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문제 정의
- 가축산업분야에서 항생제의 사용이 금지됨에 따라, 질병예방을 통한 축산농가의 생산성 향상을 위해 사료첨가제인 미생물제재의 개발과 같은 예방적 수단이 필요하게 되었다. 본 연구는 가축의 생산성을 높이기 위해 사료 분해 능력이 좋고 항균활성이 뛰어난 포자 형성 Bacillus 균주 3종인 B. sutilis LCB7, B. licheniformis SHS14, B. amyloliquefaciens LCB10을 우수 균주로 선발하였다. 최종적으로 선발한 Bacillus 3종을 1:1:1 비율로 혼합하여 혼합 종균을 제조하여 항균시험(in vitro) 결과, 단일 3종 및 lincomycin과 비교하여 유사한 활성을 보여주었으며, 송아지를 이용하여 항균활성 시험(in vivo) 을 실시한 결과에서도 lincomycin 투여 대비 90% 수준의 높은 활성을 보여주었다.
제안 방법
- 37°C에서 24시간 동안 반응시킨 후, 투명환 직경을 측정하여 protease activity를 측정하였다.
- DNA fragment sample에 Platinum® PCR SuperMix High Fidelity와 Library Amplification Primer Mix를 혼합하여 95°C 에서 5분 initial denaturation을 수행한 뒤, 95°C에서 15초, 58°C에서 15초, 70°C에서 1분 간 총 18 사이클 반복 수행하였다.
- Emulsion PCR 완료 후 회수된 ISPs Pellet은 Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads (Life technologies™)를 사용해 정제되었고, Qubit® 2.0 Flurometer를 사용하여 ISP 농도를 확인하였다.
- ISP sample에 control ISP를 혼합하여 15,500 × g에서 4분간 원심분리 하였고, 수거된 ISP pellet은 sequencing primer와 혼합하여 95°C에서 2분, 37°C에서 2분간 incubation 하였다.
- 총 평가는 20일간 수행하였으며, 살모넬라균은 109 CFU/ml 농도로 200 ml를 실험개시 3일, 6일, 9일째급여하였다. Lincomycin은 체중 10 kg당 1일 0.2 g을 투여하였다. 분석은 송아지로부터 분변을 무균적으로 채취하여 -70°C에서 보관 후 RT-PCR (real-time PCR)을 통해 확인 하였다.
- 동일 조건에서 배양 후 2% Congo Red 용액을 반응시키고, 1 M NaCl로 세척하여 투명환의 직경을 측정하였다. Lipase Activity는 1% glyceryl tributyrate 를 최소배지를 활용하여 배양 상등액을 주입하고 투명환의 직경을 측정하였다. 항생제 내성 균주의 출현으로 인해 축산분야에서의 항생제 사용이 엄격하게 규제되고 있으며, 세계적인 추세에 따라 2011년 하반기부터 국내에서 완전히 사용이 금지되고 있기 때문에, 소의 장내 설사를 유발하는 유해미생물인 Salmonella dublin ATCC15480 (Szczawinska et al.
- NA 배지를 bottom 배지로 제조하고, 0.7% soft agar (TSB)를 제조하여 OD값 0.4–0.5로 배양된 유해미생물을 주입하여 top agar로 하여 bottom agar에 각 25 ml 분주하였다.
- 생균을 포함한 사료를 투여시 위산(pH 1–2)에 견디어 장까지 도달해서 정상적인 기능을 발휘할 수 있어야 한다. NaCl 0.4 g + HCl 1.4 ml = 200 ml volumetric flask 표선을 맞춘 인공위액에 균주배양액을 넣고 4시간 교반한 후 교반 전과 교반 후의 미생물 생균수를 계수 하였다. 내담즙성은 TSB 배지에 OXGALL을 0, 0.
- PCR은 95°C에서 1분 initial denaturation을 수행한 뒤, 95°C에서 30초, 53°C에서 30초, 72°C에서 1분 간 총 35 사이클 반복 수행하였다. PCR 완료 후 1% TBE agrose gel에서 전기 영동 하여 밴드를 확인 하였고, gel purification kit (Bioneer) 를 사용하여 정제하였다. 염기서열 분석은 Macrogen Inc.
