[논문]Lactobacillus paracasei BK57 균주로 발효시킨 프레쉬 치즈의 항리스테리아 활성

임은서; 이은우

doi:10.7845/kjm.2015.5059

Lactobacillus paracasei BK57 균주로 발효시킨 프레쉬 치즈의 항리스테리아 활성
Antilisterial activity of fresh cheese fermented by Lactobacillus paracasei BK57 원문보기

Korean journal of microbiology = 미생물학회지, v.51 no.4, 2015년, pp.407 - 418

초록
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본 연구는 백김치로부터 분리된 Lactobacillus paracasei BK57의 항균물질 생산을 위한 최적의 배양 조건을 검색하고, BK57 유산균으로 프레쉬 치즈를 제조한 후 균주의 활성과 유산 및 박테리오신 생산량을 측정하여 Listeria monocytogenes KCTC 3569에 대한 항균 활성을 조사하였다. 최대의 균 증식과 항균 물질 생산량은 pH 6.0으로 조정한 MRS broth에서 $37^{\circ}C$, 24시간 동안 호기적인 조건으로 배양했을 때 나타났다. 하지만, 효모추출물(2.0%)을 첨가한 전유 내에서 생성된 항균물질의 양과 유산균의 증식률은 MRS broth에서 보다는 다소 낮았다. 우유 내에서 L. monocytogenes의 저해율은 BK57 균주의 생균과 배양 상등액에 의해 높게 나타났으나, 유산균이 생산한 박테리오신에 의한 저해율은 우유 보다는 BHI broth 내에서 더 높게 나타났다. BK57 균주로 발효시킨 프레쉬 치즈를 $4^{\circ}C$와 $15^{\circ}C$에서 6일간 저장하는 동안 유산균수, 유산 생성량 및 박테리오신 활성은 유의한 변화가 없었다. 제조 직 후 프레쉬 치즈에 인위적으로 접종한 L. monocytogenes ($10^5CFU/ml$)의 균수는 각각의 온도대에서 6일 이내에 최소 15% 이상 감소되는 효과가 나타났으므로 BK57 균주를 발효유제품 제조에 이용할 경우 리스테리아균을 제어할 수 있는 생물학적 보존제로서의 가치를 확인하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study is focused on establishing the optimal conditions to enhance the production of antilisterial substances by Lactobacillus paracasei BK57 isolated from Baikkimchi. In addition, the growth and in situ lactic acid and bacteriocin production of this strain were investigated during the manufacture of fresh cheese. And then the efficacy of using Lactobacillus starter as a protective culture to improve the safety of fresh cheese against Listeria monocytogenes KCTC 3569 was estimated. Maximum growth rate and activity of antibacterial substances were obtained in Lactobacilli MRS broth at $37^{\circ}C$ with controlled pH 6.0 after 30 h of incubation under aerobic condition. However, the growth rate and antimicrobial activity of bacteriocin produced in whole milk supplemented with yeast extract (2.0%) as a substrate were lower than those obtained in MRS broth. Live cells and cell-free culture supernatant of BK57 strain were effective in the suppression of L. monocytogenes in milk, whereas the inhibitory of the bacteriocin obtained from BK57 strain was higher in BHI broth than in milk. During storage at $4^{\circ}C$ and $15^{\circ}C$ for 6 days, no significant difference was found in the cell viability and antimicrobial activity of BK 57 strain in fresh cheese. In samples held at two temperatures, there was at least a 15% reduction in the numbers of the pathogen in fresh cheese artificially contaminated with approximately $10^5CFU/ml$ of L. monocytogenes within 6 days. Our results demonstrated the usefulness of L. paracasei BK57 having antilisterial activity as a biopreservative in the cheese making process.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구는 백김치로부터 분리된 Lactobacillus paracasei BK57의 항균물질 생산을 위한 최적의 배양 조건을 검색하고, BK57 유산균으로 프레쉬 치즈를 제조한 후 균주의 활성과 유산 및 박테리오신 생산량을 측정하여 Listeria monocytogenes KCTC 3569에 대한 항균 활성을 조사하였다. 최대의 균 증식과 항균 물질 생산량은 pH 6.
강산이나 단백질 분해효소에 대해 저항성이 있고 유해균에 대한 항균력을 발휘하는 프로바이오틱 균주를 가공 식품 제조 과정 중에 이용하거나, 우리가 섭취하여 체내에 유입되었을 때에도 유산균의 생존율이 높아서 박테리오신의 항균활성이 유지될 수 있을 것이다. 본 연구에서는 전보(Lim, 2014)에서 프로바이오틱의 기본 요건을 일부 충족하고, H. pylori ATCC 43504, Listeria monocytogenes KCTC 3569 및 Salmonella enteritidis ATCC 13706에 대한 항균력을 확인한 바 있는 Lactobacillus paracasei BK57 균주를 치즈 제조용 스타터로 활용하기 위하여 배양용 액체배지와 우유 배지 내에서의 유산균수, 유산 및 박테리오신 생산량을 비교하였다. 또한 우유 배지에서 실험 균주의 증식과 항균물질 생산량을 측정한 결과를 토대로 실험 균주로 치즈를 제조한 후 저장하는 동안 항균물질의 생성량과 L.
본 연구에서는 치즈 내 리스테리아균을 제어할 수 있는 유산균의 항균물질 생산을 배양 조건에 따라 측정함으로써 유산균의 증식 및 유산과 박테리오신 생산량이 초기 균수, 배지 초기 pH, 공기 조성, 배양시간 및 온도와 염 농도에 따라 달라짐을 확인하였다. 비록 우유 배지 내에서 L.

