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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 여주열매에서 열수 및 에탄올 추출을 실시하여 얻은 추출물에 대해 기능성화장품소재로서의 가능성을 시험하였다. 여주열매 추출물의 폴리페놀 함량을 측정하였고, 화장품소재의 안전성시험, 유효성시험(미백, 주름개선, 항산화효과 시험) 및 안정성시험(액제와 로션의 온도 안정성시험)을 실시하여 기능성화장품소재로의 응용 가능성을 살펴보았다.
- 본 연구에서는 안전하고 효능적인 소재의 개발을 위해 여주열매로부터 기능성 화장품소재의 가능성을 검토하였다. 여주는 박과에 속하는 한해살이 덩굴성 풀이며, 여러 개의 가지가 분지되어 있고 가늘고 보드라운 털이 있다[6].
- 본 연구에서는 여주열매 추출물을 함유한 액제와 로션제형의 기능성화장품의 시제품을 제작하였다. 액제는 여주 추출물 5%, rose water 40%, 히아루론산 2%, 글리세린 3%와 정제수 50%로 구성되 었으며, 로션제형은 여주 추출물 1%, 코코넛유 12.
- 본 연구에서는 여주열매의 열수 및 에탄올 추출물에서 기능성 화장품 소재로서의 가능성을 검토하였다. 여주열매의 열수 및 에탄올 추출물은 유효성분으로 폴리페놀의 함량이 각각 69.
- 이에 대한 대안으로 가장 널리 사용되는 안전성시험이 세포독성시험인 MTT assay이다. 이 시험은 살아있는 세포(주로 mouse 유래의 melanoma cell을 사용)를 이용하여 추출물이 세포를 사멸시키는 정도를 평가하는 시험이다.
제안 방법
- B16 F10 mouse melanoma cell(한국세포주은행)을 1×104 cell/ml 씩 분주하여 24시간 배양 후 100~1,000 µl/ml의 농도로 희석한 추출물의 시료가 첨가된 새배지로 교체하고 다시 24시간동안 배양하였다.
- 100 µl의 DPPH(α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl, Sigma, USA)에 200 µl 추출물을 실온에서 빛을 차단한 후 20분간 반응시켰다. 그 후 ELISA leader(Synergy HT, BIOTEK, USA)로 517 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 항산화능을 구하였다.
- 여주에는다양한유효성분이함유되어있는것으로알려져있으며그 중 대표적인 성분들이 polyphenol계 물질들이다. 본 연구에서는 여주열매 추출물의 유효성분 분석의 일환으로 Folin-Denis법을 응용하여 폴리페놀의 농도를 측정하였다. 여주열매의 열수추출물은 69.
- 따라서 대부분의 화장품은 제형개발 완료 후 일정온도 조건에서 보관하면서 화장품의 상태변화를 관찰하는 안정성 시험이 실시되어지고 있다. 본 연구에서는 온도 안정성 시험으로 25 ℃의 조건에서 28일간 액제와 로션제형의 화장품에 대해 pH, 점도 및 외관(상분리, 색상)의 변화를 관찰하였다.
- 실험시 시료의 농도는 증류수에 희석하여 100% , 50%, 35%, 20% 및 10%의 농도로 시험에 사용되었으며, 이를 여주의 건조농도로 환산하면 각각 1,000, 500, 350, 200 및 100 µg/ml에 해당된다.
- 여주의 열수 추출물은 다음과 같이 얻어졌다[9,10]. 여주 400 g에 정제수 800 ml을 더하여 약 100 ℃에서 4시간 동안 열을 가하여 40%의 중량이 되도록 1회 열수 추출하였다. 이 추출물을 200메쉬(0.
- 여주의 에탄올 추출물은 다음과 같이 수득하였다. 여주 400 g을 800 ml의 70% 에탄올에 더하여 실온 25℃에서 4시간 동안 담구어 110%의 중량이 되도록 1회 에탄올 추출하였다. 이 추출물을 200메쉬 여과 포를 이용하여 여과한 후 동결건조하여 사용하였다.
- 여주 열수 및 에탄올 추출물에 대해 세포독성을 평가한 결과가 Fig. 1에 나타나 있으며, 대조군으로 화장품소재로 널리 사용되는 비타민 C와 비교하였다. 100~1,000 µg/ml 범위의 농도에서 여주 열수 추출물 및 에탄올 추출물에서 세포독성이 전혀 나타나지 않았다.
