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문제 정의
- 한방에서는 뿌리를 학슬풍이라는 약재로 쓰는데, 이질·백일해·해수·복부팽만에 효과가 있고 구충제로도 사용한다. 당근꽃의 항산화 및 항염증에 대한 연구 보고는 없는 실정으로 본 연구는 당근꽃이 기능성 생물 소재로서의 활용 가능성이 있는지를 평가하기 위하여 연구하였다.
제안 방법
- 7 mM ABTS와 2.45 mM potassium persulfate를 물에 각각 녹여 ABTS 라디칼을 형성시키기 위해서 각각의 용액을 1:1 비율로 섞어주고 빛에 의한 라디칼 소모를 최소화하기 위하여 어두운 곳에서 12시간 동안 보관하였다. ABTS 용액을 UV 흡광도가 1.
- 이때 양성 대조군으로는 Gallic acid를 사용하였다. ABTS의 흡광도가 50% 감소할 때 나타나는 시료의 농도를 IC50으로 표시하였으며, 각 시료는 3회 반복하여 실험을 실시하여 평균값을 구하였다.
- 이때 양성 대조군으로는 butylated hydroxy anisole (BHA)를 사용하였다. DPPH 자유유리기 소거활성은 아래의 시으로부터 산출하였고 DPPH의 흡광도가 50% 감소할 때 나타나는 시료의 농도 (IC50)로 표시하였으며, 각 시료별로 3회 반복 실험 후 평균값을 구하였다.
- RAW 264.7 cell에서 4종의 꽃 추출물 (62.5, 125, 250, 500 ug/ mL)의 NO 생성 억제 활성을 분석하여 IC50 값과 50%의 세포독성을 나타내는 농도인 TC50 값을 산출하였다 (Table 3). 추출물과 LPS (1 ug/mL)를 동시처리하여 24시간 배양하여 생성된 NO의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포 배양액에 존재 하는 NO2-형태로 측정하였다.
- RAW 264.7 cell에서 당근꽃 추출물 및 분획물의 NO 생성 억제 활성을 분석하여 IC50 값과 50%의 세포독성을 나타내는 농도인 TC50 값을 산출하였다 (Table 5). 추출물과 LPS (1 ug/ mL)를 동시처리하여 24시간 배양하여 생성된 NO의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포 배양액에 존재하는 NO2-형태로 측정하였다.
- RAW 264.7 세포에 당근꽃 추출물 (62.5, 125, 250, 500 ug/ mL)과 LPS (1 ug/mL)를 동시처리하여 24시간 배양한 후 MTT 분석을 이용하여 세포 생존율을 확인한 결과 당근꽃 추출물은 500 ug/mL 이하의 농도에서 90~100%의 생존율을 보여 세포 독성을 나타내지 않았으며 생성된 NO의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포 배양액에 존재하는 NO2-형태로 측정 하였다. 당근꽃 추출물 500 ug/mL의 농도에서 LPS를 단독으로 처리한 군과 비교해 볼 때 57.
- 1,000 rpm에서 10분간 원심 분리한 후 배지를 제거한 다음, dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma) 200 µL를 가하여 MTT의 환원에 의해 생성된 formazan 침전물을 용해시켜 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료 농도에 대한 흡광도 값을 구하였으며, 시료를 처리하지 않은 대조군의 흡광도 값과 비교하여 생장억제 정도를 조사하였다.
- 당근꽃 등 4종 건조물 시료를 분쇄기로 갈아서 증류수 20배로 침전하여 온도 70°C에서 3시간 교반하여 침출시켰다.
- 당근꽃 등 4종의 추출물 (62.5, 125, 250, 500 ug/mL)에 대하여 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성을 측정하였다 (Table 2). 항산화 활성이 우수하다고 알려진 ascorbic acid와 gallic acid를 대조군 물질 (1.
- 당근꽃 추출물 10 g을 증류수 0.5 L에 현탁시킨 후에, 각각헥산 (n-Hexane, 0.5 L×3), 에틸아세테이트 (ethyl acetate, 0.5 L×3), 부탄올 (n-Butanol, 0.5 L×3), 물 (H2O)의 극성이 낮은 용매부터 극성이 높은 용매 순으로 순차적으로 용매 분획하여 4개의 분획물을 얻었고, 각각의 분획물을 동결 건조하여 시료로 사용하였다.
