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문제 정의
- 이에 본 논문에서는 향상된 품질수준을 확보한 우황청심원을 공급함으로써 국민의 건강 증진과 한약제제에 대한 신뢰도 향상에 기여하기 위해 우황청심원 멸균의 필요성과 멸균 후 우황청심원의 유효성을 검증하고자 우황청심원 지표물질의 함량 분석과 DPPH (1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl), FRAP (Ferric reducing antioxidant power), ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)를 이용한 항산화활성을 통하여 본 연구를 진행하였다.
제안 방법
- 8종의 표준물질 Glycyrrhizin, Decursin, Cinnamic acid, Ginsenoside Rb1, Paeoniflorin, Amygdalin은 Methanol에 녹여 0.4 mg/ml 농도로 조제하고, Bilirubin, L-muscone은 Chloroform에 녹여 1 mg/ml의 농도로 조제하여 4℃에서 보관하여 사용하였다. 각 물질에 대한 분석은 대한약전의 분석법 등을 기초로 하여 분석조건을 설정하였다.
- ABTS radical 소거법을 이용하여 우황청심원의 멸균 전, 후에 대한 항산화 활성을 측정하였다(Fig. 2). 이때 사용된 양성대조군인 표준물질로는 Trolox의 linearity는 R2=0.
- 0 ml/min을 유지하였다. Moblie phase, Injection Volume, UV는 각 물질 조건에 따라 측정하였다(Table II). 사향은 GC를 사용하였고, Column은 HP-5 (0.
- 희석된 용액 190 μl에 sample 10 μl를 가하여 2시간 동안 암상태에서 방 치한 다음 750 nm 흡광도를 측정하였다. 결과 값은 시료 를 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 라디칼의 제거활성 (%)으로 나타냈으며 양성대조군인 표준물질로는 Trolox 을 사용하였다20).
- 2%로 나타나, 향후 한약재에 대한 지속적인 미생물오염도 모니터링의 필요성을 강조하였다23). 멸균법에 관한 연구를 살펴보면 황백, 작약, 행인9), 목단피10), 황금11)을 대상으로 하여 건열 멸균법, 알코올 가스 멸균법, 방사선 조사 멸균법을 적용한 후 해당 생약의 지표물질 함량에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과 건열 멸균법은 진균을 효과적으로 제거하고 지표성분도 변화하지 않으나 외부 관능(색, 형태)의 변화를 초래하기 때문에 생약의 멸균법으로는 적당하지 않으며 방사선조사 멸균법은 세균 및 진균을 효과적으로 제거하고 지표성분 함량 및 외부 관능의 변화도 초래하지 않아 적당한 방법으로 추천하였다.
- 본 연구에서 고혈압, 협심증, 조현증, 신경과민증, 신경성불안증 등 다양한 분야에서 손쉽게 이용되는 우황청심원의 멸균의 필요성을 확인하기 위하여 고온고압증기법을 통해 멸균한 우황청심원에서 감초, 인삼, 육계, 작약, 당귀, 행인, 우황, 사향의 8종에 대한 지표물질의 함량을 분석하였으며 우황청심원의 유효성 변화를 확인하기 위하여 동맥경화나 뇌, 심장혈관계 장애, 노화와 발암 등에 의해 발생하는 활성산소에 대한 소거 능력으로 항산화활성을 확인하였다.
- 우황청심원의 품질수준을 확보하고, 국민의 건강 증진과 한약제제에 대한 신뢰도 향상에 기여하기 위해 우황청심원 멸균의 필요성과 멸균 후 우황청심원의 유효성을 검증하고자 우황청심원 지표물질의 함량 분석과 DPPH, FRAP, ABTS를 이용한 항산화활성을 실험을 진행하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 50% Folin 시약 (Folin & Ciocalteu’s Phenol Reagent, Sigma) 50 μl를 넣어 다시 30분간 반응시킨 후 ELISA reader 750 nm에서 측정하였다. 총 페놀화합물 함량은 Gallic acid의 표준 곡 선에 기초하여 계산하였다.
- 희석된 용액 190 μl에 sample 10 μl를 가하여 2시간 동안 암상태에서 방 치한 다음 750 nm 흡광도를 측정하였다.
