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문제 정의
- 본 연구의 목적은 국내에서 개발되어 재배되는 5가지 참다래 품종(해향, 해금, 비단, 만수, 치악)과 외래 2품종(뉴질랜드 헤이워드, 중국 041AE) 등 총 7가지 품종 참다래의 과육과 껍질의 총페놀 함량, 총플라보노이드 함량, 항산화능을 정량적으로 비교 분석하고, 산화적 스트레스에 의한 PC-12 신경세포 보호 효과를 평가하였다. 본 연구는 국내 육성 참다래 품종에 함유된 생리활성물질의 정량적 분석을 통해 기능성이 우수한 과일 및 식품 소재로서 가치를 확인하고자 하였다.
- 하지만 국내에서 육성된 새로운 참다래 품종들에 대한 연구는 여전히 미비한 실정이다. 본 연구의 목적은 국내에서 개발되어 재배되는 5가지 참다래 품종(해향, 해금, 비단, 만수, 치악)과 외래 2품종(뉴질랜드 헤이워드, 중국 041AE) 등 총 7가지 품종 참다래의 과육과 껍질의 총페놀 함량, 총플라보노이드 함량, 항산화능을 정량적으로 비교 분석하고, 산화적 스트레스에 의한 PC-12 신경세포 보호 효과를 평가하였다. 본 연구는 국내 육성 참다래 품종에 함유된 생리활성물질의 정량적 분석을 통해 기능성이 우수한 과일 및 식품 소재로서 가치를 확인하고자 하였다.
제안 방법
- 50µL의 DMSO를 첨가하여 보라색의 포르마잔(formazan)을 용해시킨 후, 형광광도계(Tecan infinite M200)를 이용해 570nm와 630nm에서 측정하였다.
- ABTS 용액 980μL와 시료 20μL를 10분간 반응 후 37℃에서 734nm에서 흡광도 감소를 측정하였다.
- 각 시료 50μL와 DPPH 용액 2.95mL를 첨가하여 23℃에서 30분간 반응시킨 후 흡광도 감소량을 517nm에서 측정하였다.
- 해금, 해향, 비단, 만수, 치악 같은 국내 육성 참다래 품종이 뉴질랜드 헤이워드 및 중국 041EA 참다래보다 총페놀 함량, 총플라보노이드 함량, 항산화능이 높은 것으로 확인되었다. 또한, 참다래가 세포 내 산화적 스트레스를 제거해 신경세포인 PC-12 세포주의 생존률을 증가시켰다. 이러한 결과는 국내 육성 참다래가 천연 항산화 식품 소재로서 활용이 가능하다는 것을 의미한다.
- 최종 추출물은 분석 전까지 -20℃에서 보관하였다. 모든 시료에 대해서 독립적으로 3회 추출하였다.
- 참다래를 과피와 과육으로 분리하였다. 무수 메탄올(absolute methanol)에 100mL에 과피 10g 또는 과육 50g을 넣고 3분간 호모게나이저(homogenizer, Polytron RT-2100, Kinematica AG, Littau-Luzern, Switzerland)로 15,000rpm에서 균질화 후, Whatman No. 2 여과지(Whatman International Limited, Kent, England)를 이용하여 여과하였다. 여과 후 여과박(filter cake)을 회수하여 100mL의 80%(v/v) 메탄올을 이용하여 1회 더 반복 추출하였고, 여과된 추출물을 감압회전농축기(N-1000, Eyela, Tokyo, Japan)를 이용하여 농축하였다.
- 산화적 스트레스로 300μM H2O2를 첨가하고 1시간 후에 형광광도계(Tecan infinite M200)를 이용하여 excitation은 485nm, emission은 530nm에서 측정하였다.
- 세포배양을 위하여 RPMI 1640 배지에 10% FBS, penicillin(100units･mL-1), streptomycin(100μg･mL-1)을 첨가하였으며, 37℃, 5% CO2를 유지하는 이산화탄소 배양기(CO2 incubator BB 15, Thermo Electron LED GmbH, Langenselbold, Germany)에서 배양하였다.