제안 방법

37°C, 24시간 동안 호기적인 조건 하에서 배양한 후 Oxford agar 상에서 평판 배양하여 L. monocytogenes의 균수를 조사하여 대조구(생균 및 항균물질 무첨가구)에 대한 균수 감소율(%)을 계산하였다.
50°C 항온수조 내에서 1시간 방치한 후 원심분리(4,000 × g, 20분, 4°C)하여 상등액(지방)과 침전물(카제인) 사이 중간층의 용해성 분획물(1.5 ml)를 회수하였다.
BHI broth에 L. monocytogenes세포 현탁액 1% (v/v)를 접종하고, MRS broth와 YEM에서 각각의 배양조건으로부터 얻은 유산균 배양 상등액(0.5%, v/v)을 첨가한 다음 37°C에서 24시간 배양하고 난 후 무균적으로 배양액을 적당히 희석한 다음 Oxford agar (Difco) 상에서 표준 평판배양법으로 생균수를 측정하여 항균물질에 의한 L.monocytogenes의 저해율(%)를 조사하였다.
BHI broth와 멸균 우유(지방 3.4% 함유)에 L. monocytogenes 세포 현탁액(1 × 105 CFU/ml) 1% (v/v)를 접종한 다음 유산균 세포 현탁액(1 × 105, 106 및 107 CFU/ml) 1% (v/v), 배양 상등액(1, 2, 3%) 및 박테리오신 용액(100, 200, 300 AU/ml)을 각각 첨가하였다.
High-pressure liquid chromatography (HPLC, Shimadzu)의 컬럼은 Aminex HPX-87H (300 × 7.8 mm: Bio-Rad)이며, 검출기는 refractive index (GBC Scientific Equipment Pty Ltd.), 이동상은 H2SO4 (5 mM), 유속은 0.5 ml/min이었고, 컬럼 온도 35°C하에서 분석하였다.
MRS broth와 효모추출물 2.0% (w/v)가 함유된 우유(지방 3.4% 함유) 배지(YEM) 내에서의 유산균의 증식 정도와 항균 물질 생산에 대한 배양 조건의 영향을 살펴보았다. 초기 균수의 영향을 살펴보기 위해 유산균을 MRS broth에서 배양한 후 원심분리하여 세포를 회수한 다음, 1.
0 × 10⁵ CFU/ml으로 맞추었고, 일정한 비율로 희석한 박테리오신 용액을 혼합한 후 microtiter plate well (Falcon)에 가한 다음 37°C에서 24시간 배양하였다. Microplate reader (BioTek, Inc.)를 통해 600nm에서 흡광도를 측정하여 박테리오신 용액 대신 buffer를 처리한 대조구에 비해 혼탁도가 50% 저해된 최대 희석배수의 역수를 측정하여 박테리오신 활성(arbitrary units, AU/ml)으로 환산하였다. 한편, 항균력 측정을 위해 BHI broth 내에서 배양된 L.
0 × 10⁷ CFU/ml)를 접종하여 37°C, 24시간 동안 호기적 조건하에서 배양하였다. 각각의 조건 하에서 배양한 다음 무균적으로 배양액을 채취하여 생균수, 유산 생성량 및 박테리오신 활성을 측정하였고, L. monocytogenes KCTC 3569에 대한 저해율을 조사하였다.
pylori ATCC 43504, Listeria monocytogenes KCTC 3569 및 Salmonella enteritidis ATCC 13706에 대한 항균력을 확인한 바 있는 Lactobacillus paracasei BK57 균주를 치즈 제조용 스타터로 활용하기 위하여 배양용 액체배지와 우유 배지 내에서의 유산균수, 유산 및 박테리오신 생산량을 비교하였다. 또한 우유 배지에서 실험 균주의 증식과 항균물질 생산량을 측정한 결과를 토대로 실험 균주로 치즈를 제조한 후 저장하는 동안 항균물질의 생성량과 L. monocytogenes에 대한 항균력을 조사하였다.
박테리오신 활성을 측정하기 위해 시료(5g)를 채취하여 4,500 × g, 4°C에서 10분간 원심분리하여 상등액을 얻었고, 이를 PBS (0.5 M, pH 7.0)으로 중화시킨 다음 여과 제균하고 앞서 언급한 microtiter plate method에 따라 L. monocytogenes 배양액(1.0 × 105 CFU/ml)에 대한 박테리오신의 활성을 측정하였다(Coelho et al., 2014).
배양 시간의 영향을 살펴보기 위해 유산균(1.0 × 107 CFU/ml)을 pH 6.0으로 조정한 MRS broth와 YEM에 접종하여 37°C, 24–48시간 동안 호기적 조건 하에서 배양하였다.
배양 온도의 영향을 살펴보기 위해 유산균(1.0 × 107 CFU/ml)을 pH 6.0으로 조정한 MRS broth와 YEM에 접종하여 25, 30, 37 및 45°C에서 24시간 호기적 조건으로 배양하였다.
배양 중 공기 조성의 영향을 살펴보기 위해 유산균(1.0 × 107 CFU/ml)을 pH 6.0으로 조정한 MRS broth와 YEM에 접종하여 37°C, 24시간 동안 호기성, 미호기성(85% N2, 5% O2, 10% CO2) 및 혐기성(85% N2, 10% H2, 5% CO2) 조건 하에서 배양하였다.
배지의 초기 pH에 대한 영향을 살펴보기 위해, MRS 와 YEM의 초기 pH를 5.0, 6.0, 7.0 및 8.0으로 조정한 다음 유산균(1.0 × 107 CFU/ml) 배양액 1%를 MRS broth 및 YEM에 각각 접종하고 37°C, 24시간 호기적 조건하에서 배양하였다.
약 20시간 경과 후 pH 4.5 부근에 도달하면 커드는 2 × 2 cm3의 크기로 자르고 40°C로 온도를 올려 가끔씩 저어주면서 약 1시간 정도 방치하여 유청을 배출한 후 멸균된 치즈틀에 담아 압착하고 4°C와 15°C에서 6일간 저장하는 동안 유산균수와 유산 생성량 및 박테리오신 활성을 측정하였다.
염농도에 대한 영향을 살펴보기 위해 pH 6.0으로 조정한 MRS broth와 YEM에 0.5, 1.0 및 2% (w/v)의 NaCl을 첨가한 다음 유산균(1.0 × 107 CFU/ml)를 접종하여 37°C, 24시간 동안 호기적 조건하에서 배양하였다.
유산균을 MRS broth (pH 6.0)에서 37°C, 24시간 동안 호기적 조건 하에서 배양하여 얻은 배양액을 원심분리(7,000 × g, 10분, 4°C)한 후 PBS (pH 7.0)로 2회 세척하였고, 원심분리한 배양액으로부터 상등액과 박테리오신 용액을 각각 조제하였다.
0 × 10⁵ CFU/ml, 1% [v/v])을 접종하고 각각의 온도 대에서 저장하였다. 일정한 시간 간격으로 시료(10 g)를 무균적으로 채취한 다음 9배의 PBS (pH 7.0)을 첨가하여 약 2분간 균질화(KMC-133V, Vision Scientific)하고 적당한 단계로 희석한 다음 앞서 언급한 방법에 따라 Oxford agar 상에서 배양 후 생성된 집락수를 계수하여 초기 균수에 대한 L. monocytogenes의 감소율(%)을 조사하였다.
제조된 치즈에 L. monocytogens 세포 현탁액(1.0 × 105 CFU/ml, 1% [v/v])을 접종하고 각각의 온도 대에서 저장하였다.
프레쉬 치즈는 Coelho 등(2014)의 방법을 일부 변형하여 제조하였다. 즉, 시판 우유(지방 3.4% 함유)에 CaCl₂ (0.02%)과 NaCl (1.0%)을 첨가하여 초기 균수 10⁷ CFU/ml로 조정한 유산균 배양액(1%, v/v)을 접종하였다. 그런 다음 렌넷(0.
초기 균수의 영향을 살펴보기 위해 유산균을 MRS broth에서 배양한 후 원심분리하여 세포를 회수한 다음, 1.0 × 105, 106 , 107 및 108 CFU/ml로 조정한 세포 현탁액(1%, v/v)을 MRS broth 및 YEM에 각각 접종하고 37°C, 24시간 호기적 조건하에서 배양하였다.
프레쉬 치즈는 Coelho 등(2014)의 방법을 일부 변형하여 제조하였다. 즉, 시판 우유(지방 3.
한편, BHI broth 내에서 배양된 L. monocytogenes를 회수하여 원심분리(7,000 × g, 10분, 4°C)한 후 PBS (pH 7.0)로 2회 세척하여 생균만을 모았다.
220 nm에서 흡광도를 측정하여 표준용액의 검량곡선으로부터 유산 함량을 정량하였다. 한편, 박테리오신 용액 제조를 위해 1N NaOH를 이용하여 배양 상등액의 pH를 6.5으로 조정하였으며, 과산화수소에 대한 영향을 배제하기 위해 카탈라아제 (1mg/ml, Sigma-Aldrich)를 처리하였다. 배양 상등액에 50% (w/v) 황산암모늄을 처리한 후 4°C 내에서 교반한 다음 원심분리(12,000 × g, 30분, 4°C)하여 얻어진 침전물은 20mM PBS (pH 6.
한편, 항균력 측정을 위해 BHI broth 내에서 배양된 L. monocytogenes를 회수하여 원심분리(7,000 × g, 10분, 4°C)한 후 PBS (pH 7.0)로 2회 세척하고 난 다음 1 × 105 CFU/ml로 균수를 조정하였다.

