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문제 정의
- 일본이나 중국 등에 비해 우리나라는 품종의 다양성이 많이 뒤진 상태이므로 계속적인 품종 개발이 요구되며, 육종의 목표를 생산성, 품질 및 온도형 등에만 국한시킬 것이 아니라 원목과 톱밥 이외의 내충성 내병성 품종 등 여러 방법을 이용하여 다양한 특성의 품종 개발이 전개되어야 한다. 따라서 본 연구에서는 밀려 들어오는 외국계 품종에 대응하고 경쟁력을 갖추기 위한 일환으로서 Di-mon 교배에 의해 새롭게 만들어진 균주에 대하여 생리적 특성 검정을 통하여 우수한 품종 선발 실험을 수행하였다.
- 이는 균사 생장이 왕성하여 호흡량이 많았던 것으로 생각되었다. 이는 고온성 품종이 중저온성 품종에 비해 균사의 활동이 왕성해 배지의 분해도 많았을 것으로 보이는데, 배지의 영양원과도 관련이 있었을 것으로 보이나 통계적으로 유의하지 않아 경향을 볼 수 없었으며 차후 추가 실험으로 좀 더 세밀한 결과를 보고자한다.
- 본 연구에서는 KFRI 490의 이핵 균사와 KFRI 536의 일핵 균사를 Di-mon 교잡을 시도하여 새로운 품종을 개발하였다. 품종명을 풍년고라 명명하였고, 생리적 특성을 파악하고자 하였다.
- 본 연구에서는 KFRI 490의 이핵 균사와 KFRI 536의 일핵 균사를 Di-mon 교잡을 시도하여 새로운 품종을 개발하였다. 품종명을 풍년고라 명명하였고, 생리적 특성을 파악하고자 하였다. 풍년고의 최적 균사 생장 온도는 25oC이었고, 균사 밀도는 성김이었으며, 균총 색깔은 무색이고 피막은 형성되지 않았다.
제안 방법
- 새로 교잡된 균주 풍년고와 모균주인 KFRI 490과 KFRI 536 균사의 특성을 산림청 ‘신품종심사를 위한 표고버섯 특성조사요령’으로 조사하였다[12].
- 측정 방법은 ‘농촌진흥청(2000)의 분석기준 방법’[14]을 변형하여 톱밥과 증류수를 1:5의 비율로 섞어 pH를 측정하였다.
- 배지의 조성은 참나무 톱밥과 영양원을 8:2 비율로 혼합하였고 탄산칼슘은 0.5%로 하여 미강, 미강+칼슘, 보리가루, 보리+칼슘, 콩비지, 콩비지+칼슘, 홍삼박, 홍삼박+칼슘등 총 여덟 개 처리구로 제작하였고, 함수율을 60 ± 5%로 조정하였다.
- 2,2'-azino-bis(3-ethyl benzthiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS)는 laccse와 반응 시 청록색의 발색대를 형성하는 특성이 있으므로 Jeon과 Ka[13]의 방법을 변형하여 다음과 같이 ABTS 효소검색용 배지인 ABTS agar plate를 제조하였다.
- 표고의 이핵 균사 KFRI 490과 일핵 균사 KFRI 536을 Di-mon 교배법으로 교잡하였다[10, 11]. 약 3~4주 정도 배양 후 균사의 선단에 형성된 부분을 취하여 이핵 균사의 특이적 특징인 꺾쇠 연결(clamp-connection)을 광학현미경으로 확인하였다. 새로 만들어진 교잡균주와 모균주를 PDA 평판배지에 서로 마주보게 접종해서 1~2개월 배양하여 대치선이 형성되면 교잡이 성공적으로 이루어진 것이라고 판단하였다.
- 풍년고와 대조 품종인 산림4호의 부후적 특성을 알기 위해 목질 분해 효소인 cellulas와 laccase의 활성을 측정하였다. 셀룰로오스 분해 효소의 활성을 조사하기 위해 Jeon과Ka[13]가 제시한 방법에 따라 carboxymethylcellulose(CMC)를 기질로 하는 효소 검색용 배지 CMC agar plate(NaNO3 2.
- 0 mL씩 떨어뜨려 고르게 분산시킨 후, 차광한 상태에서 2시간 동안 상온에 방치하였다. 배지 내의 cellulase 활성 영역 즉, 접종원을 포함한 투명환의 직경을 mm 단위로 측정하였다.