- 이 혼합용액에 153mM의 AAPH 25μL를 첨가한 뒤 형광광도계(microplate reader, Tecan infinite M200, San Jose, CA, USA)로 90분간 매분 측정하였다.
- 혼합한 용액에 7%(w/v) Na2CO3 용액 2mL를 첨가하였다. 총 90분 동안 반응시킨 후 750nm에서 흡광도를 측정하고, gallic acid를 이용하여 표준곡선(standard curve)의 검량선을 작성하였다. 총페놀 함량은 mg gallic acid equivalents(GAE).
- 총페놀 함량은 Folin-Ciocalteu’s phenol reagent를 이용한 발색법(Singleton and Rossi, 1965)을 변형하여 이용하였다.
- 국내에서 재배한 7품종 참다래의 총페놀 함량, 총플라보노이드 함량, 항산화능 모두 과육보다는 껍질이 높았다. 하지만 대부분의 참다래의 경우, 껍질 부분은 털이 많고 거칠며 질긴 식감 때문에 섭취하지 않으므로, 실질적인 섭취 부위인 과육 부분을 PC-12 신경세포 보호 효과의 평가에 사용하였다. 참다래 과육 추출물의 산화적 스트레스로부터 신경세포 보호 효과를 MTT 법으로 평가한 결과는 Fig.
대상 데이터
- 시험에 사용한 참다래 7가지 품종은 Table 1에 제시하였다. 7품종의 참다래는 헤이워드(cv. Hayward), 해향(cv. Haehyang), 해금(cv. Haegeum), 비단(cv. Bidan), 만수(cv. Mansoo), 치악(cv. Chiak), 041AE(accession number)로서 전라남도 광양(위도: 35.0114, 경도: 127.5862)에서 재배하였다. 참다래는 모두 2012년 10월 하순에 수확하였으며, 수확된 참다래는 실험 전까지 -20℃에서 보관하며, 실험 전 과육과 과피를 분리하여 사용하였다.
- Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640 배지, fetal bovine serum (FBS), penicillin/streptomycin은 Welgene(Daegu, Korea)에서 구입하였다.
- 본 실험에서 사용한 PC-12 신경세포주는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 세포배양을 위하여 RPMI 1640 배지에 10% FBS, penicillin(100units･mL-1), streptomycin(100μg･mL-1)을 첨가하였으며, 37℃, 5% CO2를 유지하는 이산화탄소 배양기(CO2 incubator BB 15, Thermo Electron LED GmbH, Langenselbold, Germany)에서 배양하였다.
- 5862)에서 재배하였다. 참다래는 모두 2012년 10월 하순에 수확하였으며, 수확된 참다래는 실험 전까지 -20℃에서 보관하며, 실험 전 과육과 과피를 분리하여 사용하였다.
데이터처리
- Letters above bars indicate significant differences according to Duncan’s multiple range test (p < 0.05).
- 각 평균값의 유의적 차이는 Duncan’s multiple range test에 의해 95%의 신뢰구간에서 사후 검정하였다.
- 모든 실험은 3반복한 결과를 평균 ± 표준편차로 나타내었다.
- 모든 실험은 3반복한 결과를 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 통계학적 분석은 SAS 프로그램(version 9.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하였다. 각 평균값의 유의적 차이는 Duncan’s multiple range test에 의해 95%의 신뢰구간에서 사후 검정하였다.
이론/모형
- 참다래 페놀 추출물의 신경세포 보호 효과를 알아보기 위해 세포 생존율을 측정하는 MTT 법은 Heo et al.(2001)의 방법에 근거하여 실행하였다. PC-12 세포주는 RPMI 1640 배지에 희석하여 96-well plates에 2 × 104 cells/well 농도로 분주하고 24시간 배양하였다.
