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문제 정의
- 이는 세포모델에서 BACE의 단백질 발현 또는 stability를 감소시켜 효소활성을 조절하는 것으로 생각된다. 더불어 in vitro에서 BACE 및 AChE에 대한 저해활성을 나타내었기에 그 결과를 보고하고자 한다.
- 본 연구에서는 Aβ의 분비를 감소시키는 약물을 선발하기 위해 국내 자생식물의 추출물을 Aβ를 과량 발현하는 알츠하이머 질환의 신경세포 모델(APP 변이유전자 APPswe 발현세포주)에서 그 효능을 스크리닝한 결과, 모과 과육의 에탄올 추출물이 α-secretase의 활성을 증가시킴과 동시에 Aβ의 분비를 감소시켰다.
제안 방법
- − APPswe 세포주로부터 분비되는 Aβ의 양을 측정하기 위해 sandwich ELISA를18) 실시하였다.
- − BACE에 대한 저해활성은 BACE-1 FRET(fluorescence resonance energy transfer) 분석 키트(PanVera Co, Madison, WI)를 사용하여 측정하였다.
- − EZ-CYTOX 키트를 사용하여 CSE의 APPswe 세포주에 대한 세포독성을 측정하였다.
- − sAPPα의 현저한 증가는 BACE 의 활성감소를 예상할 수 있기 때문에 in vitro에서의 BACE 의 활성을 측정하기 위해 BACE-1 FRET 분석을 실시하였다.
- 1×106 세포를 60 mm dish에서 배양하여 serumfree DMEM으로 교환하고 16 시간이 경과한 후 DMSO에 용해시킨 CSE 5, 50 μg/ml 또는 양성대조군인 β-secretase inhibitor III19) 10 µM을 처리하였다.
- 20) 1×106 세포를 60 mm dish에서 배양하여 24시간 후에 DMSO 또는 CSE 1, 5, 50 μg/ml을 처리하였다.
- 5% Tris-tricine SDS-PAGE로 분리한후, immunoblotting에 의해 APP, sAPPα, APP carboxy terminal fragment α(CTF-α) 등의 단백질 양상을 Azure C600(Azure Biosystems, Dublin, CA)을 이용하여 분석하였다. 3회 반복 실험에 의해 얻어진 단백질 밴드를 AzureSpot software(Azure Biosystems, Dublin, CA)에 의해 정량하였으며 actin 밴드를 기준으로 보정하였다.
- 5×103 세포를 96 well plate에서 배양하여 DMSO에 용해시킨 CSE를 1, 5, 10, 50 μg/ml 농도로 24시간 처리하였다.
- Water-soluble tetrazolium 용액 10 μl를 첨가하여 1시간 배양한 후, 450 nm 에서 Model 680 Microplate Reader(Bio-Rad, Hercules, CA)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
- 단백질 50 μg을 7%, 10% Tris-glycine 또는 16.5% Tris-tricine SDS-PAGE로 분리한후, immunoblotting에 의해 APP, sAPPα, APP carboxy terminal fragment α(CTF-α) 등의 단백질 양상을 Azure C600(Azure Biosystems, Dublin, CA)을 이용하여 분석하였다.
- 대조약물로는 1 μM tacrine 혹은 10 μM galantamine을 사용하고, AChE 효소활성은 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도를 100%로 하여 Model 680 Microplate Reader(Bio-Rad, Hercules, CA)를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 이 때 양성대조군은 β-secretase inhibitor III(β-SI) 10 μM을 사용하였으며, 각 시료에 대한 BACE-1 저해활성을 3회 반복하여 분석한후 통계 처리하였다.
- 즉, 음성 대조 군(C)인 DMSO를 처리한 시료의 Aβ의 분비량을 100%로 하여 CSE를 처리한 경우의 분비량을 백분율로 표시하였다.
대상 데이터
- − APP swedish 유전자가 과잉 발현되는 생쥐유래 신경세포주인 Neuro2a(APPswe)를 동경대학의 Iwatsubo 교수로부터 제공받아 5% FBS(Gibco, Grand Island, NY), Lglutamic acid, penicillin/streptomycin, hygromycin이 함유된 Dulbecco's Modified Eagel's Medium(Gibco, Grand Island, NY)과 OPTI MEM(Gibco, Grand Island, NY)의 혼합 배지에서 37℃, 5% CO2의 조건으로 배양하였다.