대상 데이터
- Baker, Phillipsburg, NJ, USA)용, Acetic acid는 JUNSEI Chemical (JAPAN), Chloroform은 Burdick & Jackson (USA)을 사용하였다. Folin-Ciocalteau reagent, Gallic acid, Quercetin, DPPH, ABTS, Potassium persulfate, Ferric chloride, TPTZ (2, 4, 6-tripyridyl-s-triazine), Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid), Sodium Acetate은 Sigma chemical co., (St. Louis Mo, USA), NaOH는 SAMCHUN (Korea), Na2CO3, Diethyleneglycol은 JUNSEI (Japen)제품을 사용 하였다.
- 대한약전 외 의약품에 제시되어 있는 원방우황청심원 제법에 따라 우황청심원을 조제하였고, 조제한 우황청심원을 멸균 전과 멸균 후(121℃, 15분)로 나누어 시료로사용하였다.
- 본 실험에 사용된 기기 중 HPLC (High Performance Liquid Chromatography)는 Waters사의 Waters 600s controller, WatersTM 626 pump, Waters temperature control module, Waters In-Line degasser, WatersTM 717plus autosampler, WatersTM 996 photodiode array detector (PDA), GC (Gas Chromatograph)기기는 Agilent 7890A (G3440A), FID Detector, Headspace G1888 (G1888A), ELISA reader는 TECAN Austria GmbH (Austria), Autoclave는 JEIO TECH CO., LD (Korea)를 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 우황청심원은 대한약전 외 의약품에 제시되어 있는 원방우황청심원 제법의 약재들을 그린명품제약에서 구입하여 사용하였다(Table I).
- 본 연구에서는 대한약전 외 의약품에 제시되어 있는 유효성분 분석에 대한 8종 약재의 표준품으로 Glycyrrhizin, Bilirubin, Ginsenoside Rb1은 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japan), Cinnamic acid, Paeoniflorin은 Sigma Aldrich chemical company, Inc. (Milwaukee, WI), Decursin, Amygdalin은 Korea Food & Drug Administration (Cheongju, Korea), L-muscone 은 PhytoLab GmbH & Co. KG (Vstenbergsgreuth, Germany)에서 각각 구입하였고, 97.8%이상의 순도를 사용하였다.
- 정량분석에 사용된 Water, Acetonitrile, Methanol 은 HPLC grade (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ, USA)용, Acetic acid는 JUNSEI Chemical (JAPAN), Chloroform은 Burdick & Jackson (USA)을 사용하였다.
데이터처리
- 실험결과는 각각 (평균±표준편차)로 나타냈으며, 통계 분석은 paired t test로 행하였으며 p값이 0.05보다 작을 때 통계적으로 유의한 것으로 하였다.
이론/모형
- FRAP법을 이용하여 우황청심원의 멸균 전, 후에 대한 항산화 활성을 측정하였다(Fig. 3). 이때 사용된 양성대조군인 표준물질로는 Trolox의 linearity는 R2=0.
- 4 mg/ml 농도로 조제하고, Bilirubin, L-muscone은 Chloroform에 녹여 1 mg/ml의 농도로 조제하여 4℃에서 보관하여 사용하였다. 각 물질에 대한 분석은 대한약전의 분석법 등을 기초로 하여 분석조건을 설정하였다. 사향을 제외한 7가지 약재는 HPLC를 사용하였고, Column은 TC-C18(2) (5 um, 4.
- 총 페놀화합물 함량은 Folin-Ciocalteau 분석법으로 측 정하였다16,17). 시료 50 μl을 취해 2% Na2CO3 (1 L에 20 g) 1 ml와 잘 혼합하고 2분간 반응한 후.
- 충분히 혼합한 시료는 37℃ (water bath)에서 1시간동안 반응시킨 후, ELISA reader로 415 μl에서 측정하였다. 총 플라보노이드는 Quercetin의 표준 곡선에 기초하여 계산하였다18).
성능/효과
- 1. 당귀, 우황, 육계, 인삼, 작약, 행인, 사향의 경우 지표물질의 함량이 유의적으로 증가하였고, 감초의 경우 소량 감소하였으나 유의적이지는 못하였다.