- 과산화 라디칼(peroxy radical)의 생성과 소멸에 의한 형광 감소율을 측정하는 Huang et al.(2002)의 방법을 사용하였다. 참다래 추출물 시료 및 비타민 C 표준용액의 제조에는 phosphate buffer(75mM K2HPO4, 75mM KH2PO4)를 사용하였다.
- 2. Protective effects of the methanol extracts of seven cultivars of kiwifruit (Actinidia spp.) on the viability of neuronal PC-12 cells upon H2O2-induced oxidative stress, measured using the MTT assay. ‘C’ represents control group.
- 세포 내 산화적 스트레스는 DCFH-DA를 이용한 형광분석법(Wolfe and Liu, 2007)으로 측정하였다. PC-12 세포주는 RPMI 1640 배지에 희석하여 96-well plates에 2 × 104 cells/well 농도로 분주하고 24시간 배양하였다.
- 참다래 페놀성 화합물의 추출을 위해 메탄올과 함께 미세 분쇄를 위해 균질화(homogenization)를 활용한 방법을 사용하였다(Kim and Lee, 2002). 참다래를 과피와 과육으로 분리하였다.
- 총플라보노이드 함량의 측정은 AlCl3 용액을 이용한 발색법(Jia et al., 1999)을 이용하였다. 추출물 0.
성능/효과
- 7품종 참다래의 총페놀 함량과 항산화능의 상관계수(correlation coefficient, r2)는 0.88 이상의 양의 기울기를 갖는 직선의 상관관계를 보였다(Fig. 1).
- 3mg VCE(비단)로 비교적 넓은 범위의 항산화능을 보였다. ABTS 법으로 측정한 항산화능 결과와 비슷하게, DPPH 법에서도 해향, 해금, 비단 품종의 껍질에서 대체로 다른 품종들에 비해 더 높은 항산화능을 보였다. 과육의 경우에는 항산화능이 가장 높은 비단 품종이 가장 낮은 치악 품종에 비해서 약 16.
- 총페놀 함량 및 총플라보노이드 함량의 결과와 유사하게 3가지 항산화능 평가법에서 과육보다는 껍질에서 항산화능이 더 높았다. ABTS 법으로 평가한 결과에서, 각 품종 100g 당 껍질의 경우 273.5mg VCE(041AE)에서 1,719.6mg VCE(해향), 과육의 경우 62.0mg VCE(헤이워드)에서 638.2mg VCE(비단)로 넓은 범위의 항산화능을 보였다. 껍질에서는 해향, 해금, 비단 품종이 다른 품종에 비하여 높은 항산화능을 보였다.
- DCFH-DA는 세포 내에서 에스터라아제(esterase)에 의해 2´,7´-dichlorofluorescin(DCFH)로 가수분해 되고, 산화적 스트레스에 의해 형광을 띄게 된다(Keston and Brandt, 1965). H2O2를 처리하지 않은 대조군(100%)과 비교하여, H2O2를 처리시 PC-12 세포 내의 산화적 스트레스는 약 190%까지 증가하였다(Fig. 3). 그러나, 실험에 사용한 7품종 참다래 과육 추출물은 165%(비단)에서 148%(해향)까지 세포 내 산화적 스트레스를 유의적인 수준으로 감소시켰다(Fig.
- 각 참다래 품종 100g 당 껍질의 총플라보노이드 함량은 해향 > 해금 > 치악 = 만수 > 041AE > 헤이워드 > 비단 순으로 감소하였으며, 과육의 경우에는 041AE > 해금 > 해향 > 치악 = 만수 > 헤이워드 > 비단 순으로 낮아졌다.