- 따라서 본 연구에서는 여주열매에서 열수 및 에탄올 추출을 실시하여 얻은 추출물에 대해 기능성화장품소재로서의 가능성을 시험하였다. 여주열매 추출물의 폴리페놀 함량을 측정하였고, 화장품소재의 안전성시험, 유효성시험(미백, 주름개선, 항산화효과 시험) 및 안정성시험(액제와 로션의 온도 안정성시험)을 실시하여 기능성화장품소재로의 응용 가능성을 살펴보았다.
- 여주추출물이 함유된 액(solution)과 로션(lotion) 제형의 화장품을 제조하여 온도 안정성 시험을 실시하였다. 액은 여주 추출물 5%, rose water 40%, 히아루론산 2%, 글리세린 3% 와 정제수 50%로 구성되었으며, 로션은 여주 추출물 1%, 코코넛유 12.
- 5% 및 정제수 65%로 이루어져 있다. 온도 안정성 시험으로 25 ℃의 조건에서 28일간 액과 로션제형의 화장품에대해 pH, 점도및외관(상분리, 색상)의 변화를 관찰하였다. 점도는 Brookfield 점도계(DV-1, USA)를 사용하였으며, 액제는 S63 spindle, 로션은 S64 spindle을 이용하여 60 rpm 속도에서 30초간 측정하였다.
- 화장품소재의 안전성시험으로 세포독성시험인 MTT assay가 사용되었다. 정량은 Mosmann 방법을 변형하여 측정하였다[12]. B16 F10 mouse melanoma cell(한국세포주은행)을 1×104 cell/ml 씩 분주하여 24시간 배양 후 100~1,000 µl/ml의 농도로 희석한 추출물의 시료가 첨가된 새배지로 교체하고 다시 24시간동안 배양하였다.
대상 데이터
- 본 실험에서 사용한 여주는 경남 함양의 농장에서 구입하였으며, 세척한 후 토막내어 껍질, 열매 속, 씨를 모두 포함하여 실험 재료로 사용하였다. 여주의 열수 추출물은 다음과 같이 얻어졌다[9,10].
- 본 연구에서는 여주열매 추출물을 함유한 액제와 로션제형의 기능성화장품의 시제품을 제작하였다. 액제는 여주 추출물 5%, rose water 40%, 히아루론산 2%, 글리세린 3%와 정제수 50%로 구성되 었으며, 로션제형은 여주 추출물 1%, 코코넛유 12.5%, sweet almond oil 12.5%, 왁스 5.5%, 방부제 3.5% 및정제수 65%로이루어져있다.
- 3에 나타나 있다. 양성 대조군으로는 주름개선 화장품소재로 널리 사용되는 adenosine과 비교되었다. 열수 및 에탄올 추출물은 elastase 억제효과가 100~1,000 µg/ml 범위에서 농도 의존적으로 증가하였으며, 에탄올 추출물이 열수 추출물보다 높은 효과를 보여주었다.
데이터처리
- 각 실험결과는 3회 반복 측정되었으며 평균±표준편차로 나타내었다.
이론/모형
- 본 연구에서 여주열매 열수 및 에탄올 추출물의 주름개선효과가 elastase 억제효과시험(elastase inhibition assay)으로 평가되었으며, 그 결과가 Fig. 3에 나타나 있다. 양성 대조군으로는 주름개선 화장품소재로 널리 사용되는 adenosine과 비교되었다.
- 본 연구에서는 항산화효과시험으로 DPPH를 사용한 자유전자제거효과(DPPH free radical scavenging assay)를 사용하였다. 이 시험은 소재의 항산화효과를 평가하는 여러 방법 중 가장 널리 사용되는 시험법이다.
- 주름개선효과시험은 elastase 억제효과시험(elastase inhibition assay)를 이용하여 수행되었다[15]. 0.
- 여주 추출물의 활성성분에 대한 농도측정을 위해 폴리페놀의 함량이 측정되었다. 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법을 응용하여 다음과 같이 측정하였다[11]. 추출물 200 µl와 Folin-Denis 시액 200 µl를 혼합하고 실온에서 3분간 반응시킨 후, 2 M Na2CO3 400 µl와 증류수 200 µl를 용액에 첨가하고 실온에서 30분간 반응시켰다.
- 항산화효과 시험은 DPPH free radical-scavenging assay로 측정하였다[16]. 100 µl의 DPPH(α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl, Sigma, USA)에 200 µl 추출물을 실온에서 빛을 차단한 후 20분간 반응시켰다.
