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문제 정의
- 본 연구는 수온의 변화가 해삼의 성장시기에 미치는 체내 스트레스 정도에 관한 연구의 일환으로 온도 스트레스 지표 유전자로 알려진 Hsp90과 ferritin 유전자의 발현 양상의 관찰을 통해 체내에 미치는 스트레스 정도를 조사하고자 한다. 본 연구를 통해 생성된 결과는 해삼양식에 있어서 적정 수온의 범위를 설정하는 데 중요한 기초자료가 되리라 생각된다.
제안 방법
- RT-PCR은 3회 반복 수행하였다. PCR 산물은 ethidiumbromide (100 ng mL-1)가 포함된 2% NuSieve 3:1 (Lonza Co.) 아가로즈겔 전기영동을 통해 확인하였으며 band intensity는 Gel DocTM XR+ System(Bio-Rad)을 이용하여 분석하였다.
- 내재표준유전자 β-actin의 PCR 조건은 pre-denaturation 95°C, 5분; denaturation, annealing, extension 각각 95°C 30초, 55°C 30초, 72°C 30초, 25회; extension 72°C, 10분 수행하였다. RT-PCR은 3회 반복 수행하였다. PCR 산물은 ethidiumbromide (100 ng mL-1)가 포함된 2% NuSieve 3:1 (Lonza Co.
- 침지시킨 조직은 마이크로 튜브에 넣은 후에 실험에 사용하기 전까지 -80°C 초저온냉동고에 보관하였다. Total RNA의 추출은 제조사가 준비하고 제시한 방법에 따라 시행하였다. 추출한 total RNA는 역전사반응(Reverse Transcription: RT)전까지 -80°C 초저온냉동고에 보관하였다.
- cDNA합성을 위한 RT는 1 μg의 total RNA, oligo(dT)18(0.5 μg)와 AccuPower RT premix (Bioneer Co.)를 이용하여 최종 반응용액 20 μL로 42°C에서 1시간 수행하였다.
- 각 유전자의 RT-PCR 조건은 Hsp90 및 ferritin의 경우 predenaturation 95°C, 5분; denaturation, annealing, extension 각각 95°C 30초, 60°C 30초, 72°C 30초에서 28회; extension 72°C, 10분 수행하였다.
- 내재표준유전자 β-actin의 PCR 조건은 pre-denaturation 95°C, 5분; denaturation, annealing, extension 각각 95°C 30초, 55°C 30초, 72°C 30초, 25회; extension 72°C, 10분 수행하였다.
- 사육을 위한 해수로는 멸균해수를 사용하였으며 사육용기로는 2 L 유리소재 비이커를 사용하였다. 사육조건에 따라 온도가 설정된 다연실배양기 (multi incubator)에 온도조건에 따라 사육용기를 3회 반복 실험수행과 동일시 시키기 위해서 각각 3개씩 설치하여 멸균해수의 수온을 맞춘 후 각각의 실험군 사육용기에 20마리의 치삼을 수용하여 사육하였다. 단기간인 2일간 즉 48시간 사육의 실험조건을 두었기에 사육용기에 해삼의 서식처를 위한 별도의 기질은 마련하지 않았다.
- 수온에 따른 사육 조건은 15°C, 20°C, 25°C 및 30°C로 설정하였으며 한국농수산대학교 사육실에서 48시간 사육하였다.
- 중합효소연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction: PCR)은 RT를 통해 얻은 20 μL의 cDNA 중에서 cDNA 1 μL와 각각의 유전자 primer인 Hsp90 (Accession No: HQ689677.1, product size: 84 bp) forward (5ʹ-TGGTGTTGGCTTTTACTCTGCTT-3ʹ), reverse (5ʹ-CACCTGTAGCATTCGTCATCGT-3ʹ), Ferritin (Accession No: JF796141.1, product size: 135 bp) forward (5ʹ-CGATGATGTCGCCCTTCC-3ʹ), reverse (5ʹ-AGCCGTGATGTCCTTGAGC-3ʹ), 내재표준유전자로 사용한 β-actin (Accession No: EU668024.1, product size: 157 bp) primer forward (5ʹ-ACAGAGGCTCCATTCAACCC-3ʹ), reverse (5ʹ-CGTCTCCTGAGTCCATGACG-3ʹ) 및 AccuPower HotStart PCR premix (Bioneer Co.)를 이용하여 최종 반응용액 20 μL로 시행하였다.