- 풍년고와 산림4호 균주의 리그닌 분해력을 조사하기 위해 리그닌 분해 효소 중의 하나인 laccase의 활성을 측정하였다. 2,2'-azino-bis(3-ethyl benzthiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS)는 laccse와 반응 시 청록색의 발색대를 형성하는 특성이 있으므로 Jeon과 Ka[13]의 방법을 변형하여 다음과 같이 ABTS 효소검색용 배지인 ABTS agar plate를 제조하였다.
- 0 g이 포함되도록 하였다. ABTS agar plate(직경 85 mm) 한 개 당 배지의 양은 20.0 mL로 하였으며 시험 균주(풍년고와 산림4호)의 접종원(직경 7 mm)을 배지 중앙에 한 개씩 접종한 후, 25oC에서 3일 또는 5일간 암배양하였다. 접종원을 중심으로 청록색의 원형 발색대가 형성된 경우 laccase 활성이 있는 것으로 간주하였으며, 접종원을 포함한 발색대의 크기를 mm 단위로 측정하였다.
- 0 mL로 하였으며 시험 균주(풍년고와 산림4호)의 접종원(직경 7 mm)을 배지 중앙에 한 개씩 접종한 후, 25oC에서 3일 또는 5일간 암배양하였다. 접종원을 중심으로 청록색의 원형 발색대가 형성된 경우 laccase 활성이 있는 것으로 간주하였으며, 접종원을 포함한 발색대의 크기를 mm 단위로 측정하였다.
- 살균 과정과 배양 중의 통기를 위하여 봉지의 입구에 필터를 끼운 다음 플라스틱 캡을 부착하였다. 배지에 풍년고, 산림4호, 백화향, 천백고의 종균을 접종한 후 120일간 배양하였으며, 30일 간격으로 배지 내의 pH 변화를 조사하였다. 측정 방법은 ‘농촌진흥청(2000)의 분석기준 방법’[14]을 변형하여 톱밥과 증류수를 1:5의 비율로 섞어 pH를 측정하였다.
- CO2 농도 실험은 위의 pH 측정과 같은 방법으로 배지를 조성하여 풍년고와 대조 균주 산림4호, 중저온성 품종인 백화향과 그의 대조 균주 천백고를 접종하였으며, 60일간 배양한 후 측정하였다. CO2 측정기기는 GV-100S (GASTEC, Kanagawa, Japan)를 통해 이루어졌다.
- CO2 측정기기는 GV-100S (GASTEC, Kanagawa, Japan)를 통해 이루어졌다. 검지관은 NO. 2H Carbon Dioxide Detector Tube (GASTEC), CO2 0.5~20%(measurement range)를 사용하였으며 방법은 측정용 검지관을 봉지의 내부로 찔러 넣어 CO2를 측정한 다음 구멍을 테이프로 밀봉하였다.
- 1C). 풍년고를 모균주 KFRI 490과대치 배양한 결과 명백한 대치선을 형성하여 독립성을(Fig. 2) 확인하였다.
- 4C). 대조 품종인 산림4호의 결과도 풍년고와 같으며 조사는 육안으로 판단하였다. 균주에 따라 균총의 형태, 밀도, 색깔 등이 약간씩 차이가 있으며, 같은 균주라도 온도, 습도, 광 등의 조건을 다르게 하고 배양하면 균총의 형태가 약간 다를 수 있으나 그 정도는 크지 않았다.
- 배양실 온도 22oC에서 60일 배양 후 CO2를 측정하였다. CO2의 농도는 여덟 가지의 배지 조성에서 변이가 컸으나 배지 조성에 따른 경향성을 볼 수 없었다.
대상 데이터
- 산림5호는 11~22oC의 고온성 균주로2 kg 톱밥배지에서 650 g이 생산되는 균주이다[8, 9]. 배지 조성별 pH와 CO2 농도를 비교하기 위하여 풍년고, 산림4호, 백화향, 천백고 균주를 공시균주로 사용하였다. 표고의 이핵 균사 KFRI 490과 일핵 균사 KFRI 536을 Di-mon 교배법으로 교잡하였다[10, 11].
이론/모형
- 배지 조성별 pH와 CO2 농도를 비교하기 위하여 풍년고, 산림4호, 백화향, 천백고 균주를 공시균주로 사용하였다. 표고의 이핵 균사 KFRI 490과 일핵 균사 KFRI 536을 Di-mon 교배법으로 교잡하였다[10, 11]. 약 3~4주 정도 배양 후 균사의 선단에 형성된 부분을 취하여 이핵 균사의 특이적 특징인 꺾쇠 연결(clamp-connection)을 광학현미경으로 확인하였다.