대상 데이터

지시 균주인 L. monocytogenes KCTC 3569는 Korean Collection for Type Cultures (KCTC)로부터 분양 받은 후 Brain Heart Infusion (BHI) broth에 접종한 다음 호기적 조건 하에 37°C, 24시간 배양하여 얻은 배양액은 글리세롤과 혼합하여 최종농도 20% (v/v)로 하여 보관하였다.

데이터처리

Data are means ± SD from triplicate determinations and the significant difference of means was estimated by Duncan’s multiple range test.
Data are means ± standard deviation (SD) from triplicate determinations and the significant difference of means was estimated by Duncan’s multiple range test.
모든 실험은 총 3회 실시 후 측정값은 평균±표준편차로 나타내었고, 통계분석은 SPSS Ver. 12.0 package program (SPSS)을 이용하여 군간의 차이 유무를 one-way ANOVA로 분석한 뒤 P < 0.05에서 유의한 차이가 있을 경우 Duncan’s multiple range test로 사후 검정하였다.

이론/모형

22 μm membrane filter로 여과 제균하여 박테리오신 용액을 조제하였다. 박테리오신 용액의 활성은 L. monocytogenes KCTC 3569을 대상으로 microtiter plate 방법(Hole et al., 1991)으로 측정하였다. L.
배양 후 얻어진 배양액은 십진희석법으로 희석한 다음 MRS agar (Difco) 배지 상에서 표준 평판배양법으로 유산균의 생균 수를 측정하였다. 배양액 내 유산 양을 측정하기 위해 배양액을 회수하여 원심분리(7,000 × g, 10분, 4°C) 하여 배양 상등액만을 모은 다음 0.
치즈 내에 함유된 유산의 양은 Ong 등(2006)의 방법에 따라 측정하였는데, 시료(5g)는 0.009 N 황산(25 ml)과 15.5 N 질산(70 μl)을 혼합하여 처리한 다음 10,000 rpm의 속도로 균질화하였다.

