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문제 정의
- 오령지 MeOH추출물을 극성에 따라 여러 분획으로 나눈후 각각의 분획에 대해 TLC를 실시한 결과, 기존의 문헌과는 다소 상이하게 n-hexane분획에서 다양한 화합물이 분포 하는 것으로 밝혀졌다. 이에 본 연구에서는 오령지 추출물의 저극성 분획을 대상으로 화학적 연구를 실시하여 13종의 화합물들을 분리하여 보고하고자 한다.
제안 방법
- 1(6.7 g)에 대하여 n-hexane/methylene chloride 혼합용매로 기울기 용리(30:1→5:1, v/v)시켜 silica gel column chromatography를 한 번 더 수행하여 화합물 2(20 mg), 화합물 5(15 mg), 화합물 10(45 mg), 화합물 11(12 mg)을 분리하였다.
- 2-6을 acetone/MeOH/H2O 혼합용매로 기울기 용리(2:2:1→5:5:1, v/v)시켜 RP-18 레진으로 reverse open column chromatography을 진행하였다.
- 기기 및 시약 − TLC(Thin layer chromatography)의 결과 확인은 UV detector(Vilber lourmat, France)을 이용한 254 nm와 365 nm 파장에서 관찰하였고 발색을 병행하여 확인하였다.
- 기기 및 시약 − TLC(Thin layer chromatography)의 결과 확인은 UV detector(Vilber lourmat, France)을 이용한 254 nm와 365 nm 파장에서 관찰하였고 발색을 병행하여 확인하였다. 단일 화합물의 구조를 규명하기 위해 이용한 NMR(Nuclear magnetic resonance) spectrum은 Varian VNS 600 spectrometer(1 H: 600 MHz, 13C: 150 MHz)와 Varian VNS 300 spectrometer(1 H: 300 MHz, 13C: 75 MHz) 그리고 Bruker DPX 300 spectrometer(1 H: 300 MHz, 13C:75 MHz)를 사용하여 측정하였고, NMR chemical shift value는 part per million(ppm)단위로 나타내었다. 선광도 측정을 위해서는 JASCO DIP-1000을 사용하였고, Mass spectrometer로는 Expression CMS(ADVION) 및 Jeol JMS600을 사용하였다.
- 분리 및 정제 − MeOH 추출물을 분획하여 얻은 n-hexane 분획층에 대하여 n-hexane/EtOAc 혼합용매로 기울기 용리 (35:1→2:1, v/v)시켜 silica gel open column chromatography 를 실시하여 총 8개의 분획을 얻었다(Fr. 1~Fr. 8).
- 오령지 MeOH 추출물의 n-hexane 분획으로부터 open column chromatography, preparative TLC, 재결정 등의 방법으로 총 13종의 화합물을 분리하였다(Fig. 1).
- 4 kg을 MeOH로 3회 환류추출하여, 감압농축기로 용매를 제거하여 MeOH 추출물(110 g)을 얻었다. 이를 증류수에 현탁시켜 동량의 n-hexane을 가하여 n-hexane 층과 수층을 분획하는 과정을 3회 반복하였고, 분획물을 감압 농축하여 41g의 n-hexane 층을 얻었다.
- 이상의 spectral data를 문헌과 비교하여 이 화합물을 5βstigmastan-3β-ol으로 동정하였다.
대상 데이터
- H2SO4를 사용하였다. Column chromatography용 고정상은 Kiesel gel 60(70-230 mesh, Merck Art. 7734)와 Sephadex LH-20(GE Healthcare, Sweden)를 사용하였다. Column chromatography용 유기용매는 시약용 1급(OCI company Ltd.
- 5715)을 사용하였고 결과 확인을 위해 발색시약으로 20% aq. H2SO4를 사용하였다. Column chromatography용 고정상은 Kiesel gel 60(70-230 mesh, Merck Art.
- )을 사용하였다. NMR 측정을 위해 사용한 용매는 CDCl3(Cambridge Isotope Laboratories, Inc.)이다.