- 2. 총 페놀화합물과 총 플라보노이드 함량에서 멸균 후 각각 1.22배, 4.15배 높았다.
- 3. DPPH 소거능은 멸균 후 20.45% 활성이 증가하였다.
- 4. ABTS 소거능은 멸균 후 20.69% 활성이 증가하였다.
- 5. PRAP 환원능은 멸균 후 2.78배 활성이 증가하였다.
- 멸균법에 관한 연구를 살펴보면 황백, 작약, 행인9), 목단피10), 황금11)을 대상으로 하여 건열 멸균법, 알코올 가스 멸균법, 방사선 조사 멸균법을 적용한 후 해당 생약의 지표물질 함량에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과 건열 멸균법은 진균을 효과적으로 제거하고 지표성분도 변화하지 않으나 외부 관능(색, 형태)의 변화를 초래하기 때문에 생약의 멸균법으로는 적당하지 않으며 방사선조사 멸균법은 세균 및 진균을 효과적으로 제거하고 지표성분 함량 및 외부 관능의 변화도 초래하지 않아 적당한 방법으로 추천하였다. 알코올 가스 멸균법은 진균을 효과적으로 제거하므로 진균 제거를 위한 멸균법으로 적당한 것으로 나타났다.
- 그 결과, Trolox에 대입하면 멸균 전 46.59±1.95 μg/ml, 멸균 후 135.26±7.85 μg/ml 으로 멸균 후의 FRAP값이 유의적으로 증가함을 확인 할 수 있었다.
- 그 결과, 멸균 전 40.06±1.83%, 멸균 후 60.75±1.37%으로 멸균 후의 ABTS값이 유의적으로 증가함을 확인 할 수 있었다.
- 대한약전상 선정되어 있는 우황청심원의 분석조건인 감초, 당귀, 우황, 육계, 인삼, 작약, 행인, 사향 총 8종에 대한 멸균 전, 후 지표성분을 분석한 결과 감초 중 Glycyrrhizin 의 멸균 전 함량은 21.6 mg이었고, 멸균 후 함량은 1.93 mg이었다. 당귀 중 Decursin은 0.
- 이러한 결과는 고온고압증기 멸균에 의하여 높은 온도와 압력을 통해 지표 물질이 더 추출되었거나, 각각의 약재들 속 물질들이 합성을 통해 지표물질이 생성된 것으로 사료된다. 본 가설을 증명하듯 항산화 활성에서도 멸균 후 활성이 높아졌다. 안정한 프리 라디칼이 전자를 공여할 수 있는 다른 항산화 물질과 반응하게 되면 본래의 자색에서 무색으로 변하게 되고, 흡광도를 감소시키는 원리를 이용한24,25) DPPH 의 경우 멸균 전 62.
- 그 결과 건열 멸균법은 진균을 효과적으로 제거하고 지표성분도 변화하지 않으나 외부 관능(색, 형태)의 변화를 초래하기 때문에 생약의 멸균법으로는 적당하지 않으며 방사선조사 멸균법은 세균 및 진균을 효과적으로 제거하고 지표성분 함량 및 외부 관능의 변화도 초래하지 않아 적당한 방법으로 추천하였다. 알코올 가스 멸균법은 진균을 효과적으로 제거하므로 진균 제거를 위한 멸균법으로 적당한 것으로 나타났다. 방사선 조사 혹은 알코올 가스 멸균법이 효과적인 것으로 나타났으나 모든 생약의 미생물학적 품질 보증을 위한 실용화를 위해서는 다른 생약에 대한 추가적인 연구에 대한 필요성을 강조하였다.
- 우황청심원을 500 ppm의 DPPH 용액을 이용하여 전자공여능을 측정해 본 결과 멸균 전 62.08±0.05%, 멸균 후 82.34±0.13%의 전자공여능을 값을 얻었다.
- 우황청심원의 총 페놀함량은 멸균 전 6.95±0.17 mg/g, 멸균 후 8.51±0.16 mg/g로 나타났으며 페놀 함량은 멸균 후가 멸균 전에 비해 약 1.22배 높았다(Table IV).