- 치삼을 수온 15°C에서 48시간 사육한 후에 시간의 경과에 따른 Hsp90 유전자 발현 양상을 살펴보았다.
- 하면이라는 독특한 생활주기를 가지고 있는 해삼에서 수온이 해삼에게 미치는 스트레스 정도를 스트레스관련 단백질인 Hsp90 및 ferritin mRNA 유전자 발현을 통해 살펴보았다.
대상 데이터
- )시약 용액을 이용하여 추출하였다. Total RNA의 추출을 위해 사용한 조직은 치삼의 중앙부 몸통조직으로 내장 부분을 제거시킨 0.5 g 정도의 몸통 조직을 수집하여 사용하였다. 몸통조직은 식염수로 깨끗하게 세척 및 식염수를 제거한 다음, 액체질소에 침지시켰다.
- 대조군인 0시간의 실험개체는 각각의 실험군 온도에 노출시킨 후 즉시 사육용기에서 각각 2개체씩 총 6개체를 수집한 것을 대조군으로 사용하였다.
- 본 연구는 국립수산과학원 10대 전략품종(해삼) 육상양식 기술개발의 일환으로 수행되었다. 과제 추진에 많은 도움을 준 생물모니터링센터의 허준욱 박사님께 이 지면을 통해 감사 말씀을 드립니다.
- 실험 기간 중 해수의 교환 및 먹이의 공급은 없었다. 사육중인 치삼은 0, 3, 6, 12, 24, 48시간 간격으로 각각의 실험군에 위치한 3개의 사육용기에서 각각 3개체씩을 수집하여 실험에 사용하였다. 대조군인 0시간의 실험개체는 각각의 실험군 온도에 노출시킨 후 즉시 사육용기에서 각각 2개체씩 총 6개체를 수집한 것을 대조군으로 사용하였다.
- 실험에 사용한 해삼은 중량 약 1.4 g 정도의 치삼으로 국립한국농수산대학교 생물사육장에서 사육한 생물이다. 수온에 따른 사육 조건은 15°C, 20°C, 25°C 및 30°C로 설정하였으며 한국농수산대학교 사육실에서 48시간 사육하였다.
데이터처리
- 대조군과 실험군과의 유의성 검정은 Student’s t-test로 비교하였으며, p가 0.05 이하인 것만 유의한 것으로 판단하였다.
성능/효과
- 25°C 수온에서 사육한 치삼들에서 Hsp90 유전자 발현은 대조군 비교 3시간 경과째부터 유의적으로 증가하기 시작하여 6시간 경과째 가장 높은 발현 양상을 나타내다가 12시간 경과째부터 48시간째까지 유의적으로 감소하였다(Fig. 3).
- 6). Ferritin 유전자는 Hsp90과 마찬가지로 사육온도가 높을수록 빠른 시간의 경과째에 유의적인 발현의 증가가 나타났다(Figs. 5, 6). Zhang et al.
- 이는 ferritin에 비해 Hsp90이 동일 사육수온에서 보다 빠른 시간의 경과에 유의적인 발현의 증가가 나타나는 것으로 보아 알 수 있다. Hsp90 및 ferritin mRNA 유전자들의 발현 양상을 통해본 해삼의 최적 사육수온은 15°C 정도가 스트레스 없이 적정한 것으로 생각되며 Hsp90 및 ferritin 유전자는 해삼의 적정 사육조건을 판단할 수 있는 생체지표유전자(biomarker gene)로 활용이 가능하다고 생각된다.
