표준편차를 계산하였고, P<0.05 수준에서 Duncan 다중검정법 (duncan's multiple range test)를 이용하여 각 실험의 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- ABTS 라디칼 소거 활성 능력은 Van den Berg 등의 방법 20)을 참고하여 측정하였다. ABTS solution은 7 mM 3- ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid(2, 2'azino-bis)와 2.
- DPPH를 이용한 전자 공여능은 Bondet 방법19)을 참고하여 측정하였다. DPPH solution은 300 µM 1, 1-diphenyl-2- picryl hydrazyl(DPPH)를 515 nm에서 흡광도 값이 1.
- Fe2+ 킬레이팅 활성은 Hus 방법21)을 참고하여 실험하였다. 솔방울의 농도별 추출물 40 ㎕에 1mM FeCl2 40 ㎕와 증류수 700 ㎕를 혼합하여 약 30초간 실온에서 반응하였다.
- 50 ㎖, Folin 200 ㎕를 넣고 혼합한 후 10분간 상온에서 반등시킨 후, UV/Visible spectrophotometer (Human Cop, Xma-3000PC)을 이용하여 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. Standard는 Ascorbic acid로 정량 직선 방정식을 사용하였다.
- 반응물을 흔들지 않고 맑은 액체를 UV/Visible spectrophotometer(Human Cop, Xma- 3000PC)을 이용하여 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. Standard는 Tannic acid으로 정량 직선방정식을 사용하였다.
- φX-174 RF I plasmid DNA 산화적 스트레스 손상 억제 활성은 Jung 방법25)을 참고하여 측정하였다.
- 비타민C 함량은 Jagot and Dani24)의 방법을 참고하여 측정하였다. 건조시료 0.
- 총 페놀 함량은 Folin-Denis 방법23)을 참고하여 측정하였다. 건조시료 1 g에 1% Acetic acid/diethyl ether 100 ㎖를 혼합하여 5분간 추출 후 상등액을 제거하였다.
- 총 플라보노이드 함량은 Nieva Moreno 등의 방법에 의해 측정하였다. 각 시료 100 ㎕를 80% EtOH 990 ㎕에 희석한 후 100 ㎕를 취하여 10% aluminum nitrate와 1 µM potassium acetate를 함유하는 80% EtOH 4.
- 환원력은 Oyaizu의 방법22)을 참고하여 측정하였다. 각 농도별 추출액 100 ㎕에 0.
성능/효과
- 1. 대조군으로 사용된 L-ascorbic acid와 유의성 없는 효과를 보였으며, RAW264.7 세포주에서의 NO의 억제 효과 및 높은 DPPH, ABTS 소거활성 및 Fe2+ 킬 레이팅과 환원력을 보였다.
- 2. 각 부위별 항산화 효과는 줄기>잎>뿌리 순으로 농도 의존적인 높은 효과를 보였고 잎과 뿌리의 차이는 유의성 있지 않았다.
- 3. 각 부위별 항염증 효과는 줄기>잎>뿌리 순으로 농도 의존적인 효과를 보였으며 특히 줄기는 높은 NO 생성저해 효과를 보였다.
- 4. 각 부위별 페놀성 화합물은 줄기>잎>뿌리 순으로 높은 함량을 함유하고 있었으며 이 결과는 위의 항산화 및 항염증 효과와 유사한 패턴을 보인다.
- LPS처리에 의해 염증 유발을 유도한 RAW 264.7 세포에 쪽 부위별 추출물의 농도 200 ㎍/㎖ 일 때 항염증 효과를 확인한 결과(Fig. 2), 모든 추출물의 Positive 대조구에 비해 NO의 생성이 현저하게 줄어들었다. 쪽 부위별 추출물의 항염증 효과는 줄기>잎>뿌리 순으로 높았다.
- 여과 농축한 추출물을 200 ㎖로 농축한 다음 50 ㎖ 증류수를 첨가하고, 이를 petroleum ether로 분획하여 분리하고 이를 다시 ethyl acetate로 분획한 다음, 유기 용매 층을 sodium sulfate anhydrous로 탈수시킨 다음 농축·건조 하였다. 각 부위별 에틸아세테이트 분획물은 잎 0.83%, 줄기 0.24%, 뿌리 0.17%를 각각 얻었다. 이 분획물을 항산화 및 항염증 활성을 측정하기 위한 시료로 사용하였다.
