백년초의 PC-12 신경세포 보호 및 콜린가수분해효소(cholinesterase) 저해 효과 Effects of Opuntia ficus-indica var. saboten Ripe Fruits on Protection of Neuronal PC-12 Cells and Cholinesterase Inhibition원문보기
백년초를 80% (v/v) 에탄올-물 혼합용액으로 추출하여 총페놀 함량, 총플라보노이드 함량, 산화방지능, 신경세포 보호효과, AChE 및 BChE 활성저해능을 평가하였다. 백년초 100 g FW당 총페놀 함량은 409.9 mg GAE, 총플라보노이드 함량은 72.2 mg CE이었다. 백년초(100 g FW)의 산화방지능은 ABTS, DPPH, ORAC법에서 각각 381.2, 298.2, 3,219.9 mg VCE였다. 백년초 추출물은 $H_2O_2$의 산화 스트레스로부터 세포 내 산화 스트레스를 감소시켜 신경세포 PC-12의 생존율을 농도의존적으로 증가시켰다. 또한, 백년초 추출물은 AChE 및 BChE 활성을 저해하였다. 본 연구 결과로부터 백년초의 세포 내 산화 스트레스 감소에 의한 신경 세포 보호능과 AChE 및 BChE 저해능이 확인 되었으며, 이러한 결과를 통해 향후 백년초를 이용한 기능성 제품 및 여러 가공품 개발에 활용이 가능할 것으로 기대한다.
백년초를 80% (v/v) 에탄올-물 혼합용액으로 추출하여 총페놀 함량, 총플라보노이드 함량, 산화방지능, 신경세포 보호효과, AChE 및 BChE 활성저해능을 평가하였다. 백년초 100 g FW당 총페놀 함량은 409.9 mg GAE, 총플라보노이드 함량은 72.2 mg CE이었다. 백년초(100 g FW)의 산화방지능은 ABTS, DPPH, ORAC법에서 각각 381.2, 298.2, 3,219.9 mg VCE였다. 백년초 추출물은 $H_2O_2$의 산화 스트레스로부터 세포 내 산화 스트레스를 감소시켜 신경세포 PC-12의 생존율을 농도의존적으로 증가시켰다. 또한, 백년초 추출물은 AChE 및 BChE 활성을 저해하였다. 본 연구 결과로부터 백년초의 세포 내 산화 스트레스 감소에 의한 신경 세포 보호능과 AChE 및 BChE 저해능이 확인 되었으며, 이러한 결과를 통해 향후 백년초를 이용한 기능성 제품 및 여러 가공품 개발에 활용이 가능할 것으로 기대한다.
Oxidative stress caused by reactive oxygen species is ascribed to many neurodegenerative diseases like Alzheimer's disease. Phenolic antioxidants can reduce the oxidative stress. In this study, ripe fruits of Opuntia ficus-indica var. saboten (OFS) were extracted using 80% (v/v) aqueous ethanol. Tot...
Oxidative stress caused by reactive oxygen species is ascribed to many neurodegenerative diseases like Alzheimer's disease. Phenolic antioxidants can reduce the oxidative stress. In this study, ripe fruits of Opuntia ficus-indica var. saboten (OFS) were extracted using 80% (v/v) aqueous ethanol. Total phenolic and flavonoid contents of the OFS fruits (100 g) were 409.9 mg gallic acid equivalents and 72.2 mg catechin equivalents, respectively. The OFS fruits had antioxidant capacity at 381.2, 298.2, and 3,219.9 mg vitamin C equivalents/100 g in ABTS, DPPH, and ORAC assays, respectively. The OFS fruits showed protective effects on PC-12 cells against oxidative stress in a dose-dependent manner, partly due to decrease of intracellular oxidative stress. Furthermore, the OFS fruits inhibited both acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase. Consequently, these results suggest that the OFS fruits might be served as a source of functional materials to reduce oxidative stress in neuronal cells and to inhibit cholinesterases.
Oxidative stress caused by reactive oxygen species is ascribed to many neurodegenerative diseases like Alzheimer's disease. Phenolic antioxidants can reduce the oxidative stress. In this study, ripe fruits of Opuntia ficus-indica var. saboten (OFS) were extracted using 80% (v/v) aqueous ethanol. Total phenolic and flavonoid contents of the OFS fruits (100 g) were 409.9 mg gallic acid equivalents and 72.2 mg catechin equivalents, respectively. The OFS fruits had antioxidant capacity at 381.2, 298.2, and 3,219.9 mg vitamin C equivalents/100 g in ABTS, DPPH, and ORAC assays, respectively. The OFS fruits showed protective effects on PC-12 cells against oxidative stress in a dose-dependent manner, partly due to decrease of intracellular oxidative stress. Furthermore, the OFS fruits inhibited both acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase. Consequently, these results suggest that the OFS fruits might be served as a source of functional materials to reduce oxidative stress in neuronal cells and to inhibit cholinesterases.