- 당근꽃의 추출물 및 각각의 용매 분획물을 시료 (62.5, 125, 250, 500 ug/mL)로 사용하였고, 항산화 활성이 우수하다고 알려진 ascorbic acid와 gallic acid를 대조군 물질 (1.25, 2.5, 5, 10 ug/mL)로 사용하였다. DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성을 측정한 결과 IC50 값은 추출물과 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물, 물 분획물에서 각각 109.
- 5×106 cells/mL)을 18시간 전 배양 후, 시료와 LPS (1 µg/mL)를 동시 처리하여 24시간 배양하였다. 생성된 NO의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재 하는 NO2-형태로 측정하였다. 세포배양 상등액 100 µL와 Griess 시약 [1% (w/v) sulfani-lamide, 0.
- 15 ug/mL의 농도에서 50%의 세포독성을 나타냈으며 감귤꽃과 유채꽃은 500 ug/mL의 농도에서는 NO억제 효과를 확인할 수 없었다. 이런 결과를 기초로 하여 당근꽃을 분획하여 항산화 효과 및 항염증 효과를 확인하였다.
- 5, 125, 250, 500 ug/ mL)의 NO 생성 억제 활성을 분석하여 IC50 값과 50%의 세포독성을 나타내는 농도인 TC50 값을 산출하였다 (Table 3). 추출물과 LPS (1 ug/mL)를 동시처리하여 24시간 배양하여 생성된 NO의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포 배양액에 존재 하는 NO2-형태로 측정하였다. 당근꽃 추출물은 399.
- 5, 125, 250, 500 ug/ mL)의 NO 생성 억제 활성을 분석하여 IC50 값과 50%의 세포독성을 나타내는 농도인 TC50 값을 산출하였다 (Table 3). 추출물과 LPS (1 ug/mL)를 동시처리하여 24시간 배양하여 생성된 NO의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포 배양액에 존재 하는 NO2-형태로 측정하였다. 당근꽃 추출물은 399.
- 침출시킨 시료를 감압 여과하여 잔사를 분리한 후 여액만을 동일하게 취하여 40°C에서 회전농축기를 이용하여 농축하고 동결건조시켰다.
- 5 L×3), 물 (H2O)의 극성이 낮은 용매부터 극성이 높은 용매 순으로 순차적으로 용매 분획하여 4개의 분획물을 얻었고, 각각의 분획물을 동결 건조하여 시료로 사용하였다. 핵산과 에틸아세테이트 분획물은 100% 에탄올에 녹였고, 부탄올과 물 분획물은 phosphate buffered saline (PBS)와 100% 에탄올 비율 1:1로 녹여서 실험하였다.
대상 데이터
- 7은 Korean Cell Line Bank (KCLB)로부터 분양 받아 1% Penicillin-streptomycin과 10% Fetal bovine serum (FBS)이 함유된 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, GIBCO, USA) 10mL 배지에 37°C,5% CO2 incubator에서 배양하였으며, 3일에 한 번씩 계대배양 하였다. Lipopoly-saccharide (LPS, E. coli serotype 0111: B4)는 Sigma로부터 구입하여 사용하였다.
- Murine macrophage cell line인 RAW264.7은 Korean Cell Line Bank (KCLB)로부터 분양 받아 1% Penicillin-streptomycin과 10% Fetal bovine serum (FBS)이 함유된 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, GIBCO, USA) 10mL 배지에 37°C,5% CO2 incubator에서 배양하였으며, 3일에 한 번씩 계대배양 하였다.
- 본 실험에 사용한 당근꽃 등 4종은 제주도 내 재배되고 있는 특산품 중 생산량이 많은 품목으로 ㈜제주사랑농수산에서 제공 받아 사용하였다. 선택된 시료는 수돗물로 여러 번 세척한 후 정선하여 자연 탈수한 다음 37°C에서 12시간 건조한후 제공될 때까지 냉동 보관하였다.
- 5, 125, 250, 500 ug/mL)에 대하여 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성을 측정하였다 (Table 2). 항산화 활성이 우수하다고 알려진 ascorbic acid와 gallic acid를 대조군 물질 (1.25, 2.5, 5, 10 ug/mL)로 사용하였다. 그 결과 DPPH 자유유리기 소거 활성은 감자꽃에서 IC50 값이 59.
이론/모형
- 전자공여능 (electron donating ability) 측정은 Blosis 방법에 의한 DPPH 자유유리기 소거법에 따라 측정하였다. 즉, 메탄올에 녹인 여러 농도의 시료를 96well plate에 100ul씩 분주하고 0.