- 화장품소재의 안전성시험으로 세포독성시험인 MTT assay가 사용되었다. 정량은 Mosmann 방법을 변형하여 측정하였다[12].
성능/효과
- 500 µg/ml의 농도에서 여주열매의 열수 추출물, 에탄올 추출물은 각각 40%, 52%의 억제율을 보여주었다.
- 500 µg/ml의 농도에서 여주열매의 열수 추출물, 에탄올 추출물은 각각 42%, 55%의 억제율을 보여주었다.
- 500 µg/ml의 농도에서 여주열매의 열수추출물, 에탄올 추출물은 각각 50%, 31%의 억제율을 보여주었다.
- 여주열매 열수 및 에탄올 추출물은 모두 농도 의존적으로 DOPA 산화억제효과가 증가하였으며, 에탄올 추출물의 DOPA 산화억제효과는 대조군인 arbutin 보다 우수하였다. 그리고 tyrosinase 억제효과와는 달리 에탄올 추출물이 열수 추출물보다 높은 억제효과를 보여주었다. 500 µg/ml의 농도에서 여주열매의 열수 추출물, 에탄올 추출물은 각각 42%, 55%의 억제율을 보여주었다.
- 또한 이 기간 동안 외관을 관찰한결과 상분리, 색상의 변화 등이 관찰되지 않았다. 따라서 5% 여주열매 추출물이 함유된 액제는 우수한 안정성을 나타내었다.
- 여주열매 추출물을 함유한 액제 및 로션제의 온도 안정성 시험결과, 액제는 28일 동안 pH, 점도, 외관의 변화가 안정적이었으나 로션 제형의 경우 점도의 변화가 심하여 제형의 보완이 필요한 것으로 나타났다. 따라서 여주열매의 열수 및 에탄올 추출물은 미백 또는 주름개선 기능성 화장품소재로서 높은 가능성을 보여주었다.
- 5%의 건실한 성장을 하였다[1]. 또한 화장품은 한류의 영향을 가장 크게 수혜받는 품목으로 화장품 수출은 8,915억원으로 전년 대비 29.2%가 증가하는 높은 신장세를 보이고 있다. 최근 급격한 화장품 시장의 확대에 발 맞추기 위해 많은 화학, 식품, 의약품 분야의 업체들이 화장품 분야에 새로이 진출하고 있다.
- 여주열매의 열수 및 에탄올 추출물은 세포독성시험(안전성시험) 결과, 100~1,000 µg/ml 범위의 농도에서 모두 세포독성을 전혀 보이지 않았다. 미백효과 시험 결과 tyrosinase 억제능은 대조군인 arbutin 보다는 다소 낮았으나, DOPA 산화억제효과는 arbutin 보다 우수하였고 특히 여주열매 열수 추출물의 억제효과가 뛰어났다. 주름개선 효과는 elastase 억제효과로 평가되었으며 열수 및 에탄올 추출물은 대조군인 adenosine 보다는 다소 떨어졌으나 농도가 증가할수록 비슷한 수치를 보여주었다.
- 여주 추출물 중에서는 에탄올 추출물이 열수 추출물보다 항산화능이 우수하였고, 500 µg/ml의 농도에서 여주열매의 열수 추출물, 에탄올 추출물은 각각 38%, 62%의 억제율을 보여주었다.
- 여주열매 열수 및 에탄올 추출물은 모두 농도 의존적으로 DOPA 산화억제효과가 증가하였으며, 에탄올 추출물의 DOPA 산화억제효과는 대조군인 arbutin 보다 우수하였다. 그리고 tyrosinase 억제효과와는 달리 에탄올 추출물이 열수 추출물보다 높은 억제효과를 보여주었다.
- 여주열매 추출물의 항산화능은 대조군인 비타민 C보다는 낮았으나, 500 µg/ml의 농도에서 여주열매의 열수추출물, 에탄올추출물은 각각 38%, 62%의 비교적 우수한 억제율을 보여주었다. 여주열매 추출물을 함유한 액제 및 로션제의 온도 안정성 시험결과, 액제는 28일 동안 pH, 점도, 외관의 변화가 안정적이었으나 로션 제형의 경우 점도의 변화가 심하여 제형의 보완이 필요한 것으로 나타났다. 따라서 여주열매의 열수 및 에탄올 추출물은 미백 또는 주름개선 기능성 화장품소재로서 높은 가능성을 보여주었다.
