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문제 정의
- 하지만 蒼朮의 당뇨병 개선 효과에 대한 연구는 아직 보고되지 않았다. 따라서 본 연구에서는 蒼朮을 투여하여 제 2형 당뇨병이 유발된 흰쥐에 미치는 영향을 알아보았다.
- 따라서 본 연구에서는 제 2형 당뇨병이 유발된 흰쥐에서 체중 및 식이섭취량 변화, 혈당 변화, 인슐린 저항성 지표(HOMA-IR) 변화, 췌장 β세포의 병리조직학적 변화, 인슐린 저항성 변화를 통해 제 2형 당뇨병에 관한 蒼朮의 효과를 평가하였다.
가설 설정
- 3. 蒼朮은 췌장 β세포의 손상을 개선시켰다.
제안 방법
- 제 2형 당뇨 유발을 위해 4주간의 고지방식이 섭취 후 저농도의 streptozotocin(STZ, Sigma Aldrich, S1030, USA)을 투여하였다. 16시간 절식 후 35 mg/kg b.w.의 STZ을 0.1 Mcitrate buffer (pH 4.5)에 희석하여 복강 주사하였으며 정상군에는 0.1 M citrate buffer (pH 4.5)만 복강주사하였다. 당뇨 유발을 확인하기 위해 72시간 후16시간 동안 절식시키고 꼬리에서 혈액을 채취하여 혈당측정검사지(Accu-chek, Roche Diagnostics, Germany)를 이용해 혈당을 측정하였다.
- 4주간의 실험이 끝난 후 제2형 당뇨 유발 흰쥐의 공복혈당을 측정하였다. 혈당 측정 결과, 음성 대조군의 혈당은 334.
- H&E 염색을 통하여 제 2형 당뇨 유발 흰쥐에서의 췌장의 β세포 변화와 약물 투여로 인한 개선 효과를 관찰하였다.
- PPAR-γ, GLUT4의 단백질 발현량을 관찰하기 위하여 대퇴사두근을 채취하여 분석하였다.
- 蒼朮이 제 2형 당뇨병 흰쥐의 체중 및 식이섭취량 변화, 혈당 변화, 인슐린 저항성 지표(HOMA-IR)변화, 췌장 β세포의 병리조직학적 변화, IRS-1와 p-IRS-1, PPAR-γ, GLUT4를 통한 인슐린 저항성 변화에 미치는 효과를 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 5)만 복강주사하였다. 당뇨 유발을 확인하기 위해 72시간 후16시간 동안 절식시키고 꼬리에서 혈액을 채취하여 혈당측정검사지(Accu-chek, Roche Diagnostics, Germany)를 이용해 혈당을 측정하였다. 이 때 공복혈당이 200 mg/dL 이상인 동물을 당뇨가 유발된 것으로 보고 선별하여 실험에 사용하였다.
- 따라서 IRS-1과 PI3K의 활성화는 인슐린 저항성 개선에 매우 중요한 역할을 하고 있다34). 본 실험에서는 인슐린 민감도를 확인하기 위하여 IRS-1과 p-IRS-1의 비율을 관찰하였다. 蒼朮 투여군의 비율은 음성 대조군에 비해 유의한 증가 효과를 나타내었다.
- 본 실험은 흰쥐에게 4주간 고지방 식이를 섭취시키고 저농도 STZ을 투여하여 제 2형 당뇨병을 유발시킨 이후 진행되었다. 본 실험에서 사용된 STZ는 췌장 β세포만 선택적으로 파괴하여 인슐린 분비저하를 유도해 고혈당 상태를 유발하는 약물이다22).
- 수집된 혈액에서 혈당측정검사지를 이용해 혈당을 측정하였고, 나머지는 14,000 rpm에 30분간 원심분리하여 혈청을 분리한 후 –80 ℃에 보관하면서 혈청분석을 위해 사용되었다.
- 실험군은 6마리씩 정상군, 음성 대조군(control group), 양성 대조군(metformin group), 창출 투여군(AJ group)으로 나누었다. 약물 투여는 STZ을 주사한지 1주일 후부터 투여하기 시작하여 총 4주간 진행되었다.