- 각 품종의 참다래를 ORAC 법을 사용하여 측정한 항산화능 역시 ABTS 법과 DPPH 법을 사용하여 평가한 항산화능과 비슷한 경향을 보였다(Table 3). 각 품종 100g 당 ORAC 법으로 측정한 항산화능은 껍질에서 1,839.8mg VCE(헤이워드)에서 7,050.8mg VCE(해향)의 폭넓은 범위에 걸쳐있었으며, 과육에서도 역시 284.5mg VCE(헤이워드)에서 1,088.0mg VCE(비단)의 넓은 범위에 걸쳐 항산화능을 보였다. 껍질의 항산화능이 ORAC 법에서도 역시 과육보다 더 높았다.
- DPPH 법을 이용하여 측정한 항산화능은 ABTS 법으로 측정한 결과와 유사한 경향성을 보였다(Table 3). 각 품종 100g 당 껍질의 경우 135.6mg VCE(헤이워드)에서 1,125.4mg VCE(해향), 과육의 경우 32.4mg VCE(치악)에서 524.3mg VCE(비단)로 비교적 넓은 범위의 항산화능을 보였다. ABTS 법으로 측정한 항산화능 결과와 비슷하게, DPPH 법에서도 해향, 해금, 비단 품종의 껍질에서 대체로 다른 품종들에 비해 더 높은 항산화능을 보였다.
- 각 품종 100g 당 껍질의 총페놀 함량은 해향 > 해금 > 비단 > 치악 > 만수 > 041AE > 헤이워드 순으로 낮아졌고, 과육의 경우에는 비단 > 해금 > 해향 > 041AE > 치악 > 만수 > 헤이워드 순으로 감소하였다.
- 각 품종의 참다래를 ORAC 법을 사용하여 측정한 항산화능 역시 ABTS 법과 DPPH 법을 사용하여 평가한 항산화능과 비슷한 경향을 보였다(Table 3). 각 품종 100g 당 ORAC 법으로 측정한 항산화능은 껍질에서 1,839.
- 껍질의 항산화능이 ORAC 법에서도 역시 과육보다 더 높았다. 과육에서 가장 높은 항산화능을 보인 비단 품종이 가장 낮은 값을 보인 헤이워드 품종보다 약 3.8배 높았으며, 껍질에서는 가장 높은 항산화능을 갖는 해향 품종이 가장 낮은 항산화능을 갖는 헤이워드 품종보다 약 3.8배 더 높았다.
- 껍질에서는 해향, 해금, 비단 품종이 다른 품종에 비하여 높은 항산화능을 보였다. 과육의 경우 비단 품종의 항산화능이 가장 낮은 항산화능을 보인 헤이워드 품종보다 약 10.2배 더 높았다. 본 연구에 사용된 여러 참다래 품종 간의 상이한 항산화능은 과채류의 품종에 따라 항산화능이 다르다는 결과와 유사하였다(Kähkönen et al.
- 국내에서 재배한 7품종 참다래의 총페놀 함량, 총플라보노이드 함량, 항산화능 모두 과육보다는 껍질이 높았다. 하지만 대부분의 참다래의 경우, 껍질 부분은 털이 많고 거칠며 질긴 식감 때문에 섭취하지 않으므로, 실질적인 섭취 부위인 과육 부분을 PC-12 신경세포 보호 효과의 평가에 사용하였다.
- 3). 그러나, 실험에 사용한 7품종 참다래 과육 추출물은 165%(비단)에서 148%(해향)까지 세포 내 산화적 스트레스를 유의적인 수준으로 감소시켰다(Fig. 3). 이 결과는 참다래가 세포 내에서 산화적 스트레스를 완화시켜 세포의 생존율을 높이는데 기여했다는 것을 의미한다.
- 2mg VCE(비단)로 넓은 범위의 항산화능을 보였다. 껍질에서는 해향, 해금, 비단 품종이 다른 품종에 비하여 높은 항산화능을 보였다. 과육의 경우 비단 품종의 항산화능이 가장 낮은 항산화능을 보인 헤이워드 품종보다 약 10.