성능/효과

BHI broth 내에서 12시간 배양 후 L. monocytogenes는 BK57의 박테리오신 100AU/ml 하에서 가장 낮은 저해율(18.6 ± 0.4%)이 나타난, 반면 배양 상등액 3% 첨가에 의해선 42.4 ± 2.3%의 가장 높은 저해율을 나타내었다.
BK57 균주로 발효시킨 프레쉬 치즈를 4°C와 15°C에서 6일간 저장하는 동안 유산균수, 유산 생성량 및 박테리오신 활성은 유의한 변화가 없었다.
BK57의 생균 107 CFU/ml 첨가에 의해선 배양 36시간 만에 43.8 ± 0.7% 감소되었고, 배양 상등액 3%와 박테리오신 용액 300 AU/ml 첨가에 의해서는 각각 49.8 ± 1.0%와 21.0 ± 0.9% 저해되었다.
3%의 가장 높은 저해율을 나타내었다. BK57의 생균수와 첨가된 항균물질의 농도가 높을수록 항균력은 비례적으로 증가하였으며, 배양 12시간 보다는 24시간 배양했을 때 항균력은 다소 증가하였으나, 36시간에는 일부 조건에서 오히려 감소하는 것으로 나타났다. 반면, 우유에 존재하는 L.
E. faecium FAIR-E 198 균주로 치즈를 제조했을 때 유산균의 증식과 in situ 상에서의 박테리오신 생산량은 유당, 염 및 렌넷 등의 첨가량에 영향을 받는다고 알려졌다. 포도당 대신 유당을 첨가한 경우 유산균의 성장과 박테리오신 생산량이 감소되었고, NaCl (2.
L. monocytogenes (105 CFU/ml)를 치즈에 접종하여 4°C에서 저장한 경우 2일 후 약 18.7±1.1% 정도 감소되었고 6일까지 저해율은 비슷한 수준을 유지하였다.
유산 생성량은 초기 균수가 높을수록 많았고, MRS 내에서 생성된 유산의 양이 YEM 내에서 생성된 양보다 유의하게 높았다. L. monocytogenes KCTC 3569에 대한 박테리오신 활성은 MRS broth 내에서 10⁶ CFU/ml 이상의 균수 접종에 의해 520 AU/ml에 이르렀으나, YEM 배지 내에서는 MRS broth에서 생성된 양의 절반(260 AU/ml) 수준 정도였다. 배양 상등액 0.
L. monocytogenes에 대한 저해율은 YEM보다 MRS broth에서 높게 나타났고, MRS broth에서 24– 36시간 배양하여 얻은 배양액의 항균활성에는 유의할 만한 차이가 없었으나, 48시간 배양액 내에서는 박테리오신 활성 감소로 인하여 항균력이 크게 감소되었다.
MRS broth와 YEM의 초기 pH를 5.0–8.0으로 각각 조정한 다음 BK57의 초기 균수를 107 CFU/ml 접종하여 37°C, 24시간 동안 호기적인 조건에서 배양한 결과, 배지의 pH가 5.0과 8.0인 경우는 pH 6.0과 7.0에 비해 유산균수와 항균물질 생산량이 유의하게 낮게 나타났다.
MRS broth 내에 초기 균수를 10⁵ CFU/ml 접종한 경우는 37°C에서 24시간 배양 후 10⁸ CFU/ml에 도달했으나, 10⁶CFU/ml 이상인 경우는 10⁹ CFU/ml에 이르렀다. YEM에서 배양한 경우는 초기 균수가 증가할수록 배양 후 최종 균수도 높았으나, MRS broth에 비해 최종 균수가 약 1 log cycle 정도 낮게 나타났다. 유산 생성량은 초기 균수가 높을수록 많았고, MRS 내에서 생성된 유산의 양이 YEM 내에서 생성된 양보다 유의하게 높았다.
pH 6.5인 MRS broth와 우유 내에서 7종의 Lactobacillus 유산균의 성장과 대사산물 및 박테리오신 생산량을 측정한 결과, MRS broth에서 Lactobacillus casei는 Lactobacillus acidophilus에 비해 증식률이 높았으나, 박테리오신은 L.acidophilus에 의해 더 많은 양이 생산되었다. 그리고 우유 배지에 효모추출물을 첨가했을 때 Lactobacillus johnsonii La1 과 Lactobacillus gasseri K7의 성장률이 증가하였고, 대부분의 유산균은 0.
강산이나 단백질 분해효소에 대해 저항성이 있고 유해균에 대한 항균력을 발휘하는 프로바이오틱 균주를 가공 식품 제조 과정 중에 이용하거나, 우리가 섭취하여 체내에 유입되었을 때에도 유산균의 생존율이 높아서 박테리오신의 항균활성이 유지될 수 있을 것이다. 본 연구에서는 전보(Lim, 2014)에서 프로바이오틱의 기본 요건을 일부 충족하고, H.