- PCR은 95°C에서 1분 initial denaturation을 수행한 뒤, 95°C에서 30초, 53°C에서 30초, 72°C에서 1분 간 총 35 사이클 반복 수행하였다.
- NB broth에서 24시간 진탕 배양 (37°C, 180 rpm)된 배양액을 실험에 사용하였다. Protease activity는 2% skim milk 최소 배지 활용하여 측정하였다. 각 균주 배양액 100 μl를 6 mm cork borer로 구멍을 뚫은 배지에주입하였다.
- Sequencing sample은 Ion 316™ Chip Kit V2 (Life technologies™)에 loading 되었고, sequencing은 Ion PGM™ (Life Technologies) 장비를 사용하여 수행되었다.
- Torrent Suite Server에서 raw data를 export 하여 Ion Reporter™ (Life Technologies, ver. 4.6) program을 사용하여 16S rRNA metagenomics 분석을 수행하였다.
- 각 균주 배양액 100 μl를 6 mm cork borer로 구멍을 뚫은 배지에주입하였다.
- 같은 방법으로 amylase activity는 1.5% starch 최소 배지를 사용하였으며, 24시간 반응 후, lügol solution을 첨가하여 발색 반응 후, 투명환의 직경(mm)을 측정하였다.
- 개발한 혼합 종균에 대한 항균활성을 송아지에서 평가하였다. 분변에서의 생존상태의 살모넬라 검출을 위해 PMA-Lite™LED Photolysis Device (Biotium Inc.
- 4 ml = 200 ml volumetric flask 표선을 맞춘 인공위액에 균주배양액을 넣고 4시간 교반한 후 교반 전과 교반 후의 미생물 생균수를 계수 하였다. 내담즙성은 TSB 배지에 OXGALL을 0, 0.5, 1.5, 2.5, 3.5%로 0 h, 6 h, 12 h, 24 h 주기로 평가하여 600 nm에서 OD값을 측정하였다. 당이용능은 생화학적 동정 kit인 API50 CH kit (bioMérieux) 를 이용하여 분석하였다.
- 당이용능은 생화학적 동정 kit인 API50 CH kit (bioMérieux) 를 이용하여 분석하였다.
- 5% caboxymethly cellulose 최소배지를 사용하였다. 동일 조건에서 배양 후 2% Congo Red 용액을 반응시키고, 1 M NaCl로 세척하여 투명환의 직경을 측정하였다. Lipase Activity는 1% glyceryl tributyrate 를 최소배지를 활용하여 배양 상등액을 주입하고 투명환의 직경을 측정하였다.
- 발효 사료에는 다양한 부산물이 첨가됨으로 효소활성이 우수한 균주를 선발하기 위해 균주 배양액을 활용하여 아래와 같은 효소활성을 측정하였다. 또한 균주 배양액을 원심 분리하여 얻은 상등액으로 2차 효소활성을 측정하였다. 효소의 활성은 다음과 같이 측정하였다.
- 본 연구에서는 송아지의 설사병 원인 균인 대장균과 살모넬라균에 대해 항균활성이 있고 장내에서 유해미생물 억제 및 소화 효율 증진 효과를 가져올 수 있는 생균제로 가능성을 탐색하고자 포자형성 유용 균인 Bacillus sp.를 선발하여 사료첨가제로의 활용가능성을 평가 하였다.
- 분리 동정된 Bacillus 균주의 특성평가로는 효소활성, 항균 활성, 내열성, 내산성, 내담즙성 및 당이용 능을 분석하였다. 발효 사료에는 다양한 부산물이 첨가됨으로 효소활성이 우수한 균주를 선발하기 위해 균주 배양액을 활용하여 아래와 같은 효소활성을 측정하였다. 또한 균주 배양액을 원심 분리하여 얻은 상등액으로 2차 효소활성을 측정하였다.