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문제 정의
이를 통해 백년초 내에는 페놀화합물 등의 생리활성물질이 산화방지제로 역할을 하기 때문에 신경세포를 보호할 수 있는 것으로 여겨진다. 따라서 백년초 추출물의 세포 내 산화 스트레스에 대한 평가를 수행하였다.
제안 방법
AAPH (153 mM) 25µL를 추가로 넣은 후 형광측정 마이크로플레이트 판독기(microplate fluorescence reader, Infinite M200, Tecan AustriagmbH,grödig, Austria)을 이용하여 들뜸(excitation)은 485nm, 방출(emission)은 520nm에서 형광도를 90분 동안 매 1분 간격으로 측정하였다.
AChE 및 BChE 저해 활성은 nM 타크린 당량(nM tacrine equivalents)으로 나타내었고, 3반복 실험 뒤 통계처리하였다.
이후 DTNB (10mM) 30µL와 ATCI (15 mM) 20µL를 첨가하였다. BChE 저해법 또한 AChE와 ATCI 대신 0.2 U/mL BChE와 10mM BTCC 기질을 사용한 것 외에는 AChE 저해법과 동일한 방식으로 실험을 진행하였다. DTNB와 ATCI 또는 BTCC를 첨가한 뒤 37oC 배양기에서 30분간 정치시킨 후, 마이크로플레이트 판독기(Infinite M200)를 이용하여 415nm에서 흡광도를 측정하였다.
DPPH 라디칼을 이용한 산화방지능은 Brand-Williams 등(18)의 방법을 변형하여 측정하였다. 80% (v/v) 메탄올-물 혼합용액을 사용하여 100µM의 DPPH 용액을 제조한 후, 517nm에서 0.
2 U/mL BChE와 10mM BTCC 기질을 사용한 것 외에는 AChE 저해법과 동일한 방식으로 실험을 진행하였다. DTNB와 ATCI 또는 BTCC를 첨가한 뒤 37oC 배양기에서 30분간 정치시킨 후, 마이크로플레이트 판독기(Infinite M200)를 이용하여 415nm에서 흡광도를 측정하였다. AChE 및 BChE 저해 활성은 nM 타크린 당량(nM tacrine equivalents)으로 나타내었고, 3반복 실험 뒤 통계처리하였다.
2와 같다. H2O2의 처리시간 및 처리농도는 대조군과 비교하여 50% 이내의 생존율을 보이는 농도와 시간으로 설정하였다. H2O2를 통해 산화 스트레스를 가한 PC-12 세포군은 아무 처리를 하지 않은 대조군 대비 유의적으로 높은 약 160%의 산화 스트레스를 유발하였다.
PBS 용액을 이용하여 734nm에서 0.650±0.020의 흡광도로 희석한 ABTS 용액 980µL와 백년초 추출물 20µL를 혼합하고, 37℃ 에서 10분간 반응 후, 734nm에서 흡광도 감소를 측정하였다.
최종 추출물은 질소가스(N2)를 충전하여 −18°C에 보관하며 사용하였다. 백년초를 독립적으로 3회 반복 추출하였다.
6 mL와 폴린-시오칼토페놀 시약 200µL를 첨가하고 6분 후에 7% (w/v) 탄산소듐(Na2CO3) 용액을 2mL를 첨가하고, 이후 84분 더 정치시킨 후 750nm에서 흡광도를 측정하였다. 백년초의 총페놀 함량은 표준물질로 갈산을 사용하여 표준곡선(standard curve)을 작성한 후 정량 측정하였으며, mg 갈산 당량(gallic acid equivalents,gAE)/100g fresh weight (FW)로 나타내었다.
2mL, 5% (w/v) 아질산소듐(NaNO2) 150µL를 혼합하여 5분간 반응시킨 뒤 10% (w/v) AlCl3 용액을 첨가하여 1분간 더 반응시키고, 1M 수산화소듐(NaOH)을 넣고 혼합하여 510nm에서 흡광도를 측정하였다. 백년초의 총플라보노이드 함량은 표준물질로 카테킨을 이용하여 표준곡선을 작성한 후 정량 측정하였으며, mg 카테킨 당량(catechin equivalents, CE)/100g FW로 나타내었다.