MRS broth와 비교했을 때 Lactobacillus 유산균은 효모추출물을 첨가한 우유 배지 내에서 박테리오신 생산량이 낮았는데 그 이유로는 낮은 균 증식과 카제인 등 우유 성분에 박테리오신 분자가 결합하여 검출이 어려울 수 있으며, 우유 내에서 박테리오신 활성이 발효 후반에 생산되기 때문이다. 게다가 박테리오신 분해도 두 배지 사이에 차이 있었는데, MRS broth에서는 정지기 초반부터 박테리오신이 빠르게 분해되기 시작하여 발효 종료시점에는 거의 완전히 분해된 반면 효모추출물을 첨가한 우유 배지 내에서는 박테리오신의 활성이 비교적 안정하였다. 우유 배지 내에서 박테리오신 활성이 안정한 이유는 정확하게 밝혀지진 않았지만, MRS broth에서와는 달리 특별한 우유 구성성분들이 유산균 세포에 박테리오신 분자가 흡착되는 것을 방해하는 것으로 추정된다고 보고하였다(Avonts et al.
게다가 유산균을 첨가하지 않은 대조구에서 L. monocytogenes의 초기 균수 105 CFU/ml는 4°C, 7일 동안 서서히 증가하여 108 CFU/ml에 도달하였으나, 유산균으로 배양한 치즈 내에서 L. monocytogenes는 유의하게 감소되었다.
공기 조성에 대한 영향을 살펴보기 위해 MRS broth와 YEM의 초기 pH를 6.0으로 조정한 다음 BK57의 초기 균수 107 CFU/ml를 접종한 다음 37°C, 24시간 동안 호기적, 미호기적 및 혐기적 조건 하에서 배양한 결과, 호기와 미호기적인 조건 하에서는 유산균수와 항균물질 생산량에 유의한 차이가 없었으나, 혐기적인 조건 하에서는 이보다 유의하게 낮은 값이 나타났다.
monocytogenes에 대한 저해율에 유의적인 차이가 없었으므로 최대 2% 농도의 NaCl은 BK57균주의 성장과 항균물질 생산에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다. 그러나 YEM에 NaCl를 첨가했을 때 유산균수와 유산량 및 항균력에는 유의할 만한 차이가 없었으나, NaCl을 0.5% 이상 첨가했을 때는 첨가하지 않았을 때에 비해 박테리오신 활성이 다소 증가되었다.
0인 YEM에서 생성된 박테리오신 활성에는 차이가 없었다. 따라서 BK57 균주의 증식과 항균물질 생산을 위한 배지의 최적 pH는 6.0임을 확인하였다. 공기 조성에 대한 영향을 살펴보기 위해 MRS broth와 YEM의 초기 pH를 6.
monocytogenes KCTC 3569의 저해율을 조사한 결과, YEM 보다 MRS broth로부터 얻은 배양 상등액의 저해율이 유의하게 더 높았다. 따라서 BK57은 MRS와 YEM에서 초기 균수가 최소 10⁶ CFU/ml 이상인 경우 유산균수는 최대에 이르고 이에 따라 항균물질 생산량도 높았는데, 그 중에서도 10⁷ CFU/ml인 경우 유산량과 박테리오신 활성이 다소 높았기 때문에 최적의 접종 균수임을 확인하였다. MRS broth와 YEM의 초기 pH를 5.
이와 같이 유산균의 증식과 항균물질 생산량이 YEM보다 치즈에서 낮게 나타난 이유는 YEM 내에 첨가된 yeast extract의 영향과 치즈 제조에 첨가된 렌넷이나 CaCl₂가 항균물질 생산에 영향을 미치는 것으로 추정되었다. 따라서 yeast extract의 영향을 살펴본 결과, 효모추출물 2% 첨가에 의해 유산균의 증식과 항균물질 생산에 유의한 차이가 있는 정도로 증가되었으나, 렌넷(0.002%)과 CaCl₂(0.02%)는 BK57 균주의 증식과 항균물질 생산에 영향을 거의 미치지 않았다(결과 미제시). 한편, YEM에서 보다 유산균수와 항균물질의 양이 낮아져 치즈에 접종한 L.
monocytogenes Scott A (10⁴ CFU/g)을 접종하여 4°C에서 저장한 결과, 24시간 만에 약 1 log cycle 감소된 후 저장기간 동안 서서히 감소하여 5일 후에는 생균이 검출되지 않았다고 하였다. 또한 제조한 치즈의 pH와 박테리오신 활성을 측정한 결과, 약 pH 5.2 정도였고 이는 저장하는 동안 거의 변함이 없었으며, lacticin 3147의 활성은 약 2,560 AU/ml였고 저장하는 동안 일정하게 유지하여 본 실험 결과의 박테리오신 활성과 항균력보다는 높은 것으로 확인되었다. 게다가 저장 온도가 높아짐에 따라 소르빈산의 항균 효과가 감소된 것에 반해 lacticin 3147의 항리스테리아 활성은 4°C 뿐만 아니라 18°C와 30°C에서도 높게 나타났고 하였다.
BK57의 생균수와 첨가된 항균물질의 농도가 높을수록 항균력은 비례적으로 증가하였으며, 배양 12시간 보다는 24시간 배양했을 때 항균력은 다소 증가하였으나, 36시간에는 일부 조건에서 오히려 감소하는 것으로 나타났다. 반면, 우유에 존재하는 L. monocytogenes의 균수는 유산균의 생균과 배양 상등액 처리에 의해 BHI broth 내에서 보다 더 낮게 검출되어 저해율이 더 높게 나타난 반면, 박테리오신의 항균력은 우유 내에서 더 낮게 나타났다. BK57의 생균 10⁷CFU/ml 첨가에 의해선 배양 36시간 만에 43.