- . 실험동물은 1주일의 적응기가 끝난 후 군당 6마리씩 4군으로 나누었다. 정상군(normal group)으로 설정된 6마리를 제외한 실험동물은 실험기간 동안 60% 고지방식이(fat 60%, carbohydrate 28%, protein 14% 포함)를 섭취하였고, 정상군은 일반식이를 섭취하였다.
- 실험의 마지막에 모든 실험동물들은 16시간 절식하였고 심장천자법(cardiac puncture)를 통해 혈액을 수집하였다. 수집된 혈액에서 혈당측정검사지를 이용해 혈당을 측정하였고, 나머지는 14,000 rpm에 30분간 원심분리하여 혈청을 분리한 후 –80 ℃에 보관하면서 혈청분석을 위해 사용되었다.
- 실험군은 6마리씩 정상군, 음성 대조군(control group), 양성 대조군(metformin group), 창출 투여군(AJ group)으로 나누었다. 약물 투여는 STZ을 주사한지 1주일 후부터 투여하기 시작하여 총 4주간 진행되었다. 정상군과 음성 대조군에는 식염수를, 양성 대조군에는 metformin (200 mg/kg b.
- 이에 본 실험에서는 PPAR-γ 및 GLUT4의 발현량을 관찰하였다.
- 인슐린 저항성의 개선 효과를 확인하기 위하여 흰쥐의 간과 대퇴사두근을 채취하여 단백질 발현양을 확인하였다. 각 조직은 protease inhibitor가 포함된 RIPA buffer를 10 mg당 1 mL 넣어 homogenizer를 이용하여 단백질을 추출하였다.
- 인슐린 저항성의 변화를 관찰하기 위하여 간에서 IRS-1, p-IRS-1의 단백질 발현량을 관찰하였다. 제2형 당뇨 유발로 인하여 음성 대조군이 정상군에 비해 IRS-1의 인산화가 감소하였다.
- 인슐린은 채취된 혈청을 ultra sensitive rat insulin ELISA kit (Morinaga Institute of Biological Science, Yokohama, Japan)를 사용하여 측정하였다.
- 실험동물은 1주일의 적응기가 끝난 후 군당 6마리씩 4군으로 나누었다. 정상군(normal group)으로 설정된 6마리를 제외한 실험동물은 실험기간 동안 60% 고지방식이(fat 60%, carbohydrate 28%, protein 14% 포함)를 섭취하였고, 정상군은 일반식이를 섭취하였다. 제 2형 당뇨 유발을 위해 4주간의 고지방식이 섭취 후 저농도의 streptozotocin(STZ, Sigma Aldrich, S1030, USA)을 투여하였다.
- 약물 투여는 STZ을 주사한지 1주일 후부터 투여하기 시작하여 총 4주간 진행되었다. 정상군과 음성 대조군에는 식염수를, 양성 대조군에는 metformin (200 mg/kg b.w.)을, 창출투여군에는 蒼朮(100 mg/kg b.w.)를 매일 1회 경구투여하였다. 모든 실험동물의 체중과 식이 섭취량은 주 3회 주기적으로 측정되었다.
- 정상군(normal group)으로 설정된 6마리를 제외한 실험동물은 실험기간 동안 60% 고지방식이(fat 60%, carbohydrate 28%, protein 14% 포함)를 섭취하였고, 정상군은 일반식이를 섭취하였다. 제 2형 당뇨 유발을 위해 4주간의 고지방식이 섭취 후 저농도의 streptozotocin(STZ, Sigma Aldrich, S1030, USA)을 투여하였다. 16시간 절식 후 35 mg/kg b.
- 제작된 절편은 다시 xylene과 alcohol을 이용하여 탈파라핀 및 탈수과정을 거친 다음 hematoxylin & eosin (H&E) 염색하고 함수시킨 후 광학현미경으로 관찰하였다.
- 파라핀 포매기를 이용하여 파라핀 블록을 제작하고 이를 조직절편기(microtome)으로 박절하여 5 μm 두께의 절편을 제작하였다.