그러나, 아직까지 천연 산화방지제로서의 백년초에 관한 연구와 총페놀 함량, 총플라보노이드 함량, 산화방지능 등 기능성 성분에 대한 정량적 연구가 미흡한 실정이다. 본 연구에서는 제주도에서 자생한 백년초 열매의 총페놀 함량, 총플라보노이드 함량, 산화방지능을 정량적으로 분석하고, 백년초의 in vitro PC-12 신경세포 보호 효과, 그리고 아세틸콜린가수분해효소(acetylcholinesterase, AChE) 및 부틸콜린가수분해효소(butyrylcholinesterase, BChE) 저해 활성능을 평가하였다.
세척한 백년초 열매를 추출용매 100mL 와 혼합 후 2분간 균질기(Polytron PT 2100; Kinematica AG, Littau/Lucerne, Switzerland)로 15,000rpm에서 균질화(homogenization)한 뒤 15분간 초음파 처리하였다.
이어 과산화수소 300µM에 1시간 동안 노출시킨 후 들뜸 480nm, 방출 530nm에서 형광도를 형광측정 마이크로플레이트 판독기(Infinite M200)를 이용하여 측정하였다. 세포 내 산화 스트레스는 대조군과 비교하여 백분율(%)로 나타내었고, 독립적으로 3 반복을 실시하여 측정하였다.
세포 내 산화 스트레스는 배지에 투여한 DCFH-DA가 세포 내로 유입되어 에스테라아제(esterase)의 반응을 통해 2`,7`-dichlorofluorescin (DCFH)의 형태로 전환된 후, 세포 내 산화제(oxidants)와 반응하여 형광 물질인 2`,7`-dichlorofluorescein (DCF)의 생성을 측정하였다. PC-12 세포를 96-well plate에 2×104 cell/well로 분주 후 24시간 동안 배양하였다.
이후 MTT 시약을 첨가하고 4시간이 지난 다음 DMSO를 이용하여 포마잔(formazan)을 용해시켜 마이크로플레이트 판독기(Infinite M200)를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 무독성은 백년초 추출물 무처리군인 대조군(control)의 세포생존율 대비 90% 이상의 생존율을 보인 농도로 설정을 하였다.
세포 생존율은 대조군과 비교하여 백분율(%)로 나타내었다. 세포 생존율 측정은 독립적으로 3반복을 실시하였다.
AAPH (153 mM) 25µL를 추가로 넣은 후 형광측정 마이크로플레이트 판독기(microplate fluorescence reader, Infinite M200, Tecan AustriagmbH,grödig, Austria)을 이용하여 들뜸(excitation)은 485nm, 방출(emission)은 520nm에서 형광도를 90분 동안 매 1분 간격으로 측정하였다. 시간 경과에 따라 백년초 추출물의 산화방지작용에 의한 형광의 감소를 이용하여 곡선아래면적(area under curve)을 계산하고, 산화 방지능은 mg VCE/100g FW로 나타내었다.
이어 과산화수소 300µM에 1시간 동안 노출시킨 후 들뜸 480nm, 방출 530nm에서 형광도를 형광측정 마이크로플레이트 판독기(Infinite M200)를 이용하여 측정하였다.
백년초 추출물을 세포 독성이 없는 최대 농도까지 처리한 후, 산화 스트레스를 유도하기 위해 100µM의 H2O2를 1시간 동안 처리하였다. 이후 MTT 시약을 첨가하고 4시간이 지난 다음 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 대조군과 비교하여 백분율(%)로 나타내었다.
백년초 추출물을 100, 250, 500, 750, 1,000 µg/mL의 농도로 24시간 동안 더 배양을 하였다. 이후 MTT 시약을 첨가하고 4시간이 지난 다음 DMSO를 이용하여 포마잔(formazan)을 용해시켜 마이크로플레이트 판독기(Infinite M200)를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 무독성은 백년초 추출물 무처리군인 대조군(control)의 세포생존율 대비 90% 이상의 생존율을 보인 농도로 설정을 하였다.
본 실험에 사용한 PC-12 신경세포주는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)의 것을 사용하였다. 세포배양을 위해 사용한 배지는 RPMI 1640 배지에 10% 열불활성 FBS, 100 unit/mL 페니실린, 100µg/mL 스트렙토마이신을 첨가하여 사용하였고, 37℃에서 5% CO2를 유지하는 배양기(AutoFlow NU-4750 Water Jacket CO2 Incubator; Nuaire, Plymouth, MN, USA)에서 배양하여 사용하였다.
본 실험에서 사용된 백년초는 제주도 제주시 한림읍에서 2011년 겨울에 수확한 것을 사용하였다. 추출은 80% (v/v) 물-에탄올 혼합용매를 사용하였다.