- 단일 화합물의 구조를 규명하기 위해 이용한 NMR(Nuclear magnetic resonance) spectrum은 Varian VNS 600 spectrometer(1 H: 600 MHz, 13C: 150 MHz)와 Varian VNS 300 spectrometer(1 H: 300 MHz, 13C: 75 MHz) 그리고 Bruker DPX 300 spectrometer(1 H: 300 MHz, 13C:75 MHz)를 사용하여 측정하였고, NMR chemical shift value는 part per million(ppm)단위로 나타내었다. 선광도 측정을 위해서는 JASCO DIP-1000을 사용하였고, Mass spectrometer로는 Expression CMS(ADVION) 및 Jeol JMS600을 사용하였다. TLC plate는 Kiesel gel 60 F254 (precoated, Merck Art.
- 실험재료 − 본 실험에 사용된 오령지는 2014년 3월 대구시 약령시장에서 구입하여 사용하였으며, 표본은 영남대학교 생명공학부 천연물화학 연구실에 보관 중이다.
- 오령지 추출물의 n-hexane 분획으로부터 총 13종의 화합물들을 분리하였다. 분리된 화합물들은 spectral data를 바탕으로 각각 lupeol(1), lupenone(2), simiarenol(3), epitaraxerol (4), taraxerone(5), fatty acid esters of 11-oxo-β-amyrin(6), 12-oleane-3,11-dione(7), 5β-stigmastan-3α-ol(8), 5β-stigmastan-3β-ol(9), 5α-stigmastan-3-one(10), 5β-stigmastan-3-one (11), 5β-cholestan-3α-ol(12) 및 2-methoxyphenanthrene(13) 로 동정하였다.
성능/효과
- 13C-NMR spectrum에서 δ 217.4 및 199.7에서 두 개의 ketone carbon을 확인하였고, δ 171.3 및 128.2에서 나타난 olefinic group은 carbonyl group과 conjugation하고 있음을 추정할 수 있었다.
- 55에서 각각 singlet으로 나타나는 두 개의 olefinic proton을 확인하여 이 화합물이 isopropenyl group 을 함유하고 있는 lupane계열의 triterpenoid임을 추정할 수있었다. 13C-NMR spectrum에서 총 30개의 탄소를 확인하여 triterpene임을 확인하였다. δ 28.
- 13C-NMR spectrum에서 총 30개의 탄소를 확인하였고, 특히 δ 150.9 및 109.3에서 5번, 6번 위치의 olefinic carbons을 확인할 수 있었다.
- 8에서 ketone기가 나타났다는 점이다. MS에서도 화합물4에 비해서 m/z 2가 부족한 화합물임을 확인하여, 화합물 5는 화합물4의 hydroxyl기가 산화된 형태인 taraxerone임을 추정할 수 있었고, 문헌의 data 와 비교하여 이를 확인할 수 있었다.17)
- 18) 이 화합물의 1 HNMR spectrum에서 어떤 olefinic signal도 확인할 수 없었으므로, 결합하고 있는 지방산은 포화지방산임을 추정할 수있었고, 지방산의 종류는 이 화합물의 (+)-FABMS를 해석 하여 결정할 수 있었다. m/z 679에서 [M+H]+ 에 해당하는 peak이 가장 크게 나타나 이 화합물에는 palmitic acid가 가장 많이 acylation되어 있음을 확인할 수 있었다.
- 2에서 나타난 olefinic group은 carbonyl group과 conjugation하고 있음을 추정할 수 있었다. 따라서 이 화합물은 oleanane 골격에 3번과 11번이 oxidation되어 있고, 11,12위치에 olefinic group이 conjugatin되어 있는 12- oleane-3,11-dione 임을 추정할 수 있었고, 이는 문헌의 spectral data를 비교함으로써 확인할 수 있었다.19)
- 그리고 본 연구에서 분리된 2-methoxyphenanthrene 은 천연에서는 처음으로 분리보고되는 화합물이다. 따라서본 연구에서 분리된 13종의 화합물 모두 오령지에서는 처음으로 분리보고되는 물질들이다.
