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문제 정의
- 본 연구는 흑삼추출물의 항당뇨 활성을 확인하기 위해 αglucosidase 억제제로서의 활성과 골격근 세포주를 이용한 당 흡수조절 효과, streptozotocin으로 유도한 당뇨쥐에서의 항당뇨 효과를 확인하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 본 연구에서는 기능성식품의 소재로 개발하기 위해 streptozotocin으로 유도한 제1형 당뇨 mouse 모델을 사용하여 흑삼의 혈당 조절기능성을 확인하고 복용기간에 따른 경과를 확인하고자 한다.
제안 방법
- α-glucosidase 억제 활성 측정 − α-glucosidase 억제 활성은 이전에 보고된필자 등의 방법을 약간 보완하여 사용하였다.
- 14) 간단히 기술하자면 분화가 완료된 C2C12 myotube를 PBS로 세척한 후 serum-free low-glucose DMEM을 넣어 1시간 배양한 후 2-NBDG(100 μM)과 증포 정도가 다른 흑삼 추출물을 800 μg/mL과 400 μg/mL의 농도로 투여하여 1시간 배양하였으며 대조군으로 인슐린(100 nM)을 사용하였다.
- C2C12 Myotube에서 당 흡수 측정 − 분화된 C2C12 myotube에서의 당 흡수 능력을 측정하기 위해 2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino]-2-deoxy-glucose(2-NBDG, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 필자 등의 방법을 약간 보완하여 사용하였다.
- STZ로 유도한 당뇨 쥐에서 흑삼 추출물의 공복혈당 조절 효과 − 흑삼추출물의 STZ로 유도한 당뇨쥐에 대한 혈당 조절 효과를 확인하기 위해 실험동물의 공복혈당을 측정하였다.
- STZ로 유도한 당뇨 쥐에서 흑삼추출물 투여 시 당화혈색소(HbA1c) 함량의 변화 − 본 연구에서는 흑삼추출물의 항당뇨 효과의 지표의 하나로서 당화혈색소에 대한 흑삼의 효과를 확인하였다(Fig. 4).
- 공복 혈당 측정 − 혈당의 측정은 12시간 이상 절식시킨 후 모든 동물의 꼬리정맥으로부터 혈액을 수집하여 혈당측정검사지(Accu-check)를 이용해 측정하였다.
- 5)에 녹인 streptozotocin을 1회 60 mg/kg의 용량으로 2일에 걸쳐 2회 투여하였으며 동일한 용량의 citrate buffer를 투여한 쥐를 정상군으로 사용하였다. 당뇨가 유발된 12군에 대해서는 각각 4군씩 당뇨군(STZ), 흑삼 900 mg/kg/day 처리군(GBG05-FF900), 흑삼 300 mg/kg/day 처리군(GBG05-FF300)으로 나누어 실험하였다. 흑삼 추출물은 사전실험 결과에 따라 5번 증포 한 것을 사용하였으며, 흑삼 처리군에 900 mg/kg/day, 300 mg/kg/day 용량으로 1일 1회 투여한 후 매주 정상군, 당뇨군(STZ), 흑삼 900 mg/kg/day 처리군(GBG05-FF900), 흑삼 300 mg/kg/day 처리군(GBG05-FF300)을 한 군씩을 희생하여 당뇨 쥐에 대한 흑삼추출물의 효과를 확인하였다.
- 동물의 당뇨유도와 실험설계 − 1주일간 순화된 흰쥐를 7마리씩 16군으로 분리하여 12군에 대해 당뇨를 유발하였다. 당뇨를 유발하기 위해 실험쥐를 16시간 절식시킨 후 0.1 M citrate buffer(pH 4.5)에 녹인 streptozotocin을 1회 60 mg/kg의 용량으로 2일에 걸쳐 2회 투여하였으며 동일한 용량의 citrate buffer를 투여한 쥐를 정상군으로 사용하였다. 당뇨가 유발된 12군에 대해서는 각각 4군씩 당뇨군(STZ), 흑삼 900 mg/kg/day 처리군(GBG05-FF900), 흑삼 300 mg/kg/day 처리군(GBG05-FF300)으로 나누어 실험하였다.