- 발효사료 제조용 종균으로 선발된 3종의 Bacillus 균주를 혼합하여 제조한 종균의 항균활성과 효소활성을 분석하였다. 항균활성과 효소활성이 높은 선발한 3종의 Bacillus 균주를 각각 NB broth에 배양하여 배양액을 1:1:1로 혼합하여 다시 37°C, 24 h, 180 rpm 조건에서 증균 배양하고 0.
-
Bacillus 균주 특성 분석
분리 동정된 Bacillus 균주의 특성평가로는 효소활성, 항균 활성, 내열성, 내산성, 내담즙성 및 당이용 능을 분석하였다. 발효 사료에는 다양한 부산물이 첨가됨으로 효소활성이 우수한 균주를 선발하기 위해 균주 배양액을 활용하여 아래와 같은 효소활성을 측정하였다.
- 분변에서의 생존상태의 살모넬라 검출을 위해 PMA-Lite™LED Photolysis Device (Biotium Inc.)를 전처리하였고 realtime PCR (Fast 7500, Life Technologies)을 통해 얻은 Ct값으로 살모넬라균의 분변 내 함유량을 측정하였으며, C값이 40이상을 음성으로 평가하였다(Table 6).
- 분변으로부터 생존 상태의 살모넬라균의 분리를 위해 Propidium monoazideTM (PMA, Biotium)을 30 μM 농도로 넣고 PMA-Lite™ LED photolysis device (E9002, Biotium)를 이용하여 465–475 nm의 LED 광원을 15분간 조사하였다(Banihashemi et al., 2012).
- 분석은 송아지로부터 분변을 무균적으로 채취하여 -70°C에서 보관 후 RT-PCR (real-time PCR)을 통해 확인 하였다.
- 살모넬라균의 DNA추출은 AccuPrep® Stool Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer)를 사용하였고 살모넬라균의 정량검사는 PowerChek Salmonella Real-time PCR Kit (Kogene Biotech)를 이용하였다.
- 선발 균주의 송아지에서의 항균력 평가를 위해 3개월 송아지 15마리를 대상으로 다음 5개 group으로 나누어 실험을 수행하였다. Group 1은 대조군(3마리), group 2는 혼합 종균 급여(3마리), group 3은 혼합 종균과 살모넬라 급여(3마리), group 4는 lincomycin과 살모넬라 급여(3마리), group 5는 살모넬라만 급여(3마리) 하였다.
- 선발한 Bacillus 균주 3종에 대해 당이용 능(Table 2), 내열성(Table 3), 내산성(Table 4), 및 내담즙성 평가를 실시하였다. 3종인 SHS14, LCB7, LCB10에 대하여 내열성 평가결과, 19%이상의 생존율을 보였으며, 내산성을 평가한 결과, LCB10만이 19.
- 천공하고, 준비된 분리배양액 100 μl를 홀에 주입하고 37°C에서 12 h 배양한 후 투명환의 직경을 측정하였다.
- Group 1은 대조군(3마리), group 2는 혼합 종균 급여(3마리), group 3은 혼합 종균과 살모넬라 급여(3마리), group 4는 lincomycin과 살모넬라 급여(3마리), group 5는 살모넬라만 급여(3마리) 하였다. 총 평가는 20일간 수행하였으며, 살모넬라균은 109 CFU/ml 농도로 200 ml를 실험개시 3일, 6일, 9일째급여하였다. Lincomycin은 체중 10 kg당 1일 0.
- dublin ATCC15480에 대해 평가한 결과, 대조구와 유사한 활성을 보여주었다(Table 5). 최종적으로 제조한 혼합 종균의 보존안정성을 확인하기 위해 혼합 종균을 동결분말상태로 제조 후에 증균 전후의 미생물 군집의 변화를 pyrosequencing 방법으로 확인하였다(Fig. 3). 그 결과, 증균 전에는 인위적으로3 종을 1:1:1 (B.
- 항균활성과 효소활성이 높은 선발한 3종의 Bacillus 균주를 각각 NB broth에 배양하여 배양액을 1:1:1로 혼합하여 다시 37°C, 24 h, 180 rpm 조건에서 증균 배양하고 0.45 μl syringe filter로 filtering하여 효소활성과 항균활성을 평가하였다(Table 5).