- 잎과 뿌리의 처리 농도에 따른 활성은 매우 유사하게 나타났다. 각 처리 농도별 DPPH radical 소거 활성을 근거로 각 부위별 추출물의 IC50(Inhibitor concentration 50%)값을 구한 결과(Table 1), 줄기는 7.19 ㎍/㎖로 L- ascorbic acid(5.50 ㎍/㎖)와 비교하여 매우 높은 활성을 나타내었다. 그러나 잎과 뿌리는 각각 144.
- 43% 순으로 높았다. 각 추출물의 Fe2+ 킬 레이팅 활성에 대한 IC50 값은 줄기와 뿌리가 각각 7.06 ㎍/ ㎖와 7.20 ㎍/㎖로 매우 높은 활성을 나타내었다. 그러나 잎은 160.
- 77%)순으로 소거 활성이 높았다. 각 추출물의 IC50 값을 계산한 결과, 줄기 추출물이 3.43 ㎍/㎖ 로 대조구인 L-ascorbic acid (3.43 ㎍/㎖)에 비해 다소 높은 활성을 나타내었다. 뿌리와 잎의 IC50 값은 각각 3.
- 결론적으로 쪽의 부위별 에틸아세테이트 분획물의 항산화 및 항염증효과는 페놀성 화합물에 기초한 활성으로 우수한 활성으로 향후 기능성 식품이나 향장소재의 원료로서 활용 가능성이 충분한 것으로 보인다.
- 모든 쪽의 모든 부위별 추출물에서 DNA 손상 억제 효과를 보였으며, 잎과 줄기의 억제 효과가 더욱 뛰어났다. 따라서 쪽의 에틸아세테이트 분획물은 페놀성 화합물의 작용으로 활성산소종의 억제를 통해 항산화 활성 및 항염증 활성 그리고 DNA 손상 억제효과를 나타내는 것으로 보이며, 기존에 알려진 본초학에서 서술된 쪽의 효능인 습진이나 구창을 치료하고 염증 질병에 사용된다는 효능과도 연관성이 깊다고 볼 수 있다.
- 할 수 있다. 모든 부위의 활성이 L-ascorbic acid와 비슷한 활성을 나타냈으며, 특히 줄기는 다른 시료들에 비해 더 높은 효과를 보였으며, 8㎍/mL 농도에서 94.83%의 효과를 보여 낮은 농도에서도 높은 효과를 보였다.
- 정상적인 plasmid DNA는 supercoiled (SC) 형태로 존재하나 H2O2와 철의 fenton 반응에 의해 생성된 하이드록실 라디칼 또는 철 이온 존재 하에서는 산화적스트레스에 의한 손상을 받아 open-circular(OC)형태로 전환된다. 모든 쪽의 모든 부위별 추출물에서 DNA 손상 억제 효과를 보였으며, 잎과 줄기의 억제 효과가 더욱 뛰어났다. 따라서 쪽의 에틸아세테이트 분획물은 페놀성 화합물의 작용으로 활성산소종의 억제를 통해 항산화 활성 및 항염증 활성 그리고 DNA 손상 억제효과를 나타내는 것으로 보이며, 기존에 알려진 본초학에서 서술된 쪽의 효능인 습진이나 구창을 치료하고 염증 질병에 사용된다는 효능과도 연관성이 깊다고 볼 수 있다.
- 높았다. 모든 처리 농도에서 뿌리와 잎에 비해 줄기의 활성이 높은 것으로 나타났다. 특히 처리농도 200 ㎍/㎖ 일 때 줄기(94.
- 43 ㎍/㎖)에 비해 다소 높은 활성을 나타내었다. 뿌리와 잎의 IC50 값은 각각 3.81 ㎍/㎖, 5.61 ㎍/㎖로 쪽 부위별 추출물은 전반적으로 높은 ABTS radical 소거활성을 나타내었다.
- 종합적으로 항산화 효과는 대조군인 L-ascorbic acid와 비교하여 비슷한 활성을 보였으며 DPPH 및 ABTS 소거활성, Fe2+ 킬레이팅 그리고 환원력에서 줄기가 비교적 높은 효과를 보였다.
- 그러나 대조구인 L-ascorbic acid는 동일한 농도에서 DPPH와 ABTS radical 소거활성에 비해 다소 낮은 활성을 나타내었다. 줄기와 뿌리의 활성은 각 처리 농도별로 잎에 비해 높은 활성을 나타내었다. 처리 농도 200 ㎍/㎖ 일 때 각 추출물의 Fe2+ 킬레이팅 활성은 줄기가 96.