- − 모과(Chaenomelis Fructus) 과육의 EtOH 추출물(이하 CSE로 略함)은 한국 추출물은행으로부터 구입하여 일정량의 DMSO에 용해하여 사용하였다.
데이터처리
- − 각 실험군(n=3) 간의 유의성 검정은 one-way ANOVA(Prism5) 프로그램으로 하였으며, P값이 0.05, 0.01및 0.001 이하를 기준으로 유의성 여부를 판정하였다.
- 대조약물로는 1 μM tacrine 혹은 10 μM galantamine을 사용하고, AChE 효소활성은 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도를 100%로 하여 Model 680 Microplate Reader(Bio-Rad, Hercules, CA)를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료에 대한 AChE 저해활성을 3회 반복하여 분석한 후 통계 처리하였다.
이론/모형
- − APPswe 세포주에 CSE 를 처리한 후 배양액으로 분비된 Aβ의 양을 sandwich ELISA 방법으로 측정하여 비교 정량하였다.
- − Acetylcholinesterase(AChE)에 대한 저해 활성은 Acetylcholinesterase Activity Colorimetric assay 키트(BioVision, Milpitas, CA)를 사용하여 측정하였다.
- − 단백질 분석은 Western blotting 방법에 의해 수행하였다.
- − 위에서 확인한 CSE에 의한 Aβ 분비 감소효과의 메커니즘을 규명하기 위해 CSE를 처리한 APPswe 세포주로부터 lysate를 회수하여 Western blotting에 의해 APP, sAPPα, BACE, CTF-α의단백질 양상을 분석한 결과를 Fig. 3에 나타내었다.
- The AChE inhibitory activity of CSE. AChE inhibitory activity was assessed using an Acetylcholinesterase Aactivity Colorimetric assay (BioVision). 30 µl of CS extracts were added into 96-well plate at concentration of 1, 5, 10, 50 µg/ml.
성능/효과
- − 현재 임상에서 사용하고 있는 치매 개선제의 표적 중의 하나인 AChE에 대한 저해활성을 분석한 결과, CSE 50 μg/ml의 농도에서 15.72±0.2%의 저해활성을 나타내었으며, 이 활성은 양성대조군으로 사용한 tacrine 1 µM, galantamine 10 µM 농도에서 각각 18.14±0.5, 16.96±0.2%로 비슷한 결과를 얻었다(Fig. 6)
- 고령화와 더불어 치매환자 수도 급속히 증가하고 있어 개인의 삶의 질을 저하시킬 뿐만 아니라 과다한 의료비 지출로 인한 커다란 사회·국가적 문제로까지 대두되고 있다.1) 알츠하이머 질환은 치매의 가장 주요한 발병 요인으로서 familial type과 sporadic type으로 분류되며, 전체 질환의 90% 이상이 주로 65세 이상의 노인에게 나타나는 sporadic type이다.2) Familial type은 amyloid precursor protein(APP), presenilin 1(PS1), presenilin 2(PS2) 유전자의 돌연변이가 병인으로 알려져 있으며,3) sporadic type의 경우는 그 원인이 노화 및 ApoE4 대립형질의 다양성이 병인으로 보고되었다.
- 31)본 실험에 사용한 APPswe 세포주는 치매환자의 병리와 유사하게 Aβ42의 분비량이 정상세포에 비해 2배 이상 증가되어 있어 분비저해 활성을 검색하기에 용이하다.
- 7) 알츠하이머 질환 치료제 개발을 위한 표적 중 하나인 γ-secretase는 presenilin(PS), nicastrin(NCT)과 anteria pharynx defective gene의 단백질 산물인 APH-1, presenilin enhancer gene의 단백질 산물인 PEN-2 등으로 이루어진 complex로서 활성을 나타낸다.
- CSE 50 μg/ml 처리 시 APP와 CTF-α는 세포내 분획에 다량으로 축적되나, BACE의 단백질 발현은 현저히 감소하였다.
- CSE 처리 세포주의 배양액으로부터 sAPPα 단백질 양상을 분석한결과, CSE 5, 50 μg/ml로 처리한 경우 DMSO 처리군(C)에 비해 각각 1.15, 2.36 배로 농도 의존적으로 현저히 증가하였다(Fig. 4).
- 결과에 기술한 바와 같이, CSE는 Aβ40 및 Aβ42의 분비량을 농도 의존적으로 감소시켰다.