대상 데이터
- Autoclave로 100°C에서 30분간 살균하여 생존율 10% 이상인 균종을 선발하고자 하였다.
- DNA library는 Ion 16S™ Metagenomics Kit (Life Technologies)를 사용하여 제품의 사용 설명서에 따라 준비하였다.
- Sequencing은 Ion PGM™ Sequencing Reagent 400 kit를 이용해 준비되었다.
- 유산균은 주로 Lactobacillus 속, Leuconostoc 속, Lactococcus 속이었고, 기타 세균은 Staphylococcus 속, Alicyclobacillus 속, Enterococcus 속, Moraxella 속, Klebsiella 속이었다. 동정된 136종에 대하여 효소활성과 항균활성을 평가하여 상대적으로 활성이 우수한 10종을 선발 하였다(Table 1). 선발된 10종 중에서 최종 Bacillus 속 3종을선정하였으며, 선정된 3종에 대해 확인 동정을 16S rRNA 염기서열 분석법 실시한 결과, B.
- 분리 원은 발효사료 제조기업에서 종균 증식에 사용되는 원료인 당밀과 1차 배합사료의 원료로 쓰이는 버섯 분, 대두 박과 1차 배양액, 축우용 발효 사료 완제품을 수집하여 종류에 따라 상온 또는 냉장 보관하여 실험에 사용하였다.
- 증폭된 DNA fragment sample은 Ion Library Quantitation Kit (Life technologies™)의 제품 사용 설명서에 따라 serially dilution으로 준비되었고 control로 E. coli DH10B Control 400 Library (Ion Torrent, Life technologies™)이 사용되었다.
- Lipase Activity는 1% glyceryl tributyrate 를 최소배지를 활용하여 배양 상등액을 주입하고 투명환의 직경을 측정하였다. 항생제 내성 균주의 출현으로 인해 축산분야에서의 항생제 사용이 엄격하게 규제되고 있으며, 세계적인 추세에 따라 2011년 하반기부터 국내에서 완전히 사용이 금지되고 있기 때문에, 소의 장내 설사를 유발하는 유해미생물인 Salmonella dublin ATCC15480 (Szczawinska et al., 1991) 과 E. coli K99 (Yousif et al., 2013)를 전북대 수의학과로부터 분양 받아 agar diffusion assay법을 통하여 항균활성 균주를 선발하였다. NA 배지를 bottom 배지로 제조하고, 0.
데이터처리
- Raw data는 DNASTAR (DNASTAR Inc.) 프로그램을 사용 하여 assemble 수정을 하였고, 수정된 sequence는 ClustalW2 (EBI) 프로그램을 사용하여 reference strain과 정렬시켰다. Genetic distance는 Kimura’s two-parameter model을 사용하여 확인하였고, neighbor-joining phylogenetic trees는 MEGA5 (Tamura et al.
- 0 프로그램을 이용하여 유의수준 95%에서 검정하였다. 음성 대조군인 정상 사료급여군, 혼합 종균 배양액 급여군, 혼합 종균 배양액과 살모넬라균 동시 급여군, lincomycin과 살모넬라균 동시 급여군 및 살모넬라 단독 급여군의 실험 4, 7, 10, 20일에서의 살모넬라균의 양을 의미하는 real-time PCR의 Ct값 평균치를 비교하기 위해 one-way ANOVA를 이용하였다.
- 평가를 통하여 최종적으로 선발된 Bacillus균주 3종에 대하여 보다 정확한 동정을 위해 gyrA, rpoB primer (De Clerck et al., 2004)를 사용하여 multi-locus phylogenetic analysis를 하였다. PCR은 95°C에서 1분 initial denaturation을 수행한 뒤, 95°C에서 30초, 53°C에서 30초, 72°C에서 1분 간 총 35 사이클 반복 수행하였다.
이론/모형
- Genetic distance는 Kimura’s two-parameter model을 사용하여 확인하였고, neighbor-joining phylogenetic trees는 MEGA5 (Tamura et al., 2011) 프로그램을 사용하였다.