- 당화혈색소(HbA1c) 측정 − HbA1c의 농도 검사는 12시간 이상의 공복을 유지한 상태에서 진행하였다.
- 동물의 당뇨유도와 실험설계 − 1주일간 순화된 흰쥐를 7마리씩 16군으로 분리하여 12군에 대해 당뇨를 유발하였다.
- 위의 추출한 추출액은 5 μm 정성여과(No.1, Advantec, Tampa, FL, USA)를 사용하여 여과하여 감압농축 후 동결 건조하여 in vitro 실험에 사용하였으며, in vivo 실험은 5증포 흑삼(GBG05-FF)을 이용하여 진행하였다.
- 15) 본 연구 결과에서 보는바와 같이 흑삼 추출물은 골격근 세포인 C2C12 myotube에서 당 흡수량을 증가시키는 것이 확인되었다. 이로 보아 흑삼은 혈당 개선 효과가 있을 것으로 예상되어 고농도 군과 저농도 군 모두에서 우수한 활성을 보인 5증 추출물을 사용하여 이후의 동물실험을 진행하였다.
- Mouse를 마취한 후 개복하여 복대동맥에서 전혈을 채취하여 실험에 사용하였다. 혈액내 당화혈색소의 양을 측정하기 위해 Mouse HbA1c(Glycosylated Hemoglobin/Hemoglobin A1c) ELISA Kit(MyBioSource, Inc.)를 매뉴얼에 따라 사용하였다. 간단히 기술하자면, 각 well에 시료를 100 μL 넣고 37°C에서 90분간 반응 시킨 후, 반응액을 제거하고 Biotinylated Detection Antibody를 100 μL첨가 하여 1시간 반응시킨다.
- 14) 간단히 기술하자면 분화가 완료된 C2C12 myotube를 PBS로 세척한 후 serum-free low-glucose DMEM을 넣어 1시간 배양한 후 2-NBDG(100 μM)과 증포 정도가 다른 흑삼 추출물을 800 μg/mL과 400 μg/mL의 농도로 투여하여 1시간 배양하였으며 대조군으로 인슐린(100 nM)을 사용하였다. 형광강도는 microplate reader를 사용하여 excitation wavelength 465 nm, emission wavelength 540 nm에서 측정한 후 형광현미경을 이용해 관찰하였다.
- 당뇨가 유발된 12군에 대해서는 각각 4군씩 당뇨군(STZ), 흑삼 900 mg/kg/day 처리군(GBG05-FF900), 흑삼 300 mg/kg/day 처리군(GBG05-FF300)으로 나누어 실험하였다. 흑삼 추출물은 사전실험 결과에 따라 5번 증포 한 것을 사용하였으며, 흑삼 처리군에 900 mg/kg/day, 300 mg/kg/day 용량으로 1일 1회 투여한 후 매주 정상군, 당뇨군(STZ), 흑삼 900 mg/kg/day 처리군(GBG05-FF900), 흑삼 300 mg/kg/day 처리군(GBG05-FF300)을 한 군씩을 희생하여 당뇨 쥐에 대한 흑삼추출물의 효과를 확인하였다.
- 흑삼 추출물의 α-glucosidase에 대한 억제 효과 − 동물실험전의 사전실험으로서 흑삼 70% EtOH 추출물의 증포 횟수별 α-glucosidase 활성 억제 효과를 확인하였다(Table I).
- 흑삼의 제조는 수삼을 증숙기를 사용하여 95°C에서 6시간 증숙 후 60°C에서 건조하는 과정을 반복하여 최종적으로 수분함량이 13% 이내, 지표물질(Rg5, Rk1, Rh4) 함량(4~40 mg/g)로 제조 및 건조하여 흑삼을 제조하였다.
대상 데이터
- 당화혈색소(HbA1c) 측정 − HbA1c의 농도 검사는 12시간 이상의 공복을 유지한 상태에서 진행하였다. Mouse를 마취한 후 개복하여 복대동맥에서 전혈을 채취하여 실험에 사용하였다. 혈액내 당화혈색소의 양을 측정하기 위해 Mouse HbA1c(Glycosylated Hemoglobin/Hemoglobin A1c) ELISA Kit(MyBioSource, Inc.