monocytogenes KCTC 3569에 대한 박테리오신 활성은 MRS broth 내에서 10⁶ CFU/ml 이상의 균수 접종에 의해 520 AU/ml에 이르렀으나, YEM 배지 내에서는 MRS broth에서 생성된 양의 절반(260 AU/ml) 수준 정도였다. 배양 상등액 0.5% 첨가에 의한 L. monocytogenes KCTC 3569의 저해율을 조사한 결과, YEM 보다 MRS broth로부터 얻은 배양 상등액의 저해율이 유의하게 더 높았다. 따라서 BK57은 MRS와 YEM에서 초기 균수가 최소 10⁶ CFU/ml 이상인 경우 유산균수는 최대에 이르고 이에 따라 항균물질 생산량도 높았는데, 그 중에서도 10⁷ CFU/ml인 경우 유산량과 박테리오신 활성이 다소 높았기 때문에 최적의 접종 균수임을 확인하였다.
배양 시간의 영향을 살펴보기 위해 초기 pH 6.0인 MRS broth와 YEM에 BK57의 초기 균수 107 CFU/ml를 접종하고 37°C에서 호기적으로 배양한 결과, 배양 24시간 만에 MRS와 YEM에서 각각 109과 108 CFU/ml에 이르렀으며 이들의 최고 균수는 30시간에도 유지되었다.
하지만 YEM 배양액의 항균력은 배양시간 동안 거의 일정한 수준으로 나타났다. 배지내 NaCl의 함량에 대한 영향을 살펴본 결과, MRS broth에 NaCl을 첨가하지 않는 경우와 최대 2%를 첨가한 경우에는 유산균수와 항균물질 생산량 및 배양 상등액의 L. monocytogenes에 대한 저해율에 유의적인 차이가 없었으므로 최대 2% 농도의 NaCl은 BK57균주의 성장과 항균물질 생산에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다. 그러나 YEM에 NaCl를 첨가했을 때 유산균수와 유산량 및 항균력에는 유의할 만한 차이가 없었으나, NaCl을 0.
0으로 조정한 다음 BK57의 초기 균수 10⁷ CFU/ml를 접종한 다음 37°C, 24시간 동안 호기적, 미호기적 및 혐기적 조건 하에서 배양한 결과, 호기와 미호기적인 조건 하에서는 유산균수와 항균물질 생산량에 유의한 차이가 없었으나, 혐기적인 조건 하에서는 이보다 유의하게 낮은 값이 나타났다. 비록 YEM에서 생산된 박테리오신의 양은 호기와 미호기적 배양하에서 동일하게 나타났으나, MRS broth 상에서 박테리오신 생산량은 미호기적 조건(520 AU/ml) 보다는 호기적 조건(550AU/ml)에 다소 높게 나타났으며, 이에 따라 L. monocytogenes에 대한 저해율도 높게 나타났으므로 호기적인 조건하에서 배양한 것이 적합함을 확인하였다.
본 연구에서는 치즈 내 리스테리아균을 제어할 수 있는 유산균의 항균물질 생산을 배양 조건에 따라 측정함으로써 유산균의 증식 및 유산과 박테리오신 생산량이 초기 균수, 배지 초기 pH, 공기 조성, 배양시간 및 온도와 염 농도에 따라 달라짐을 확인하였다. 비록 우유 배지 내에서 L. paracasei BK57 균주의 성장 및 항균물질 생성량이 MRS broth 내에서 보다는 낮았으나, 우유 배지에서 생산된 항균물질에 의해서도 유의할만한 수준의 L. monocytogenes KCTC 3569 제균 효과가 나타났으므로 BK57 균주는 식품 내 환경에서 성장이 양호하였고 그에 따라 항균활성도 높아서 식품 제조 가공 시스템에 적용이 가능할 것으로 판단된다. 이러한 결과를 바탕으로 우유를 원료로 한 발효식품인 치즈 제조 시에 BK57 균주로 발효시킨 후 4°C와 15°C에서 6일간 저장하는 동안 항리스테리아 활성을 조사한 결과, 치즈 내에 존재하는 리스테리아균을 효과적인 제어할 수 있는 정도의 항균물질을 생산하였고 저장하는 동안에도 일정한 수준으로 항균력이 유지됨을 확인하였다.
0%)을 첨가한 전유 내에서 생성된 항균물질의 양과 유산균의 증식률은 MRS broth에서 보다는 다소 낮았다. 우유 내에서 L. monocytogenes의 저해율은 BK57 균주의 생균과 배양 상등액에 의해 높게 나타났으나, 유산균이 생산한 박테리오신에 의한 저해율은 우유 보다는 BHI broth 내에서 더 높게 나타났다. BK57 균주로 발효시킨 프레쉬 치즈를 4°C와 15°C에서 6일간 저장하는 동안 유산균수, 유산 생성량 및 박테리오신 활성은 유의한 변화가 없었다.
YEM에서 배양한 경우는 초기 균수가 증가할수록 배양 후 최종 균수도 높았으나, MRS broth에 비해 최종 균수가 약 1 log cycle 정도 낮게 나타났다. 유산 생성량은 초기 균수가 높을수록 많았고, MRS 내에서 생성된 유산의 양이 YEM 내에서 생성된 양보다 유의하게 높았다. L.