- 산화적 스트레스로 300µM의 H2O2를 1시간 동안 세포에 처리 시, H2O2를 처리하지 않은 대조군(100%)과 비교하여 세포가 74%까지 사멸하였다. 반면, 해금 과육 추출물을 500mg･L-1의 농도로 전처리 시세포 생존률이 104%로 대조군 수준으로 증가하였고, 동일 농도에서 해향 과육 추출물은 95%, 헤이워드 과육 추출물은 91%로 세포생존률이 증가하였다(Fig. 2). 하지만 비단, 만수, 치악, 041AE의 과육 추출물은 유의적인 세포생존률 증가를 확인할 수 없었다.
- 1). 상이한 3가지 항산화능 평가법에서 ABTS 법으로 측정한 항산화능이 총페놀 함량과 상관계수(r2)가 가장 높은 0.98이었다(Fig. 1A). 참다래 추출물의 총플라보노이드 함량과 항산화능 사이의 상관계수는 0.
- 하지만 참다래 추출물의 항산화능과 세포보호효과를 좀 더 명확하게 밝히기 위해서는 참다래에 존재하는 개별 생리활성물질의 분리, 정량 분석 그리고 각 개별 물질의 항산화능과 세포보호효과에 대한 연구가 더 필요할 것으로 보인다. 이상의 연구 결과를 통하여 국내 육성 품종인 해금, 해향, 비단 등의 참다래가 항산화물질의 공급원 및 기능성 식품 소재로서 잠재적 가능성을 갖는 것으로 확인하였다.
- 1A). 참다래 추출물의 총플라보노이드 함량과 항산화능 사이의 상관계수는 0.65에서 0.96의 값을 가졌으며, ORAC 법에서 가장 높은 상관계수를 보였다(Fig. 1B). 이러한 양의 기울기를 갖는 1차 선형의 높은 상관관계는 참다래에 존재하는 페놀성 화합물이 항산화능에 많이 기여했다는 것을 의미한다.
- 참다래 품종의 총페놀 함량의 측정 결과와 비슷하게, 과육보다는 껍질에 더 많은 총플라보노이드 함량이 존재하는 것으로 확인되었다(Table 2). 각 참다래 품종 100g 당 껍질의 총플라보노이드 함량은 해향 > 해금 > 치악 = 만수 > 041AE > 헤이워드 > 비단 순으로 감소하였으며, 과육의 경우에는 041AE > 해금 > 해향 > 치악 = 만수 > 헤이워드 > 비단 순으로 낮아졌다.
- 7품종 참다래의 껍질과 과육의 항산화능을 ABTS 법, DPPH 법, ORAC 법을 사용하여 측정한 결과는 Table 3과 같다. 총페놀 함량 및 총플라보노이드 함량의 결과와 유사하게 3가지 항산화능 평가법에서 과육보다는 껍질에서 항산화능이 더 높았다. ABTS 법으로 평가한 결과에서, 각 품종 100g 당 껍질의 경우 273.
- 해금, 해향, 비단, 만수, 치악 같은 국내 육성 참다래 품종이 뉴질랜드 헤이워드 및 중국 041EA 참다래보다 총페놀 함량, 총플라보노이드 함량, 항산화능이 높은 것으로 확인되었다. 또한, 참다래가 세포 내 산화적 스트레스를 제거해 신경세포인 PC-12 세포주의 생존률을 증가시켰다.
후속연구
- 이러한 결과는 국내 육성 참다래가 천연 항산화 식품 소재로서 활용이 가능하다는 것을 의미한다. 하지만 참다래 추출물의 항산화능과 세포보호효과를 좀 더 명확하게 밝히기 위해서는 참다래에 존재하는 개별 생리활성물질의 분리, 정량 분석 그리고 각 개별 물질의 항산화능과 세포보호효과에 대한 연구가 더 필요할 것으로 보인다. 이상의 연구 결과를 통하여 국내 육성 품종인 해금, 해향, 비단 등의 참다래가 항산화물질의 공급원 및 기능성 식품 소재로서 잠재적 가능성을 갖는 것으로 확인하였다.
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