- 오령지에서 분리된 triterpene화합물들은 대부분이 ursane 형태인 것으로 보고되어 있는 반면,5,6) 본 연구에서 분리된 triterpene은 oleane, lupane, hopane 및 taraxerane 으로 기존의 연구결과와는 차이를 보였다. 본 연구에서 분리된 steroid계열의 화합물들도 오령지에서는 처음으로 분리되었다. 그리고 본 연구에서 분리된 2-methoxyphenanthrene 은 천연에서는 처음으로 분리보고되는 화합물이다.
- 분리된 화합물들은 spectral data를 바탕으로 각각 lupeol(1), lupenone(2), simiarenol(3), epitaraxerol (4), taraxerone(5), fatty acid esters of 11-oxo-β-amyrin(6), 12-oleane-3,11-dione(7), 5β-stigmastan-3α-ol(8), 5β-stigmastan-3β-ol(9), 5α-stigmastan-3-one(10), 5β-stigmastan-3-one (11), 5β-cholestan-3α-ol(12) 및 2-methoxyphenanthrene(13) 로 동정하였다. 분리된 화합물들이 알려진 구조의 화합물이라 할지라도, 본 연구에서 분리된 13종의 화합물 모두 오령지에서는 처음으로 분리보고되는 바이다. 본 연구결과가 기존의 연구와 차이를 나타내는 것은 오령지가 식물이 아닌 날다람쥐의 분변을 말린 것이므로, 날다람쥐의 먹이에 따른 차이가 분포하는 화합물에 반영된 것으로 사료된다.
- 오령지 MeOH추출물을 극성에 따라 여러 분획으로 나눈후 각각의 분획에 대해 TLC를 실시한 결과, 기존의 문헌과는 다소 상이하게 n-hexane분획에서 다양한 화합물이 분포 하는 것으로 밝혀졌다. 이에 본 연구에서는 오령지 추출물의 저극성 분획을 대상으로 화학적 연구를 실시하여 13종의 화합물들을 분리하여 보고하고자 한다.
- 이 data를 문헌치와 비교함으로써 화합물 9를 5β-stigmastan-3β-ol으로 동정할 수 있었다.
- 이 연구에서 오령지 추출물의 저극성 분획으로부터 13종의 화합물, 즉 2종의 lupane 형태의 triterpenes(화합물 1과 2), 1종의 hopane 형태의 triterpene(화합물 3), 2종의 taraxerane 형태의 triterpenes(화합물 4와 5), 2종의 oleanane 형태의 triterpenes(화합물 6와 7), 4종의 stigmastane 형태의 steroids(화합물 8, 9, 10 및 11), 1종의 cholestane 형태의 steroid(화합물 12) 및 1종의 phenanthrene계 화합물(13)이 분리되었다. 오령지에서 분리된 triterpene화합물들은 대부분이 ursane 형태인 것으로 보고되어 있는 반면,5,6) 본 연구에서 분리된 triterpene은 oleane, lupane, hopane 및 taraxerane 으로 기존의 연구결과와는 차이를 보였다.
- 이 화합물을 기존의 문헌과 비교하여 fatty acid esters of 11-oxo-β-amyrin로 동정할 수 있었다.
- 2 Hz)으로 나타나는 하나의 methyl기를 확인하여 이 화합물은 triterpene이 아닌 steroid 계열임을 추정할 수 있었다. 이 화합물의 13C-NMR spectrum 에서 전부 29개의 carbon signal을 확인하여 이 화합물이 stigmastane 계열의 steroid 화합물임을 확인할 수 있었다. 특히 9번 탄소가 δ 40.
- 이 화합물의 13C-NMR spectrum에서 δ 158.2 및 116.7에서 taraxerane골격의 특징적인 14번, 15번 olefinic carbon 을 확인하여 이 화합물이 taraxerol임을 추정할 수 있었다.
- 5에서 하나의 methoxy기가 확인되었다. 이 화합물의 aromatic carbon signal의 개수 및 proton signal들의 coupling pattern을 통해 benzene ring 세 개가 서로 fusion 되어 있는 형태임을 예상 하였고, proton signal들의 coupling constants 및 1 H-1 H COSY spectrum을 통하여 ABX, AB 및 ABCD proton system을 가지는 benzene ring 세 개가 서로 fusion되어 있는 phenanthrene 계 화합물임을 추정할 수 있었다. δH 3.