성능/효과
- 41 ug/mL을 나타내었다. ABTS 라디칼 소거 활성을 측정한 결과 IC50 값은 당근꽃이 147.66 ug/mL, 감자꽃 149.27 ug/mL, 감귤꽃 176.54 ug/mL, 유채꽃 375.99 ug/mL 의 활성을 보였다.
- DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성을 측정한 결과 IC50 값은 추출물과 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물, 물 분획물에서 각각 109.8 µg/mL, 51.9µg/mL, 39.7 µg/mL, 263.7 µg/mL을 나타내었다 (Table 4).
- RAW 264.7 세포에 당근꽃 분획물 (25, 50, 100, 200 ug/mL) 과 LPS (1 ug/mL)를 동시처리하여 24시간 배양한 후 MTT 분석을 이용하여 세포 생존율을 확인한 결과 당근꽃의 Hexan 분획물은 129.59 ug/mL의 농도에서 50%의 세포독성을 나타냈으며, EtOAc, BuOH 및 water 분획물은 200 ug/mL 이하의 95~105%의 생존율을 보여 세포 독성을 나타내지 않음을 확인하였다 (Figs. 2, 3). 생성된 NO의 양은 당근꽃 분획물 200 ug/mL의 농도에서 LPS를 단독으로 처리한 군과 비교해 볼때 EtOAc 층은 73.
- 5, 5, 10 ug/mL)로 사용하였다. 그 결과 DPPH 자유유리기 소거 활성은 감자꽃에서 IC50 값이 59.56 ug/mL으로 가장 좋았으며, 당근꽃 94.13 ug/mL, 감귤꽃 154.77 ug/mL, 유채꽃 387.41 ug/mL을 나타내었다. ABTS 라디칼 소거 활성을 측정한 결과 IC50 값은 당근꽃이 147.
- 2, 3). 그리고 NO 생성 억제율에 대한 IC50값은 EtOAc 분획물과 BuOH 분획물이 각각 88.68 ug/mL, 98.62 ug/mL 으로 나타났다. 이런 결과를 기초로 하여 NO활성에 관여하는 인자와의 상관관계를 계속 연구할 필요가 있으며 결론적으로 본 연구를 통하여 당근꽃 추출물이 활성산소 등 자유유리기에 의해 발생되는 여러 만성질환 발병을 지연시키고 나아가서는 예방하는 기능성 소재로서의 활용 가능성을 보여주고 있다.
- 5, 125, 250, 500 ug/ mL)과 LPS (1 ug/mL)를 동시처리하여 24시간 배양한 후 MTT 분석을 이용하여 세포 생존율을 확인한 결과 당근꽃 추출물은 500 ug/mL 이하의 농도에서 90~100%의 생존율을 보여 세포 독성을 나타내지 않았으며 생성된 NO의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포 배양액에 존재하는 NO2-형태로 측정 하였다. 당근꽃 추출물 500 ug/mL의 농도에서 LPS를 단독으로 처리한 군과 비교해 볼 때 57.5% NO생성을 억제하는 것으로 나타나 높은 NO 생성 억제 활성을 보였다 (Fig. 1).
- 2, 3). 생성된 NO의 양은 당근꽃 분획물 200 ug/mL의 농도에서 LPS를 단독으로 처리한 군과 비교해 볼때 EtOAc 층은 73.1%, BuOH 층은 65.5% 다른 분획물에 보다 높은 NO 생성 억제 활성을 보였다 (Figs. 2, 3). 그리고 NO 생성 억제율에 대한 IC50값은 EtOAc 분획물과 BuOH 분획물이 각각 88.
후속연구
- 이런 결과를 기초로 하여 NO활성에 관여하는 인자와의 상관관계를 계속 연구할 필요가 있으며 결론적으로 본 연구를 통하여 당근꽃 추출물이 활성산소 등 자유유리기에 의해 발생되는 여러 만성질환 발병을 지연시키고 나아가서는 예방하는 기능성 소재로서의 활용 가능성을 보여주고 있다. 또한, 항산화및 항염증 효과와 관련된 기능성 화장품 소재로서의 활용가치도 있다고 사료된다.
- 62 ug/mL 으로 나타났다. 이런 결과를 기초로 하여 NO활성에 관여하는 인자와의 상관관계를 계속 연구할 필요가 있으며 결론적으로 본 연구를 통하여 당근꽃 추출물이 활성산소 등 자유유리기에 의해 발생되는 여러 만성질환 발병을 지연시키고 나아가서는 예방하는 기능성 소재로서의 활용 가능성을 보여주고 있다. 또한, 항산화및 항염증 효과와 관련된 기능성 화장품 소재로서의 활용가치도 있다고 사료된다.
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