세포배양을 위해 사용한 배지는 RPMI 1640 배지에 10% 열불활성 FBS, 100 unit/mL 페니실린, 100µg/mL 스트렙토마이신을 첨가하여 사용하였고, 37℃에서 5% CO2를 유지하는 배양기(AutoFlow NU-4750 Water Jacket CO2 Incubator; Nuaire, Plymouth, MN, USA)에서 배양하여 사용하였다.
본 실험에서 사용된 백년초는 제주도 제주시 한림읍에서 2011년 겨울에 수확한 것을 사용하였다. 추출은 80% (v/v) 물-에탄올 혼합용매를 사용하였다. 세척한 백년초 열매를 추출용매 100mL 와 혼합 후 2분간 균질기(Polytron PT 2100; Kinematica AG, Littau/Lucerne, Switzerland)로 15,000rpm에서 균질화(homogenization)한 뒤 15분간 초음파 처리하였다.
데이터처리
모든 추출 및 정량 분석은 3회 반복하였으며, 통계분석은 SAS 통계프로그램(SAS version 9.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하였다. 평균값의 차이를 검증하기 위하여 분산(ANOVA) 분석을 실시하였고, p<0.
평균값의 차이를 검증하기 위하여 분산(ANOVA) 분석을 실시하였고, p<0.05 유의수준에서 던컨시험 (Duncan’s multiple range test)으로 유의차를 검증하였다.
이론/모형
산화방지능 측정은 ABTS, DPPH, ORAC법을 이용하였다. ABTS법을 이용한 산화방지능은 Kim 등의 방법(17)에 따라 다음과 같이 측정하였다. 1.
AChE 저해 활성은 96-well plate를 이용한 AChE 저해법과 BChE 저해법을 통해 실험하였다. ATCI와 BTCC가 각각 AChE와 BChE의 기질로, DTNB가 발색 시약으로 사용되었다.
H2O2로 유도한 산화 스트레스 하에서, 세포독성을 보이지 않는 백년초 추출물의 신경세포 PC-12 보호 효과를 MTT법을 이용하여 평가하였다(Fig. 1). 백년초 추출물은 1,000 mg/mL까지 세포독성을 보이지 않았다(Fig.
ORAC법을 이용한 산화방지능은 Huang 등(19)의 방법을 이용하였다. 시료 25µL에 81.
Effect of 80% (v/v) aqueous ethanol extract of the Opuntia ficus-indica var. saboten ripe fruits on intracellular oxidative stress in neuronal PC-12 cells using the DCFH-DA assay.
Cytotoxicity (A) and protective effect (B) of 80% (v/v) aqueous ethanol extract of the Opuntia ficus-indica var. saboten ripe fruits on neuronal PC-12 cells against oxidative stress induced with H2O2 using the MTT assay.
산화방지능 측정은 ABTS, DPPH, ORAC법을 이용하였다. ABTS법을 이용한 산화방지능은 Kim 등의 방법(17)에 따라 다음과 같이 측정하였다.
신경세포주인 PC-12 세포에 대한 백년초 추출물의 무해한 농도의 결정 및 신경세포 보호능 평가를 위해서 MTT법을 이용하였다. 세포독성 평가를 위해서 96-well plate에 PC-12 세포를 2.
총플라보노이드 함량은 Kim 등(16)의 방법을 사용하여 측정하였다. 총플라보노이드 함량은 백년초 추출물 0.
성능/효과
하지만 농도 별로 백년초 추출물을 처리한 실험군에서는 농도 의존적으로 세포 내 산화 스트레스를 감소시켰다. 1,000 mg/L 농도의 백년초 추출물 처리군에서는 대조군과 유의적 차이가 없는 세포 생존율을 보였다. 본 연구와 유사하게 PC-12 신경 세포 내 산화 스트레스가 제주산 백년초의 에틸아세테이트 분획물에 의해서 농도 의존적으로 감소하였다(28).
3A). 백년초 추출물 처리 농도인 15.6, 62.5, 250, 1,000 mg/mL에서 Fig. 3A을 이용해 얻은 AChE 저해 능은 각각 26.1, 34.5, 39.0, 39.3 nM 타크린 당량이었으며(Fig.3B), 이는 백년초가 AChE 활성을 저해한다는 것을 의미한다.
4B). 백년초 추출물이 AChE 활성을 저해하는 것과 마찬가지로 BChE를 저해하는 것으로 나타났다. 이는 백년초를 활용하여 신경전달물질인 아세틸콜린과 같은 콜린기반 에스테르(choline-based esters)를 분해하는 효소인 BChE와 AChE의 활성을 저해하는 억제제(inhibitor) 개발에 활용할 수 있을 것으로 생각한다.