- 흰쥐의 췌장을 적출하여 10% formalin 용액에 고정한 다음 자동조직과정 처리기를 이용하여 탈수하였다. 파라핀 포매기를 이용하여 파라핀 블록을 제작하고 이를 조직절편기(microtome)으로 박절하여 5 μm 두께의 절편을 제작하였다.
대상 데이터
- 200 g의 蒼朮(Atractylodes japonica Koidz.)을 플라스크에 넣어 2000 ml의 30% 에탄올과 함께 24시간 냉침하고 추출액을 여과지로 여과하였다. 걸러진 여과액은 회전식 감압농축기를 통해 농축한 후 동결건조하여 30.
- 실험동물은 웅성 Sprague-Dawley계 5주령 흰쥐(150-180 g)를 라온바이오(Youngin, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 사육실 온도는 22 ± 2 ℃, 습도는 50 ± 10%를 유지하였고, 조명은 12시간 주기로 밤낮이 교대되었다.
- 당뇨 유발을 확인하기 위해 72시간 후16시간 동안 절식시키고 꼬리에서 혈액을 채취하여 혈당측정검사지(Accu-chek, Roche Diagnostics, Germany)를 이용해 혈당을 측정하였다. 이 때 공복혈당이 200 mg/dL 이상인 동물을 당뇨가 유발된 것으로 보고 선별하여 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 각 군 간의 비교는 one-way analysis of variance (ANOVA)를 시행하였으며, p < 0.05 수준에서 Tukey’s test로 사후 검정하였다.
- 본 실험에서 측정된 모든 실험 결과는 GraphPad PRISM 5 program (ver 2.00, Graphpad software inc., San Diego, USA)를 이용하여 Mean ± S.E.M.으로 계산하였다.
이론/모형
- 그 다음 각 sample에 대한 단백질은 Bradford 정량법을 이용해 40 μg 단백질을 western blot 분석에 사용하였다.
- 제 2형 당뇨 실험 모델 유발은 Chen의 방법을 따라 시행되었다19). 실험동물은 1주일의 적응기가 끝난 후 군당 6마리씩 4군으로 나누었다.
성능/효과
- 1. 蒼朮은 음성대조군에 비하여 혈당량을 유의하게 감소시켰다.
- 2. 蒼朮은 인슐린 저항성 지표인 HOMA-IR의 감소를 나타내었다.
- 4. 蒼朮은 인슐린 저항성을 조절해주는 인자인 PPAR-γ의 발현을 증가시켰다.
- 4주간의 식이섭취량을 측정한 결과, 음성 대조군에서 정상군에 비해 통계적으로 유의한 차이로 감소하는 것으로 관찰되었다(p＜0.05). 그리고 양성 대조군과 창출 투여군에서는 음성 대조군에 대비하여 식이섭취량이 증가하는 것을 관찰할 수 있었고, 통계적으로 유의한 차이를 나타내었다(p＜0.
- 5. 蒼朮은 인슐린 신호전달계에서 핵심적 역할을 수행하는 분자인 IRS-1의 인산화를 증가시켰다.
- PPAR-γ은 정상군에 비해 음성 대조군에서 약간 감소하는 경향을 보였고, 양성 대조군에서는 약간 증가하였다.
- 혈당과 인슐린을 근거하여 인슐린 저항성 지표인 HOMA-IR 확인하기 위하여 일원분산배치한 결과 통계적으로 유의한 차이가 있었다. Tukey의 사후검정을 실시한 결과, 음성 대조군에서 HOMA-IR이 정상군에 비해 55.4% 증가하였고, 양성 대조군과 창출 투여군에서는 음성대조군에 비해 각각 25.2%, 40.2% 감소한 것을 관찰하였다(Fig. 3). 특히 창출 투여군에서는 양성 대조군에 비해 25.