이러한 결과를 바탕으로 우유를 원료로 한 발효식품인 치즈 제조 시에 BK57 균주로 발효시킨 후 4°C와 15°C에서 6일간 저장하는 동안 항리스테리아 활성을 조사한 결과, 치즈 내에 존재하는 리스테리아균을 효과적인 제어할 수 있는 정도의 항균물질을 생산하였고 저장하는 동안에도 일정한 수준으로 항균력이 유지됨을 확인하였다.
9% 저해되었다. 이상의 결과에서 볼 때 BHI broth 보다 우유 배지 내에서 유산균과의 혼합배양에 의해 항균력이 더 높게 나타난 것은 BHI broth 내에 L. monocytogenes의 증식에 유리한 다양한 영양원이 함유되어 유산균의 항균활성에 대한 저항성이 증가된 것으로 추정한다. 하지만 박테리오신의 항균활성이 우유 내에서 감소된 것은 우유 단백질인 카제인 미셀과 같은 입자에 박테리오신 분자가 흡착되었기 때문이라고 보고한 Maisnier-Patin 등 (1992)의 결과와 일치하는 것으로 간주된다.
이상의 결과에서 볼 때 BK57 균주는 NaCl농도 0.5–2.0%와 pH 6.0인 배지에 초기 균수 106 CFU/ml 이상 접종하여 37°C에서 24시간 동안 호기적인 조건 하에서 배양할 경우 유산균의 증식이 최대에 이르렀고, 균수가 증가할수록 항균물질 생산량도 비례적으로 증가하였으며, 이에 따라 L. monocytogenes에 대한 저해율도 증가됨을 알 수 있었다.
박테리오신 활성(240 AU/ml)도 YEM 내에서 생산된 양보다 낮게 나타났으나, 각각 온도에서 6일 동안에는 활성에 변화가 없었다. 이와 같이 유산균의 증식과 항균물질 생산량이 YEM보다 치즈에서 낮게 나타난 이유는 YEM 내에 첨가된 yeast extract의 영향과 치즈 제조에 첨가된 렌넷이나 CaCl₂가 항균물질 생산에 영향을 미치는 것으로 추정되었다. 따라서 yeast extract의 영향을 살펴본 결과, 효모추출물 2% 첨가에 의해 유산균의 증식과 항균물질 생산에 유의한 차이가 있는 정도로 증가되었으나, 렌넷(0.
BK57 균주로 발효시킨 프레쉬 치즈를 4°C와 15°C에서 6일간 저장하는 동안 유산균수, 유산 생성량 및 박테리오신 활성은 유의한 변화가 없었다. 제조 직 후 프레쉬 치즈에 인위적으로 접종한 L. monocytogenes (10⁵ CFU/ml)의 균수는 각각의 온도대에서 6일 이내에 최소 15% 이상 감소되는 효과가 나타났으므로 BK57 균주를 발효유제품 제조에 이용할 경우 리스테리아균을 제어할 수 있는 생물학적 보존제로서의 가치를 확인하였다.
최대의 균 증식과 항균 물질 생산량은 pH 6.0으로 조정한 MRS broth에서 37°C, 24시간 동안 호기적인 조건으로 배양했을 때 나타났다.
0에 비해 유산균수와 항균물질 생산량이 유의하게 낮게 나타났다. 특히 유산균수와 유산의 생성량은 pH 6.0와 7.0에서 유의한 차이가 없었으나, MRS broth 내에서 생성된 박테리오신 양은 pH 7.0보다 6.0에서 더 높게 나타났다. 그러나 pH 6.
faecium FAIR-E 198 균주로 치즈를 제조했을 때 유산균의 증식과 in situ 상에서의 박테리오신 생산량은 유당, 염 및 렌넷 등의 첨가량에 영향을 받는다고 알려졌다. 포도당 대신 유당을 첨가한 경우 유산균의 성장과 박테리오신 생산량이 감소되었고, NaCl (2.0%)에 의해서도 생산량이 낮아졌다. FAIR-E 198의 박테리오신은 탈지유(10%) 내에서 생산되지 않았으나, 탈지유에 펩톤(1%)과 효모추출물(0.
02%)는 BK57 균주의 증식과 항균물질 생산에 영향을 거의 미치지 않았다(결과 미제시). 한편, YEM에서 보다 유산균수와 항균물질의 양이 낮아져 치즈에 접종한 L. monocytogenes KCTC 3569에 대한 항균력도 다소 감소하였다. L.
한편, 배양 온도의 영향을 살펴본 결과, MRS broth (pH 6.0)에서 25°C와 45°C에서 24시간 동안 호기적으로 배양했을 때 균수는 108 CFU/ml 정도로 30°C와 37°C에 비해 1 log cycle 이상 낮게 나타났고, 유산과 박테리오신 생성량도 유의하게 낮게 나타났다.
, 1992). 한편, 호기적인 조건과 혐기적인 조건 하에서 L. paracasei LA07은 균 증식과 박테리오신 생산량에 유의한 차이가 없었다고 하여본 결과와 다소 차이가 있었다. 일반적으로 유산균은 적당한 양의 산소 존재 하에서나 혹은 제한된 조건하에서 박테리오신을 생산하는 것으로 알려져 있다(Abbasiliasi et al.