- 수온 20°C에서 48시간 사육한 치삼에서 Hsp90 유전자 발현은 대조군에 비하여 6시간 경과째부터 발현이 유의적으로 증가하기 시작하여, 12시간 경과째 가장 높은 발현 양상을 나타냈다. 그리고 24시간째부터 48시간째까지 발현이 유의적으로 감소하였다(Fig. 2).
- 본 연구결과 및 이전 연구결과를 바탕으로 Hsp90과 ferritin mRNA 유전자 발현을 비교한 결과 동일 사육수온에서 Hsp90이 ferritin에 비해 온도 스트레스에 대한 반응이 보다 민감한 것으로 나타났다. 이는 ferritin에 비해 Hsp90이 동일 사육수온에서 보다 빠른 시간의 경과에 유의적인 발현의 증가가 나타나는 것으로 보아 알 수 있다.
- 본 연구결과를 척추동물인 어류의 연구결과 및 일부 해삼에서의 연구결과를 통해 고찰해 보면 Hsp90은 온도 스트레스에 반응하는 단백질이며, Hsp90을 이용한 연구결과를 통해 살펴보면 해삼이 온도 스트레스를 받지 않고 생활할 수 있는 최적의 수온은 15°C 정도로 생각된다.
- 본 연구에서 20°C의 경우 Hsp90 유전자 발현은 6시간 경과째부터 유의적으로 증가하여 12시간째 최고의 발현을 나타낸 후 감소하기 시작하였으며(Fig. 2), 사육수온 25°C의 경우는 3시간 경과째부터 유의적으로 증가하여 6시간 경과째 최고의 발현을 나타낸 후 감소하기 시작하였다(Fig. 3).
- 사육수온 20°C에서 48시간 사육한 치삼들을 대상으로 ferritin 유전자 발현 양상을 살펴본 결과 ferritin의 발현은 대조군에 비하여 48시간 경과째부터 유의적인 증가가 나타나기 시작하였다(Fig. 5).
- 수온 20°C에서 48시간 사육한 치삼에서 Hsp90 유전자 발현은 대조군에 비하여 6시간 경과째부터 발현이 유의적으로 증가하기 시작하여, 12시간 경과째 가장 높은 발현 양상을 나타냈다.
- 연구결과 15°C 사육수온에 노출한 치삼들에서의 Hsp90 유전자 발현은 유의적 차이가 나타나지 않았다(Fig. 1).
- 이 연구 결과에서 보듯이 30°C 이상의 수온은 해삼의 사육에 적합하지 않으며, 적합 수온은 15~16°C 정도임을 알 수 있다.
- 본 연구결과를 척추동물인 어류의 연구결과 및 일부 해삼에서의 연구결과를 통해 고찰해 보면 Hsp90은 온도 스트레스에 반응하는 단백질이며, Hsp90을 이용한 연구결과를 통해 살펴보면 해삼이 온도 스트레스를 받지 않고 생활할 수 있는 최적의 수온은 15°C 정도로 생각된다. 이 연구결과는 해삼의 성장 및 산란을 위한 생태계내의 활동기의 온도와 근접한 것으로 스트레스 관련 유전자인 Hsp90 유전자 발현 양상을 통해 증명한 것으로 판단된다.
- 치삼을 15°C 수온에서 48시간 사육한 후에 시간의 경과에 따라 ferritin 유전자 발현 양상을 살펴본 결과, 15°C 사육 수온에서 사육한 치삼에서 ferritin 유전자 발현은 유의적인 차이가 나타나지 않았다(Fig. 4).
후속연구
- 본 연구는 수온의 변화가 해삼의 성장시기에 미치는 체내 스트레스 정도에 관한 연구의 일환으로 온도 스트레스 지표 유전자로 알려진 Hsp90과 ferritin 유전자의 발현 양상의 관찰을 통해 체내에 미치는 스트레스 정도를 조사하고자 한다. 본 연구를 통해 생성된 결과는 해삼양식에 있어서 적정 수온의 범위를 설정하는 데 중요한 기초자료가 되리라 생각된다.
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