2 mg CE이었다. 백년초(100g FW)의 산화방지능은 ABTS, DPPH, ORAC법에서 각각 381.2, 298.2, 3,219.9 mg VCE였다. 백년초 추출물은 H2O2의 산화 스트레스로부터 세포 내 산화 스트레스를 감소시켜 신경세포 PC-12의 생존율을 농도의존적으로 증가시켰다.
ABTS, DPPH, ORAC법을 이용한 백년초의 산화방지능 측정결과는 Table 1과 같다. 백년초의 ABTS를 이용한 산화방지능은 381.2mg VCE/100g FW이었다(Table 1). 흰색, 노란색, 빨간색의 과육을 보이는 여러 품종의 O.
ficus-indica 열매의 약 45%를 차지하는 부산물(by-products)은 높은 총페놀 함량을 보였으며, Alfajayucan(green tuna) 품종이 Pelon Rojo(red tuna) 품종보다 유의적으로 높은 총페놀 함량을 보였다 (23). 이들 연구 결과는 본 연구의 백년초 열매의 총페놀 함량보다 낮은 총페놀 함량을 보였다. 총페놀 함량이 서로 상이한 것은 백년초 부위별, 산지별 차이에서 발생하기 때문으로 여겨진다.
후속연구
또한, 백년초 추출물은 AChE 및 BChE 활성을 저해하였다. 본 연구 결과로부터 백년초의 세포 내 산화 스트레스 감소에 의한 신경 세포 보호능과 AChE 및 BChE 저해능이 확인 되었으며, 이러한 결과를 통해 향후 백년초를 이용한 기능성 제품 및 여러 가공품 개발에 활용이 가능할 것으로 기대한다.
백년초 추출물이 AChE 활성을 저해하는 것과 마찬가지로 BChE를 저해하는 것으로 나타났다. 이는 백년초를 활용하여 신경전달물질인 아세틸콜린과 같은 콜린기반 에스테르(choline-based esters)를 분해하는 효소인 BChE와 AChE의 활성을 저해하는 억제제(inhibitor) 개발에 활용할 수 있을 것으로 생각한다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
백년초는 어떤 효능을 가지고 있는가?
우리나라에서는 제주도, 신안군 등 남해안 지방에 자생하고 있으며, 현재 제주도를 중심으로 백년초의 재배가 증가하고 있다. 백년초는 콜레스테롤 저하, 혈당저하능, 항당뇨, 항균활성, 상처치유, 항염증 등의 효능이 알려져 있다(9-11). 또한, 백년초의 다양한 추출물의 산화방지능 연구(10,12), 사과 갈변억제 연구(13), 소세지 제조시 백년초 분말의 아질산염 대체에 의한 품질특성에 관한 연구(14) 등이 보고되었다.
활성산소에 의한 지속적인 산화스트레스는 어떤 질병과 관련있는가?
초과산화물(superoxide), 과산화수소, 일중항산소, 하이드록실 라디칼(hydroxyl radical) 등과 같은 활성산소(reactive oxygen species, ROS)는 살아있는 세포의 정상적인 신진대사를 통해 생성된다(1). 활성산소에 의한 지속적인 산화 스트레스(oxidative stress) 는 퇴행성 신경질환(2-5), 천식(6), 만성 폐쇄성 폐질환(7) 같은 많은 병리학적 조건에 관여하는 것으로 알려져 있다. 산화 스트레스를 유발하는 활성산소를 효율적으로 제거할 수 있는 천연의 기능성 생리활성물질을 이용하여 암, 치매 등과 같은 생활습관병을 예방할 필요가 있다.
식물체 2차 대사산물의 페놀화합물 중 타닌은 어떤 특징을 가지고 있는가?
식물체 2차 대사산물(secondary metabolites)의 하나인 페놀화합물(phenolic compounds)은 다양한 구조와 분자량을 가진다. 타닌 (tannin)과 같은 페놀화합물은 아밀라아제(amylase) 등의 단백질과 결합하고, 철, 아연 등의 무기질을 킬레이팅하는 항영양소(antinutrients)로도 작용을 하지만, 하이드록실기(-OH)를 갖는 페놀화합 물의 구조적 특성 때문에 산화방지능 등의 다양한 생리활성을 갖는다(8). 식물의 꽃, 열매, 씨, 잎, 줄기에 고루 분포하는 플라보노이드(flavonoid)는 병원균 억제, 자외선 차단 등에 대한 효과를 갖는다.
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