- 증폭된 DNA fragment sample은 AMPure bead (Beckman Coulter)를 사용하여 정제되었다. 증폭된 DNA fragment sample은 Ion Library Quantitation Kit (Life technologies™)의 제품 사용 설명서에 따라 serially dilution으로 준비되었고 control로 E.
- 최종 선발된 Bacillus 속 3종을 1:1:1 비율로 혼합한 종균을 제조하였고, 제조한 혼합 종균에 대한 효소활성과 항균활성을 평가하고, 보존 후 재생능 검증을 위해 대용량 염기서열 분석법인 next generation sequencing을 사용하여 16S rRNA metagenomics 분석을 실시하였다. DNA library는 Ion 16S™ Metagenomics Kit (Life Technologies)를 사용하여 제품의 사용 설명서에 따라 준비하였다.
성능/효과
- 선발한 Bacillus 균주 3종에 대해 당이용 능(Table 2), 내열성(Table 3), 내산성(Table 4), 및 내담즙성 평가를 실시하였다. 3종인 SHS14, LCB7, LCB10에 대하여 내열성 평가결과, 19%이상의 생존율을 보였으며, 내산성을 평가한 결과, LCB10만이 19.3%의 생존율 보여주었다. 이러한 결과는 B.
- 최종적으로 선발한 Bacillus 3종을 1:1:1 비율로 혼합하여 혼합 종균을 제조하여 항균시험(in vitro) 결과, 단일 3종 및 lincomycin과 비교하여 유사한 활성을 보여주었으며, 송아지를 이용하여 항균활성 시험(in vivo) 을 실시한 결과에서도 lincomycin 투여 대비 90% 수준의 높은 활성을 보여주었다. 개발한 혼합 종균의 안정적 보존을 위해 혼합 종균을 제조하여 다시 증균을 통하여 미생물군집 분석을 통하여 확인한 결과, 초기 군집비율과 증균 후 군집비율이 매우 유사하게 유지되었다. 이로서 본 연구에서는 선발된 Bacillus 균주 3종을 이용하여 제조한 혼합 종균이 사료첨가제용 미생물제재로서 이용 가능함을 최종 확인하였다.
- 1). 그 결과 발효사료용 원료인 당밀, 버섯 분, 대두박과 최종 발효사료로부터 Bacillus 균주의 전형적인 집락 형태를 보이는 세균 136종을 선택하여 16S rRNA 염기서열 분석법에 의해 동정한 결과, Bacillus 속 93종, Paenibacillus 속 14종, 유산균 14종, 기타세균 15종이었다. 유산균은 주로 Lactobacillus 속, Leuconostoc 속, Lactococcus 속이었고, 기타 세균은 Staphylococcus 속, Alicyclobacillus 속, Enterococcus 속, Moraxella 속, Klebsiella 속이었다.
- 45 μl syringe filter로 filtering하여 효소활성과 항균활성을 평가하였다(Table 5). 그 결과 효소활성은 amylase, protease, cellulose, lipase 모두에 대해 단일 종균과 비교해도 유의적 차이가 없도록 우수한 활성을 보였으며, 항균활성은 시중에서 상품으로 사용되는 대표적인 항생제인 lincomycin을 대조구로 하여 E. coli K99와 S. dublin ATCC15480에 대해 평가한 결과, 대조구와 유사한 활성을 보여주었다(Table 5). 최종적으로 제조한 혼합 종균의 보존안정성을 확인하기 위해 혼합 종균을 동결분말상태로 제조 후에 증균 전후의 미생물 군집의 변화를 pyrosequencing 방법으로 확인하였다(Fig.
- 3). 그 결과, 증균 전에는 인위적으로3 종을 1:1:1 (B. sutilis : B. licheniformis : B. amyloliquefaciens) 로 혼합 함으로서 3종의 균주가 거의 동량의 비율(21% : 28% :23%)로 존재하였으나, 증균 후에는 B. subtilis의 비율이 37%로 상승하였고, B. amyloliquefaciens와 B. licheniformis는 각 22%로 약간 감소하였다. 그러나 증균 전후에 Bacillus 균주 3종의 조성비율의 큰 차이점이 없는 것으로 보아, 보존 중에 안정성이 확보됨을 확인하였다.