후속연구

이러한 결과를 바탕으로 우유를 원료로 한 발효식품인 치즈 제조 시에 BK57 균주로 발효시킨 후 4°C와 15°C에서 6일간 저장하는 동안 항리스테리아 활성을 조사한 결과, 치즈 내에 존재하는 리스테리아균을 효과적인 제어할 수 있는 정도의 항균물질을 생산하였고 저장하는 동안에도 일정한 수준으로 항균력이 유지됨을 확인하였다. 따라서 L. paracasei BK57 균주를 발효 스타터로 사용할 경우 치즈의 저장 기간을 연장시키고 리스테리아균수를 감소시킴으로써 식중독의 발생 위험을 저감화할 수 있을 것으로 기대된다. 향후 연구에서는 다양한 식중독 및 부패균에 대한 BK57 균주로 제조한 치즈의 항균스펙트럼을 조사하고, 치즈의 관능검사 및 in vivo 상의 안전성 평가를 실시하여 식품의 품질과 안전성을 향상시키기 위한 유산균의 생물학적 보존제로서의 이용 가치를 높이고자 한다.
paracasei BK57 균주를 발효 스타터로 사용할 경우 치즈의 저장 기간을 연장시키고 리스테리아균수를 감소시킴으로써 식중독의 발생 위험을 저감화할 수 있을 것으로 기대된다. 향후 연구에서는 다양한 식중독 및 부패균에 대한 BK57 균주로 제조한 치즈의 항균스펙트럼을 조사하고, 치즈의 관능검사 및 in vivo 상의 안전성 평가를 실시하여 식품의 품질과 안전성을 향상시키기 위한 유산균의 생물학적 보존제로서의 이용 가치를 높이고자 한다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	유산균은 어떤 효능이 있는가?	이제까지 밝혀진 많은 생리활성 중에서 유산균은 식품에 오염된 식중독균 제어에 효과적일 뿐만 아니라, 위장 질환의 원인균인 Helicobacter pylori의 증식을 억제시켜 위염이나 위암 발생 위험을 낮추고, 대장 내 각종 유해균의 증식을 억제하여 장내 환경을 개선함으로써 장 건강에 도움을 주는 것으로 알려져 있다(De Vuyst and Leroy, 2007). 이들의 항균활성은 발효과정 중 생성되는 유기산, 디아세틸, 과산화수소 및 박테 리오신 등에 기인하며, 이러한 항균 물질에 의해 식품 내 부패 균이나 식중독균의 증식을 억제하고 사멸시켜 식품의 품질을 향상시킨다(Lindgren and Dobrogosz, 1990).
	박테리오신은 어떤 물질인가?	박테리오신은 단백질 분해효소에 의해 분해되어 체내에 축적되지 않고, 광범위한 pH나 온도에서도 비교적 안정하며, 장내 균총에는 악영향을 주지 않으면서 유해세균에 대한 항균효 과를 나타내는 등 Generally Recognized As Safe (GRAS)로서미 FDA에 의해 식품첨가물로 사용이 허가된 물질이다(Gälvez et al., 2007).
	유산균의 항균활성 메커니즘은?	이제까지 밝혀진 많은 생리활성 중에서 유산균은 식품에 오염된 식중독균 제어에 효과적일 뿐만 아니라, 위장 질환의 원인균인 Helicobacter pylori의 증식을 억제시켜 위염이나 위암 발생 위험을 낮추고, 대장 내 각종 유해균의 증식을 억제하여 장내 환경을 개선함으로써 장 건강에 도움을 주는 것으로 알려져 있다(De Vuyst and Leroy, 2007). 이들의 항균활성은 발효과정 중 생성되는 유기산, 디아세틸, 과산화수소 및 박테 리오신 등에 기인하며, 이러한 항균 물질에 의해 식품 내 부패 균이나 식중독균의 증식을 억제하고 사멸시켜 식품의 품질을 향상시킨다(Lindgren and Dobrogosz, 1990).

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Wee, Y.J., Kim, J.N., and Ryu, H.W. 2006. Biotechnological production of lactic acid and its recent applications. Food Technol. Biotechnol. 44, 163-172.
Yang, R., Johnson, M.C., and Ray, B. 1992. Novel method to extract large amounts of bacteriocins from lactic acid bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 58, 3355-3359.

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Zalan, Z., Hudacek, J., Stetina, J., Chumchalova, J., and Halasz, A. 2010. Production of organic acids by Lactobacillus strains in three different media. Eur. Food Res. Technol. 230, 395-404.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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