- 시약 및 기기 − 세포배양에서 필요한 Dulbecco’s modified Eagle's medium(DMEM)과 Low-glucose DMEM 배지는 Welgene(Daegu, Korea) 제품을, Fetal bovine serum(FBS)과 Horse serum은 Hyclone(New zealand) 제품을 구입해 사용하였다.
- 흑삼추출물 제조 − 본 실험에 사용된 흑삼은 5년근 수삼을 충남 금산수삼시장에서 구입하여 무게, 치밀도, 수분함량, 총당, 조단백질 분석을 거쳐 일정한 영양성분에 충족되는 샘플을 선별하여 세척 한 후 실험에 사용하였다.
데이터처리
- Significant differences between the treated groups were determined using analysis of variance followed by Scheffe’s test for multiple comparisons.
- 통계분석 − 모든 실험은 3회 이상 반복으로 이루어졌으며, 실험결과는 각 항목에 따라 평균치±표준편차(SD)를 구하여 그 유의성은 SPSS(ver.22)을 사용하여 분산분석(ANOVA)으로 실험군 간의 차이를 Scheffe’s test에 의하여 유의성 차이를 p<0.05 수준에서 검증하였다.
이론/모형
- Significant differences between treated groups were determined using Scheffe’s test.
성능/효과
- p>당뇨는 인슐린 분비의 절대적 부족이나 조직 및 장기의 기능장애로 인한 상대적인 인슐린의 부족으로 인해 발생하는 고혈당증을 특징으로 한다.1) 최근 우리나라는 활동량의 감소, 식생활의 서구화 등의 생활습관의 변화로 비만을 비롯한 만성대사질환이 중요한 사회적 문제로 대두되고 있으며,2) 대표적 대사 질환인 당뇨는 기대수명을 십년정도 감소시킨다.3) 특히 당뇨는 암과 순환기 질환과 더불어 3대 질환으로 분류되며, 안구, 신장, 신경, 심장, 혈구 등 광범위한 장기와 조직에 걸쳐 기능장애 및 손상을 유발하는 합병증을 동반한다.
- 1. α-glucosidase에 대한 IC50을 측정한 결과 1200 μg/mL 이상의 고농도에서 확인이 가능하였으며, 이로보아 αglucosidase 억제제로는 적합하지 않은 것으로 생각된다.
- 때문에 골격근에서의 당 흡수 개선은 당뇨에 있어 효과적인 혈당개선의 수단으로 여겨진다.15) 본 연구 결과에서 보는바와 같이 흑삼 추출물은 골격근 세포인 C2C12 myotube에서 당 흡수량을 증가시키는 것이 확인되었다. 이로 보아 흑삼은 혈당 개선 효과가 있을 것으로 예상되어 고농도 군과 저농도 군 모두에서 우수한 활성을 보인 5증 추출물을 사용하여 이후의 동물실험을 진행하였다.
- STZ에 의해 췌장의 β-cell이 파괴되면 인슐린 분비 장애로 인해 당 대사의 불균형이 발생하며, 이로 인해 당뇨쥐의 경우 체중이 감소하는 경향성이 보이는 것으로 보고되어있다.16) 본 실험에서는 아직 성장기가 끝나지 않은 5주령의 ICR마우스를 사용하여 실험한 결과 실험동물의 체증증가량이 억제되는 경향성을 보였다. 일부 약물 투여군에서 당뇨군에 비해 체중증가량이 증가하는 양상을 보였으나 전반적인 경향성으로 보았을 때 흑삼추출물은 체중의 증가에 영향을 미치지 않는 것으로 생각된다.
- 2. C2C12 myotube에 흑삼추출물 투여 시 약물 비 처리군에 비하여 당 흡수량이 유의적으로 상승하였다.