- 본 실험에서는 제 2형 당뇨병을 유발함으로써 흰쥐의 혈당이 상승한 것을 관찰할 수 있었다. 蒼朮 투여군은 혈당 변화에 유의한 감소 효과를 보였다. 蒼朮의 혈당량 강하 작용은 당뇨병 치료에서 가장 중요한 증상을 완화시킨 것이라 볼 수 있으며 따라서 蒼朮은 당뇨병의 치료 약재로 응용할 수 있을 것으로 사료된다.
- 蒼朮 투여군의 PPAR-γ 발현량은 음성 대조군에 비해 유의하게 증가하였다.
- 본 실험에서는 인슐린 민감도를 확인하기 위하여 IRS-1과 p-IRS-1의 비율을 관찰하였다. 蒼朮 투여군의 비율은 음성 대조군에 비해 유의한 증가 효과를 나타내었다. 이것은 蒼朮이 IRS-1의 인산화를 통하여 인슐린 저항성을 개선시켰다는 것을 확인할 수 있으며 나아가 蒼朮이 인슐린 저항성을 조절함으로써 당뇨병 치료의 약재로 응용할 수 있을 것이라 사료된다.
- 05). 그리고 양성 대조군과 창출 투여군에서는 음성 대조군에 대비하여 식이섭취량이 증가하는 것을 관찰할 수 있었고, 통계적으로 유의한 차이를 나타내었다(p＜0.05; Fig. 1B).
- 본 실험에서 蒼朮 투여군의 β세포 형태는 음성대조군에 비해 비교적 원형을 유지하고 있었다.
- 최 등의 연구28)에서 HOMA 수치가 당뇨병 위험도를 평가해 줄 수 있는 중요한 지표임을 보고하였다. 본 실험에서 蒼朮 투여군의 HOMA-IR 수치는 음성 대조군에 비해 감소된 것을 볼 수 있었다. HOMA-IR 수치의 감소는 인슐린 저항성이 감소했다는 것을 의미하며 이는 蒼朮의 투여가 인슐린 저항성을 감소시켜 이에 따른 항당뇨효과를 가지고 있다고 사료된다.
- 본 실험에서도 음성 대조군의 체중이 정상군에 비해 감소한 것을 관찰할 수 있었다. 본 실험에서 체중변화를 관찰한 결과 蒼朮 투여군은 음성 대조군에 비해 유의한 증가 효과를 보였다. 식이섭취량은 음성 대조군이 정상 대조군에 비해 감소되었다.
- 따라서 당뇨병 관리 및 치료에 있어 혈당 조절은 매우 중요한 역할을 한다27). 본 실험에서는 제 2형 당뇨병을 유발함으로써 흰쥐의 혈당이 상승한 것을 관찰할 수 있었다. 蒼朮 투여군은 혈당 변화에 유의한 감소 효과를 보였다.
- . 본 실험에서도 음성 대조군의 체중이 정상군에 비해 감소한 것을 관찰할 수 있었다. 본 실험에서 체중변화를 관찰한 결과 蒼朮 투여군은 음성 대조군에 비해 유의한 증가 효과를 보였다.
- 제2형 당뇨 유발로 인하여 음성 대조군이 정상군에 비해 IRS-1의 인산화가 감소하였다. 양성 대조군과 창출 투여군에서는 음성 대조군보다 통계적으로 유의한 차이를 보이며 발현되었다(p＜0.05; Fig. 5).
- 식이섭취량은 음성 대조군이 정상 대조군에 비해 감소되었다. 양성대조군 및 蒼朮 투여군은 음성 대조군에 비해 식이섭취량이 증가된 것을 관찰할 수 있었다. 이는 흰쥐의 전반적 상태가 개선되면서 식이섭취량이 증가하였고 이에 따라 체중이 증가한 것으로 보인다.
- GLUT4는 제 2형 당뇨 유발군에서 모두 감소하였다. 음성 대조군은 정상군에 비해 통계적으로 유의한 차이로 감소하였고(p＜0.05), 창출 투여군은 음성 대조군에 비해 증가하는 경향을 보였다(Fig. 6).