- 여주열매 추출물의 항산화능은 대조군인 비타민 C보다는 낮았으나, 500 µg/ml의 농도에서 여주열매의 열수추출물, 에탄올추출물은 각각 38%, 62%의 비교적 우수한 억제율을 보여주었다.
- 대조군으로 비타민 C가 이용되었는데, 비타민 C는 매우 우수한 항산화능으로 잘알려져 있는 물질이나, 화장품으로 사용시 쉽게 분해되어 안정성 (stability)에 문제가 있는 소재이다. 여주열매 추출물의 항산화능은 대조군인 비타민 C보다는 낮았으나, 추출물에 대해 농도 의존적으로 증가하였다. 여주 추출물 중에서는 에탄올 추출물이 열수 추출물보다 항산화능이 우수하였고, 500 µg/ml의 농도에서 여주열매의 열수 추출물, 에탄올 추출물은 각각 38%, 62%의 억제율을 보여주었다.
- 여주열매 추출물의 효력시험으로 항산화효과, 미백효과 및 주름 개선 효과가 평가되었다. 국내 화장품법상 기능성화장품은 미백, 주름개선 및 자외선차단효과 만을 인증하고 있다.
- 여주열매의 열수 및 에탄올 추출물은 세포독성시험(안전성시험) 결과, 100~1,000 µg/ml 범위의 농도에서 모두 세포독성을 전혀 보이지 않았다.
- 여주열매의 열수 및 에탄올 추출물은 유효성분으로 폴리페놀의 함량이 각각 69.45±0.07 mg/g, 70.87±0.06 mg/g로 높은 농도를 나타내었다.
- 열수 및 에탄올 추출물은 elastase 억제효과가 100~1,000 µg/ml 범위에서 농도 의존적으로 증가하였으며, 에탄올 추출물이 열수 추출물보다 높은 효과를 보여주었다.
- 28일간의 안정성시험 결과 pH는 약산성의 안정한 상태를 유지하였다. 점도의 경우 시간이 경과함에 따라 점차 증가하는 양상을 보여주었고, 여주열매의 열수추출물이 에탄올 추출물보다 변화의 정도가 더 심하였다. 그러나 로션제형에서 안정성시험 기간 동안 상분리나 색상변화 등의 외관 변화는 관찰되지 않았다.
- 미백효과 시험 결과 tyrosinase 억제능은 대조군인 arbutin 보다는 다소 낮았으나, DOPA 산화억제효과는 arbutin 보다 우수하였고 특히 여주열매 열수 추출물의 억제효과가 뛰어났다. 주름개선 효과는 elastase 억제효과로 평가되었으며 열수 및 에탄올 추출물은 대조군인 adenosine 보다는 다소 떨어졌으나 농도가 증가할수록 비슷한 수치를 보여주었다. 여주열매 추출물의 항산화능은 대조군인 비타민 C보다는 낮았으나, 500 µg/ml의 농도에서 여주열매의 열수추출물, 에탄올추출물은 각각 38%, 62%의 비교적 우수한 억제율을 보여주었다.
- 6 mg/g의 폴리페놀 농도가 보고되었다[11]. 천연소재의 특성상 사용된 시료의 품종, 지역 등의 차이가 있어서 직접 정확한 결과를 비교할 수는 없지만, 본 실험에 사용한 여주열매는 매우 높은 폴리페놀 함량을 보유하고 있다.
- 500 µg/ml의 농도에서 여주열매의 열수추출물, 에탄올 추출물은 각각 50%, 31%의 억제율을 보여주었다. 추출물 중에서는 열수 추출물이 에탄올 추출물보다 tyrosinase 억제효과가 우수하였다.
후속연구
- 여주에는 Charantin이라는 혈당강하성분이 분리되어 당뇨병과 합병증의 예방에 활용될 것을 기대하고 있으며, 비타민과 미네랄이 풍부하게 함유되어 있다고 알려져 있다[7, 8]. 또한 여주는 피부가 붉은 증상, 피부의 염증, 피부의 악창을 치료하는데 사용되기도 하여 피부와 관련된 역할을 가질 것으로 기대된다.
- 그러나 로션제형에서 안정성시험 기간 동안 상분리나 색상변화 등의 외관 변화는 관찰되지 않았다. 차후 여주열매의 추출물을 함유한 로션 화장품의 개발시 제형연구에 좀 더 보완이 필요한 것으로 보여진다.
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