- 1) 최근 우리나라는 활동량의 감소, 식생활의 서구화 등의 생활습관의 변화로 비만을 비롯한 만성대사질환이 중요한 사회적 문제로 대두되고 있으며,2) 대표적 대사 질환인 당뇨는 기대수명을 십년정도 감소시킨다.3) 특히 당뇨는 암과 순환기 질환과 더불어 3대 질환으로 분류되며, 안구, 신장, 신경, 심장, 혈구 등 광범위한 장기와 조직에 걸쳐 기능장애 및 손상을 유발하는 합병증을 동반한다.4) 세계보건기구에 따르면 전 세계적으로 3억 5천만 명 이상이 당뇨를 앓고 있으며 2030년이 되면 5억 5천만 명이 넘을 것으로 예상하였다.
- 3. Streptozotocin으로 유도한 당뇨쥐에 흑삼추출물을 투여한 결과 당뇨 평가의 중요한 지표인 공복혈당을 유의적으로 억제하였으며, 또 다른 지표인 HbA1c의 함량을 유의적으로 감소시킴을 확인할 수 있었다.
- 3) 특히 당뇨는 암과 순환기 질환과 더불어 3대 질환으로 분류되며, 안구, 신장, 신경, 심장, 혈구 등 광범위한 장기와 조직에 걸쳐 기능장애 및 손상을 유발하는 합병증을 동반한다.4) 세계보건기구에 따르면 전 세계적으로 3억 5천만 명 이상이 당뇨를 앓고 있으며 2030년이 되면 5억 5천만 명이 넘을 것으로 예상하였다.5) 당뇨의 유형에는 제1형 당뇨와 제2형 당뇨가 있으며 제1형 당뇨는 인슐린 의존성 진성 당뇨병으로서 보통 30세 이전의 비교적 젊은 나이에 발병하며 급성으로 진행되고 자가면역질환이나 바이러스 감염에 의한 췌장의 파괴에 의해 나타나며 비만과의 연관성은 비교적 적다.
- 4) 세계보건기구에 따르면 전 세계적으로 3억 5천만 명 이상이 당뇨를 앓고 있으며 2030년이 되면 5억 5천만 명이 넘을 것으로 예상하였다.5) 당뇨의 유형에는 제1형 당뇨와 제2형 당뇨가 있으며 제1형 당뇨는 인슐린 의존성 진성 당뇨병으로서 보통 30세 이전의 비교적 젊은 나이에 발병하며 급성으로 진행되고 자가면역질환이나 바이러스 감염에 의한 췌장의 파괴에 의해 나타나며 비만과의 연관성은 비교적 적다. 주로 아동기 또는 청소년기에 발병하기 때문에 소아당뇨병이라고도 한다.
- STZ 투여 전 실험군들의 공복혈당은 110-120 mg/dL로 차이가 없었으나 STZ 투여 이후 350-450 mg/dL 농도로 증가하여 당뇨가 유발되었다. STZ 투여 후 2주차에 잠시 감소양상을 보였으나 다시 회복되어 점차 증가하는 경향성을 보였다. 약물투여군의 경우 1주 이후부터 점차 감소하는 경향을 보였으며 3주차부터는 유의적인 차이가 나타났다.
- 4). STZ로 유도한 당뇨쥐의 경우 정상군에 비해 당화혈색소의 농도가 유의적으로 증가하였으며, 점차 증가하는 양상을 보였다. 흑삼 투여군의 경우 당뇨군과 유사하게 상승하였으나 3주차부터 점차 감소하였으며 4주차에는 당뇨군과 비교하여 농도 의존적으로 유의적 감소를 보였다.
- 2에 나타내었다. 초기체중은 24-25 g으로 군간의 차이가 거의 없었으나, 최종 체중은 STZ를 투여한 12군에서 정상군과 비교하여 체중 증가량이 낮은 경향을 보였다. STZ에 의해 췌장의 β-cell이 파괴되면 인슐린 분비 장애로 인해 당 대사의 불균형이 발생하며, 이로 인해 당뇨쥐의 경우 체중이 감소하는 경향성이 보이는 것으로 보고되어있다.
- 흑삼 추출물의 C2C12 Myotube에서 당 흡수 조절 효과 − 분화된 골격근세포에서의 흑삼의 Glucose Uptake를 측정한 결과, 증수가 증가할수록 세포내로 유입되는 Glucose의 양이 점차 증가하였으며, 일정 증수에 도달한 이후에는 일정하게 유지되거나 오히려 감소하는 경향성을 나타내었다(Fig. 1).
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