- 이상의 결과를 통해 蒼朮의 혈당량 감소, HOMA-IR 감소, β세포 손상 방지 및 회복, 인슐린저항성 감소 등을 통한 제 2형 당뇨병 개선 효과를 관찰하였다.
- 제 2형 당뇨 유발 흰쥐에서 체중 변화를 관찰한 결과, 당뇨가 유발되지 않은 정상군에서는 4주간 지속적으로 체중이 증가한 반면, 당뇨가 유발된 음성 대조군에서는 체중이 지속적으로 감소하였고 2-4주에서 통계적으로 유의한 차이를 나타내었다(p＜ 0.05). 양성대조군은 실험 시작 전보다 체중이 약간 감소하였고 뚜렷한 차이는 나타나지 않았다.
- 인슐린 저항성의 변화를 관찰하기 위하여 간에서 IRS-1, p-IRS-1의 단백질 발현량을 관찰하였다. 제2형 당뇨 유발로 인하여 음성 대조군이 정상군에 비해 IRS-1의 인산화가 감소하였다. 양성 대조군과 창출 투여군에서는 음성 대조군보다 통계적으로 유의한 차이를 보이며 발현되었다(p＜0.
- PPAR-γ은 정상군에 비해 음성 대조군에서 약간 감소하는 경향을 보였고, 양성 대조군에서는 약간 증가하였다. 창출 투여군은 음성 대조군에 비해 통계적으로 유의하게 증가하였다(p＜0.05; Fig. 6). GLUT4는 제 2형 당뇨 유발군에서 모두 감소하였다.
- 양성대조군은 실험 시작 전보다 체중이 약간 감소하였고 뚜렷한 차이는 나타나지 않았다. 창출 투여군은 초기에 체중이 약간 감소하였다가 다시 증가하여 결과적으로 실험 시작 전보다 체중이 증가하였고, 2주와 4주에서 통계학적 유의한 차이를 나타내었다(p＜0.05; Fig. 1A).
- 혈당 측정 결과, 음성 대조군의 혈당은 334.8±36.3 mg/dL로 정상군의 72.5 ±5 mg/dL에 비해 유의하게 증가하였다(p＜0.05).
- 혈당과 인슐린을 근거하여 인슐린 저항성 지표인 HOMA-IR 확인하기 위하여 일원분산배치한 결과 통계적으로 유의한 차이가 있었다. Tukey의 사후검정을 실시한 결과, 음성 대조군에서 HOMA-IR이 정상군에 비해 55.
후속연구
- 또한 IRS-1의 인산화를 증가시켰으며 PPAR-γ의 발현 역시 증가시켰다. 결론적으로 蒼朮은 인슐린 저항성, 혈당량 등을 개선하는 천연물 항당뇨제로 응용할 가치가 있다고 평가된다. 따라서 용량별 효능 평가 및 투여 기간에 따른 효능에 관하여 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 따라서 蒼朮은 인슐린 저항성, 혈당량 등을 개선하는 효능을 나타내었으며 천연물 항 당뇨제로 응용할 수 있을 것이라 사료된다.
- 결론적으로 蒼朮은 인슐린 저항성, 혈당량 등을 개선하는 천연물 항당뇨제로 응용할 가치가 있다고 평가된다. 따라서 용량별 효능 평가 및 투여 기간에 따른 효능에 관하여 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 따라서 蒼朮이 제 2형 당뇨병이 유발된 흰쥐의 체중 및 식이섭취량 조절에 관여한다고 사료된다. 또한 제 2형 당뇨병의 회복과 체중증가가 서로 연관되어 있을 것이며 제 2형 당뇨병의 회복 효과 및 체중 증가에 관해서 추가적 연구가 이루어질 필요가 있다.
- 蒼朮 투여군의 비율은 음성 대조군에 비해 유의한 증가 효과를 나타내었다. 이것은 蒼朮이 IRS-1의 인산화를 통하여 인슐린 저항성을 개선시켰다는 것을 확인할 수 있으며 나아가 蒼朮이 인슐린 저항성을 조절함으로써 당뇨병 치료의 약재로 응용할 수 있을 것이라 사료된다.
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