- 이로써 3번 위치에 hydroxyl 기의 configuration 이 다른 형태임을 추정할 수 있었고, hydroxyl기에 대해 δ위치에 있는 1번 및 5번 탄소의 chemical shift가 크게 다른 것으로써 이 사실을 확인할 수 있었다.
- 5에서 ketone기가 나타났다는 점이다. 이로써 이 화합물은 화합물 1이 산화된 형태라는 것을 추정할 수 있었고, spectral data 를 기존의 문헌과 비교하여 lupenone임을 확인할 수 있었다.14)
- 이상의 data를 문헌과 비교하여 이 화합물을 5β-cholestan-3α-ol으로 동정할 수 있었다.
- 이상의 data를 문헌과 비교하여 이 화합물을 5β-stigmastan-3-one으로 동정할 수 있었다.
- 이상의 data를 문헌과 비교하여 이 화합물을 5βstigmastan-3-one으로 동정할 수 있었다.
- 2에서 나타나는 것으로써이 화합물의 3위의 hydroxyl 기는 α configuration을 가지고 있는, 즉 taraxerol의 epimer형태임을 추정할 수 있었다. 이상의 spectral data를 문헌과 비교하여 이 화합물이 epitaraxerol임을 확인할 수 있었다.16)
- 3에서 isopropenyl 기의 olefinic carbons을 확인할 수 있었다. 이상의 데이터를 문헌과 비교하여 이 화합물이 lupane계의 triterpenoid인 lupeol임을 확인할 수 있었다.13)
- 3에서 5번, 6번 위치의 olefinic carbons을 확인할 수 있었다. 이상의 데이터를 문헌과 비교하여 이 화합물이 simiarenol임을 확인할 수 있었다.15)
- 화합물 12의 1 H-NMR spectrum에서 δ 0.90 및 0.62에서두 개의 angular methyl기를, δ 0.88, 0.85 및 0.84에서 각각 doublet(J=6.7 Hz)으로 나타나는 세 개의 secondary methyl 기를 확인하였고, 13C-NMR spectrum에서 전부 27개의 carbon signal을 확인하여 이 화합물이 cholestane 계열의 steroid 화합물임을 추정할 수 있었다.
- 화합물 1의 1 H-NMR spectrum에서 δ 1.02, 0.95, 0.93, 0.82, 0.76 및 0.75에서 6개의 angular methyl기를 확인하여이 화합물이 triterpene계 화합물임을 추정할 수 있었다.
- 화합물 3의 1 H-NMR spectrum에서 δ 1.11, 1.02, 0.97, 0.89, 0.86 및 0.75 에서 singlet으로 나타나는 6개의 angular methyl기를 확인하였고, δ 0.85 및 0.80에서 doublet으로 나타나는 두 개의 secondary methyl기를 확인하여, 이 화합물이 isopropyl기를 함유하고 있는 hopane계 triterpene임을 추정할 수 있었다.
- 화합물 4의 1 H-NMR spectrum에서 δ 1.23, 1.07, 0.93, 0.92, 0.91, 0.89, 0.84 및 0.80에서 8개의 angular methyl기를 확인할 수 있었고, 특히 δ 5.55에서 olefinic proton을, δ3.38에서 3번 위치의 oxymethine proton을 확인할 수 있었다.
- 화합물 7의 1 H-NMR spectrum에서 δ 1.34, 1.24, 1.15, 1.08, 1.04, 0.88, 0.87 및 0.85에서 8개의 angular methyl기를 확인할 수 있었고, 특히 δ 5.60에서 singlet 으로 나타나는 하나의 olefinic proton을 확인할 수 있었다.
- 화합물 8의 1 H-NMR spectrum에서 δ 0.89 및 0.62에서두 개의 angular methyl기를, δ 0.87, 0.81 및 0.78 각각 doublet(J=7.8 Hz)으로 나타나는 세 개의 secondary methyl 기를, δ 0.83에서 triplet(J=7.2 Hz)으로 나타나는 하나의 methyl기를 확인하여 이 화합물은 triterpene이 아닌 steroid 계열임을 추정할 수 있었다.
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