- 풍년고와 대조 품종인 산림4호의 부후적 특성을 알기 위해 목질 분해 효소인 cellulas와 laccase의 활성을 측정하였다. 셀룰로오스 분해 효소의 활성을 조사하기 위해 Jeon과Ka[13]가 제시한 방법에 따라 carboxymethylcellulose(CMC)를 기질로 하는 효소 검색용 배지 CMC agar plate(NaNO3 2.0 g, K2HPO4 1.0 g, MgSO4 0.5 g, KCl 0.5 g, carboxymethylcellulose sodium salt 2.0 g, peptone 0.2 g, agar 15.0 g, DW 1L, pH 6.0)를 제조하였다. CMC agar plate (직경 85 mm) 한 개당 배지의 양은 20 mL로 하였으며, 배지의 중앙에 직경 7 mm 크기의 시험 균주(풍년고와 산림4호)를 각각 접종한 후, 25oC에서 7일간 배양하였다.
성능/효과
- 약 3~4주 정도 배양 후 균사의 선단에 형성된 부분을 취하여 이핵 균사의 특이적 특징인 꺾쇠 연결(clamp-connection)을 광학현미경으로 확인하였다. 새로 만들어진 교잡균주와 모균주를 PDA 평판배지에 서로 마주보게 접종해서 1~2개월 배양하여 대치선이 형성되면 교잡이 성공적으로 이루어진 것이라고 판단하였다.
- 산림청 ‘신품종심사를 위한 표고버섯 특성조사요령’[12]에 의하여 풍년고와 같은 온도형인 산림 4호를 대조 품종으로 30일 대치 배양한 결과 대치선이 형성되었고, 균사생장 속도에서 풍년고는 10.4 mm/day, 대조 품종인 산림4호는 6.3 mm/day, 모균주인 KFRI 490은 9.7 mm/day로 풍년고가 월등히 빨랐으며 최적 균사 생장 온도는 풍년고와 KFRI 490는 25oC이고 산림4호가 27oC이었다.
- 1D). 교잡이 이루어지는 부위가 일핵균사를 지나 뒤편에서 이루어지거나 한쪽 옆으로 치우치는등 여러 가지 유형이 있으나 풍년고는 이핵 균사가 일핵 균사를 지나 양옆으로 날개형의 모습으로 교잡이 이루어짐을 확인할 수 있었다(Fig. 1C). 풍년고를 모균주 KFRI 490과대치 배양한 결과 명백한 대치선을 형성하여 독립성을(Fig.
- 7 mm/day로 풍년고가 월등히 빨랐으며 최적 균사 생장 온도는 풍년고와 KFRI 490는 25oC이고 산림4호가 27oC이었다. 풍년고 균주의 균사 생장량은 25oC 배양에서 49.2 mm로 가장 높은 균사 생장을 하였다. KFRI 490 균주의 균사 생장은 25oC에서 66.
- 2 mm로 가장 높은 균사 생장을 하였다. KFRI 490 균주의 균사 생장은 25oC에서 66.6 mm로 가장 높은 생장량을 보였고, 산림5호 균주는 27oC에서는 37.8 mm로 가장 높은 균사 생장을 보였다. 풍년고의 최적 균사 생장 온도는 모균주 중 KFRI 490과같이 25oC로 KFRI 490의 특성이 더 많이 유전된 것으로 나타났다.
- 8 mm로 가장 높은 균사 생장을 보였다. 풍년고의 최적 균사 생장 온도는 모균주 중 KFRI 490과같이 25oC로 KFRI 490의 특성이 더 많이 유전된 것으로 나타났다. 표고의 균사는 일반적으로 5oC에서 자라기 시작하여 35oC에서 사멸한다[6].
- 3 mm로 1일당 8 mm정도 자라 이와 유사한 경향을 보였다. 역으로 29oC에선 20.7 mm의 생장을 보여 23oC 균사 생장의 75%를 보였고 1oC 상승할 때마다 약 4% 정도의 감소를 보였다(Fig. 3). 이처럼 표고는 저온보다는 고온에 취약하다.
- 이처럼 표고는 저온보다는 고온에 취약하다. 5일간 균사 생장속도를 측정한 결과 25oC에서 최대값을 보였다. 균사 생장이 빠르다는 것은 종균을 원목에 접종하여 균사가 만연되기까지의 경과가 빠르다는 의미로써 해균이나 해충에 유리한 위치를 우점할 수 있다.