- 우황청심원의 총 플라보노이드 함량은 멸균 전 19.89±0.38 mg/g, 멸균 후 22.11±0.46 mg/g로 나타났으며 멸균 후가 멸균 전에 비해 1.11배 정도 플라보노이드 함량이 높았다(Table IV).
- 위 결과에 따라 우황청심원의 미생물학적 안전성을 위하여 고온고압증기법으로 멸균을 하였을 때 품질관리를 위한 지표물질의 함량분석에는 문제가 없음을 확인하였으며, 그 밖의 총 페놀화합물과 총 플라보노이드의 함량이 멸균 후 증가되었고, 유효성 검증을 위한 항산화 활성 실험에서도 유의적으로 활성이 증가됨을 알 수 있었다.
- 미생물허용한도에 관한 최근의 연구 중 2006년 한국한의학연구원 연구에서는 한약재의 미생물 존재에 대한 문제를 제기하고 3개 지역의 약업사에서 미생물 오염이 용이한 한약재 18종과 시간이 경과할수록 약의 성질이 좋아진다는 육진약(六陳藥)에 속하는 한약재 6종을 구입하고 한약제제 중 육미지황환을 제조한 뒤 미생물오염을 모니터링하는 방법으로 연구를 진행하였다. 이 결과 전체적으로 진균의 오염률이 높았으며 특히 육진약의 경우 총 세균의 오염율은 17.7%, 총 진균의 오염율은 41.2%로 나타나, 향후 한약재에 대한 지속적인 미생물오염도 모니터링의 필요성을 강조하였다23). 멸균법에 관한 연구를 살펴보면 황백, 작약, 행인9), 목단피10), 황금11)을 대상으로 하여 건열 멸균법, 알코올 가스 멸균법, 방사선 조사 멸균법을 적용한 후 해당 생약의 지표물질 함량에 미치는 영향을 확인하였다.
- 13%의 전자공여능을 값을 얻었다. 이를 통해 멸균 후의 우황청심원이 멸균 전에 비해 전자공여능이 우수한 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 1).
- 총 페놀함량 측정을 위해, 표준시약으로 사용된 Gallic acid 함량(X)과 760 nm에서의 흡광도(Y) 간의 회귀방정식은 Y=0.0034X−0.0654 이었다.
- 총 페놀화합물과 총 플라보노이드 함량에서도 멸균 전 6.95±0.17, 19.89±0.38 mg/g에서 멸균 후 8.51±0.16, 22.11±0.46mg/g으로 각각 1.22배, 1.11배 높았다.
- 총 플라보노이드 측정을 위해, 표준시약으로 사용된 Quercetin 함량(X)과 415 nm에서의 흡광도(Y) 간의 회귀 방정식은 Y=0.0006X＋0.0577 이었다. Quercetin의 함량이 증가함에 따라 흡광도도 유의적으로(r2=0.
- 함량분석은 대한약전에 명시되어 있는 조건을 본 실험실에 적합하게 변경하여 실험을 진행하였으며, 그 조건에 따라 감초를 제외한 7가지 당귀, 우황, 육계, 인삼, 작약, 행인, 사향의 경우 지표물질 함량이 멸균 전 각각 0.15±0.01, 0.24±0.01, 0.02, 0.02, 1.05±0.01, 2.68±0.02, 0.63±0.01 mg에서 멸균 후 각각 0.29±0.02, 0.33, 0.05, 0.14, 1.13±0.02, 2.83±0.02, 0.76±0.01 mg으로 유의 적으로 증가됨을 확인할 수 있었고, 감초의 경우에는 멸균 전 2.16±0.03 mg에서 멸균 후 1.93±0.07 mg으로 소량 감소하였으나 유의적이지는 못하였다.
후속연구
- 알코올 가스 멸균법은 진균을 효과적으로 제거하므로 진균 제거를 위한 멸균법으로 적당한 것으로 나타났다. 방사선 조사 혹은 알코올 가스 멸균법이 효과적인 것으로 나타났으나 모든 생약의 미생물학적 품질 보증을 위한 실용화를 위해서는 다른 생약에 대한 추가적인 연구에 대한 필요성을 강조하였다.
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