- licheniformis는 각 22%로 약간 감소하였다. 그러나 증균 전후에 Bacillus 균주 3종의 조성비율의 큰 차이점이 없는 것으로 보아, 보존 중에 안정성이 확보됨을 확인하였다.
- , 2005). 내담즙성 평가 결과는 B. licheniformis SHS14와 B. subtilis LCB7 균주는 24 h 후 OXGALL 1.5%의 농도에서 증식이 활발하였으며, 오히려 B. amyloliquefaciens LCB10 균주는 OXGALL 0.5%의 농도에서 증식이 활발하였다.
- 무처리 대조군(NC)인 group 1과 혼합 종균만 급여한 group 2는 전반적으로 Ct값이 39–40 사이로 살모넬라가 거의 검출되지 않은 반면에 혼합 종균을 급여하면서 살모넬라균을 투여한 group 3은 살모넬라 투여 후 Ct값이 일시적으로 낮아지기는 하나 정상 수준으로 회복하는 결과를 확인할 수 있었다.
- 살모넬라 투여에 대한 혼합 종균의 방어효과를 보여주는 group 3은 기존에 사용하던lincomycin 투여군인 group 4와 비교할 때 전 기간에 걸쳐10% 이내의 차이를 확인할 수 있었으며, 이는 개발된 혼합 종균이 기존 항생제인 lincomycin 대비 하여 90% 이상의 효과를 갖고 있다는 것을 보여주고 있다.
- 동정된 136종에 대하여 효소활성과 항균활성을 평가하여 상대적으로 활성이 우수한 10종을 선발 하였다(Table 1). 선발된 10종 중에서 최종 Bacillus 속 3종을선정하였으며, 선정된 3종에 대해 확인 동정을 16S rRNA 염기서열 분석법 실시한 결과, B. subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens로 동정되었다(Fig. 2)
- 그 결과 발효사료용 원료인 당밀, 버섯 분, 대두박과 최종 발효사료로부터 Bacillus 균주의 전형적인 집락 형태를 보이는 세균 136종을 선택하여 16S rRNA 염기서열 분석법에 의해 동정한 결과, Bacillus 속 93종, Paenibacillus 속 14종, 유산균 14종, 기타세균 15종이었다. 유산균은 주로 Lactobacillus 속, Leuconostoc 속, Lactococcus 속이었고, 기타 세균은 Staphylococcus 속, Alicyclobacillus 속, Enterococcus 속, Moraxella 속, Klebsiella 속이었다. 동정된 136종에 대하여 효소활성과 항균활성을 평가하여 상대적으로 활성이 우수한 10종을 선발 하였다(Table 1).
- 개발한 혼합 종균의 안정적 보존을 위해 혼합 종균을 제조하여 다시 증균을 통하여 미생물군집 분석을 통하여 확인한 결과, 초기 군집비율과 증균 후 군집비율이 매우 유사하게 유지되었다. 이로서 본 연구에서는 선발된 Bacillus 균주 3종을 이용하여 제조한 혼합 종균이 사료첨가제용 미생물제재로서 이용 가능함을 최종 확인하였다.
- amyloliquefaciens LCB10을 우수 균주로 선발하였다. 최종적으로 선발한 Bacillus 3종을 1:1:1 비율로 혼합하여 혼합 종균을 제조하여 항균시험(in vitro) 결과, 단일 3종 및 lincomycin과 비교하여 유사한 활성을 보여주었으며, 송아지를 이용하여 항균활성 시험(in vivo) 을 실시한 결과에서도 lincomycin 투여 대비 90% 수준의 높은 활성을 보여주었다. 개발한 혼합 종균의 안정적 보존을 위해 혼합 종균을 제조하여 다시 증균을 통하여 미생물군집 분석을 통하여 확인한 결과, 초기 군집비율과 증균 후 군집비율이 매우 유사하게 유지되었다.
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