- 고온성과 저온성의 균사 생장은 온도에 따라 차이가 나므로 이를 고려한 세심한 선발이 필요하다. 또한 우량 품종을 선발하고자 할 때 균사 생장이 느린 균주보다는 빠른 균주를 선택하는 것이 실패율을 줄일 수 있다. 균사 생장 최적 온도인 25oC에서 배양하여 14일 경과 후 균사 밀도는 성김, 보통, 조밀 중에서 성김으로 판단되었고(Fig.
- 또한 우량 품종을 선발하고자 할 때 균사 생장이 느린 균주보다는 빠른 균주를 선택하는 것이 실패율을 줄일 수 있다. 균사 생장 최적 온도인 25oC에서 배양하여 14일 경과 후 균사 밀도는 성김, 보통, 조밀 중에서 성김으로 판단되었고(Fig. 4A) 21일 경과하여 균총 색깔을 조사한 결과 색깔 유(有), 무(無) 중 색깔 무(無)로 조사되었다(Fig. 4B). 30일 배양하여 균총의 피막 형성 여부를 확인한 결과는 피막이 형성되지 않았다(Fig.
- CMC agar plate(pH 6.0)상에서 7일간 배양 후, 출원 균주인 풍년고와 대조 품종인 산림4호의 목질 분해 효소(cellulase, laccase) 활성을 조사한 결과 산림4호에 비해 풍년고의 cellulase 활성이 높은 것으로 나타났다(Table 1).풍년고와 산림4호의 cellulase 활성대는 각각 56.
- 이는 풍년고가 산림4호에 비해 cellulose를 분해하는 능력이 상대적으로 강하다는 것으로 해석할 수 있다. CMC agar plate 상에서 cellulase 활성이 균사 생장과 상관 관계가 있는지 살펴본 결과, 풍년고나 산림4호 모두 각각의 효소 활성과 균사 생장 사이에는 유의한 차이가 없었다. 이러한 결과는 균사가 생장함에 따라 cellulase 활성도 증가하여 균총의 크기와 유사하게 효소활성대가 형성되었다는 것을 의미한다.
- 표고는 대표적인 백색 부후균이기는 하지만 우수한 품종의 표고 균주를 육성하기 위해서는 cellulase 활성 등 목질 분해력이 높아야한다. 본 연구 결과를 통해 풍년고는 산림4호에 비해 cellulase 활성이 상대적으로 높다는 것을 알 수 있었다.
- ABTS agar plate (pH 6.0)에서 5일간 배양 후, 풍년고와 대조 품종인 산림4호의 laccase 활성을 조사한 결과, laccase의 활성은 산림4호(55.6 mm) 에 비해 풍년고(58.0 mm)가 유의하게 높았다(Table 2). 배양 기간이 증가할수록 laccase활성은 풍년고나 산림4호 모두 증가하였다.
- 산림4호 역시 풍년고와 유사한 특성을 보여주었다. 이상의 결과로 풍년고는 산림4호에 비해 laccase 활성이 상대적으로 높다는 것을 알 수 있었다.
- 5). 배양 120일째 배지에서는 미강은 pH 3.8~4.1, 보리가루 첨가 배지는 pH 4.4~3.7, 콩비지 첨가 배지는 pH 3.7~3.9, 홍삼 첨가 배지는 pH 3.9~3.8로 나타나, 배지 재료별 pH는 배양 전 pH 4.7~5.5였고, 120일 배양 후 pH 3.7~3.9로 낮아졌으며 배지 종류별, 품종별 차이는 유의하지 않았고, 배양 기간이 오래 될수록 pH는 낮아지는 경향이었다. 접종 전 pH 5.
- CO2의 농도는 여덟 가지의 배지 조성에서 변이가 컸으나 배지 조성에 따른 경향성을 볼 수 없었다. 고온성 품종인 풍년고와 산림4호에서 대체적으로 CO2 농도가 높았으며, 중저온성과 중온성인 백화향과 천백고는 위의 두 품종보다 CO2 농도가 낮았다(Fig. 6). 이는 균사 생장이 왕성하여 호흡량이 많았던 것으로 생각되었다.
- 품종명을 풍년고라 명명하였고, 생리적 특성을 파악하고자 하였다. 풍년고의 최적 균사 생장 온도는 25oC이었고, 균사 밀도는 성김이었으며, 균총 색깔은 무색이고 피막은 형성되지 않았다. 배양 7일째 풍년고가 56.
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