- 그 결과, CSE 1, 5, 50 μg/ml 처리는 농도 의존적으로 BACE-1 활성을 저해하여 DMSO 처리군(C)에 비해 각각 12.7±5.2, 32.8±6.9, 75.3±8.1%의 효소저해활성을 나타냈다.
- 또한 CSE는 sAPPα의 분비량을 현저하게 증가시켰으며 이는 α-secretase의 활성이 증가했음을 의미하는 것으로 동시에 APP와 경쟁적으로 작용하는 BACE의 활성은 감소되었음을 간접적으로 시사한다.
- 실제본 연구의 결과에서도 sAPPα와 BACE의 단백질 발현은 서로 상반되는 양상을 나타내었으며, 이는 CSE가 BACE 단백질 발현량 또는 stability를 감소시킬 것으로 추정되며, 동시에 APP에 경쟁적으로 작용하는 α-secretase의 활성을 증가시켜 sAPPα의 분비가 증가된 것으로 생각된다.
- 양성 대조군인 β-SI가 두 종의 Aβ에 대해 동일한 정도의 분비저해활성을 나타낸데 반면, CSE는 Aβ42 보다는 Aβ40에 대한 저해 활성이 더 크게 나타났다.
- 실제본 연구의 결과에서도 sAPPα와 BACE의 단백질 발현은 서로 상반되는 양상을 나타내었으며, 이는 CSE가 BACE 단백질 발현량 또는 stability를 감소시킬 것으로 추정되며, 동시에 APP에 경쟁적으로 작용하는 α-secretase의 활성을 증가시켜 sAPPα의 분비가 증가된 것으로 생각된다. 이 결과를 뒷받침 하듯이 CSE는 in vitro에서 BACE-1의 효소활성을 농도 의존적으로 저해하였으며, CSE는 기질과 상호작용 하여 효소활성을 조절하는 것으로 사료된다.
- 한편, CSE의 APPswe 세포주에 대한 독성분석을 실시한 결과, 1, 5, 10, 50 μg/ml 처리 세포의 생존력은 대조군의 세포 생존력과 비교하여 각각 99.12±1.1, 99.06±1.2, 98.94±2.2, 90.48±1.2%을 나타내었다(Fig. 2).
- 이는 CSE 가 sAPPα의 분비를 증가시킴으로써 BACE를 저해할 가능성을 뒷받침한다. 한편, 본 연구를 통해 모과의 치매에 대한 약리활성의 표적이 BACE 및 AChE, 두 가지에 모두 유효한 활성을 나타낸다는 것을 알았다. 이상의 결과를 종합해보면, CSE를 치매 치료제 개발을 위한 BACE 및 AChE 저해 후보약물로 응용할 수 있다고 사료된다.
후속연구
- 또한 in vitro에서 BACE-1를 5 μg/ml의 농도에서, AChE를 50 μg/ ml의 농도에서 각각의 양성대조군인 β-SI 10 µM, tacrine 1 µM과 galantamine 10 µM과 비교하였을 때 동등한 활성을 보였다. 이러한 결과를 종합해보면 모과는 BACE 및 AChE를 표적으로 하는 치매 치료제 개발을 위한 후보자원으로서 개발가치가 있을 것으로 사료된다.
- 한편, 본 연구를 통해 모과의 치매에 대한 약리활성의 표적이 BACE 및 AChE, 두 가지에 모두 유효한 활성을 나타낸다는 것을 알았다. 이상의 결과를 종합해보면, CSE를 치매 치료제 개발을 위한 BACE 및 AChE 저해 후보약물로 응용할 수 있다고 사료된다. 향후 모과에 의한 Aβ 분비저해활성의 기전을 명확히 규명하기 위해서는 면역형광염색법에 의해 APP 및 관련 분자의 세포내 분포를 확인하여 모과의 약리활성 성분과의 상호작용 여부와 αsecretase 및 γ-secretase의 in vitro 효소활성도 측정해야 할 것이다.
- 향후 모과에 의한 Aβ 분비저해활성의 기전을 명확히 규명하기 위해서는 면역형광염색법에 의해 APP 및 관련 분자의 세포내 분포를 확인하여 모과의 약리활성 성분과의 상호작용 여부와 αsecretase 및 γ-secretase의 in vitro 효소활성도 측정해야 할 것이다.
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