- 줄기와 뿌리의 활성이 높았으며, 줄기의 킬레이팅 능력이 아주 우수했다.
- 쪽 부위별 Fe2+ 킬레이팅 활성을 측정한 결과(Table 3), 각 부위별 추출물의 농도 의존적으로 소거활성이 높았다. 그러나 대조구인 L-ascorbic acid는 동일한 농도에서 DPPH와 ABTS radical 소거활성에 비해 다소 낮은 활성을 나타내었다.
- 쪽 부위별 추출물은 대조구와 비교해서 모든 부위 및 추출 방법에서 산화적 스트레스에 의한 DNA 손상을 효과적으로 억제하는 활성을 보였다(Fig. 6, 7).
- 쪽 부위별 추출물의 ABTS radical 소거활성을 측정한 결과(Table 2), 각 부위별 추출물의 농도 의존적으로 소거 활성이 높았다. 특히 40 ㎍/㎖ 이상의 고농도에서는 모든 추출물의 처리리가 90% 이상의 높은 활성을 나타내었다.
- 쪽 부위별 추출물의 DPPH radical 소거활성을 측정한 결과(Table 1), 각 부위별 추출물의 농도 의존적으로 소거 활성이 높았다. 모든 처리 농도에서 뿌리와 잎에 비해 줄기의 활성이 높은 것으로 나타났다.
- 쪽 부위별 추출물의 환원력을 측정한 결과(Fig. 1), 각 부위별 추출물은 대조구인 L-ascorbic acid와 비교하여 매우 높은 환원력을 나타내었다. 특히 뿌리는 L-ascorbic acid에 비해 높은 환원력을 나타내고 있으나, 쪽의 부위별 추출물 모두 대조구인 L-ascorbic acid와 유의성을 나타내지 않았다.
- 페놀화합물의 다양한 항산화력은 그 구조적인 특징과 관련성이 높은데, 이들은 금속 킬레이트제, 환원제, 활성산소의 소거제, 사슬전단 항산화제(chain breaking antioxidants)등으로서의 역할에 기인하는 것으로 알려져 있다. 쪽의 부위별 페놀류 화합물 함량을 비교 분석한 결과 줄기가 가장 높은 함량을 함유하고 있었으며 뿌리, 잎 순으로 함량이 높았다. 총 페놀성 화합물은 다양한 구조와 분자량을 가진 2차 대사산물로서 항산화 활성과 항암 및 향균 작용을 하는 생리활성물질로 알려져 있으며34), 보고 된 대부분의 천연 항산화제 등의 생리활성 물질은 식물 유래로서 주로 폴리페놀 화합물인 것으로 알려져 있다35).
- 쪽의 에틸아세테이트 분획물의 처리로 뿌리에서 가장 높은 NO 억제효과를 보였으며 뿌리>잎>줄기 순으로 나타났다. 이러한 결과는 염증을 유발하는 NO를 억제하여 잠재적인 염증 억제에 기여한다고 보인다.
- 줄기와 뿌리의 활성은 각 처리 농도별로 잎에 비해 높은 활성을 나타내었다. 처리 농도 200 ㎍/㎖ 일 때 각 추출물의 Fe2+ 킬레이팅 활성은 줄기가 96.27%로 가장 높았고, 뿌리가 91.14%, 잎이 64.43% 순으로 높았다. 각 추출물의 Fe2+ 킬 레이팅 활성에 대한 IC50 값은 줄기와 뿌리가 각각 7.
- 특히 40 ㎍/㎖ 이상의 고농도에서는 모든 추출물의 처리리가 90% 이상의 높은 활성을 나타내었다. 처리 농도 8 ㎍/㎖ 일 때 줄기 추출물의 소거 활성이 94.85%로 가장 높았고, 뿌리(86.67%), 잎(68.77%)순으로 소거 활성이 높았다. 각 추출물의 IC50 값을 계산한 결과, 줄기 추출물이 3.
- 줄기는 잎과 뿌리에 비해 높은 소거활성을 나타냈으며 대조구인 L-ascorbic acid와 비슷한 소거활성을 보였다. 특히 200㎍/mL 농도에서 94.03% 로 뛰어난 활성을 보였다.
후속연구
- 종합적으로 본 연구를 통해 쪽의 에틸아세테이트 분획물은 천연 유래 자원으로서의 기능성 식품 및 기능성 의류, 향장 소재로서의 산업적 잠재성이 높으며 고부가가치를 가진다고 생각된다.
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