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문제 정의
- 이와 같이 국내산 복분자를 이용한 항산화 활성 관련 연구(Cho 등, 2008; Jeong 등, 2008; Lee 등, 2009) 및 생체 내 지질개선에 관한 연구는 다수 수행된 바 있으나, 간 조직 내 항산화 및 지질 축적 관련 연구는 미미한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 복분자를 이용하여 in vitro 및 in vivo 측면에서 생리활성을 동시에 평가함으로써 복분자의 체내 지질개선에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.
제안 방법
- 5주간의 실험사육 기간 최종일에 실험동물을 16시간 절식시킨 후 에테르로 가볍게 마취시킨 다음 복부 절개하여 간 조직을 적출하였으며, 생리식염수로 혈액을 씻은 후 표면의 물기를 제거하고 중량을 측정하였으며, 액체 질소로 3분간 급속 동결한 후 –70℃에 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 복분자 추출물을 50, 100, 250 및 500 mg/mL의 농도로 70% 에탄올로 재용해한 후 라디칼 소거활성을 측정하였다. DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 라디칼 소거활성은 농도를 달리한 시료액에 0.
- 복분자의 70% 에탄올 추출물을 이용하여 라디칼 소거활성 및 고지방 식이성 흰쥐에 대한 간 조직의 지질개선에 미치는 영향을 분석하였다. 복분자의 70% 에탄올 추출물 중 총 페놀 함량은 157.
- , Korea) 및 복분자 추출물 급이군(HFD+RCE, 150 mg/kg BW)으로 구분하였다. 사육기간 동안 물과 식이는 자유 급이 시켰으며, 복분자 추출물은 물에 용해하여 1일 1회 일정시간에 경구 투여하였다. 식이섭취량은 매일 오전에 잔량을 측정하였으며, 체중은 주 1회 측정하였다.
- 5 mL를 혼합하여 실온에서 60분간 반응시켜 760 nm에서 분광광도계(Evolution 300 UV-VIS spectrophotometer, Thermoscientific, Worcester, MA, USA)로 흡광도를 측정하였다. 시료의 총 페놀 함량은 gallic acid (Sigma Co., St. Louis, MO, USA)를 표준물질로 한 검량선에 따라 계산하였다. 플라보노이드 함량은 상기의 시료액 1 mL과 10% aluminum nitrate 0.
- 사육기간 동안 물과 식이는 자유 급이 시켰으며, 복분자 추출물은 물에 용해하여 1일 1회 일정시간에 경구 투여하였다. 식이섭취량은 매일 오전에 잔량을 측정하였으며, 체중은 주 1회 측정하였다. 식이효율(%)은 실험 사육 5주간의 체중증가량을 총 식이 섭취량으로 나누어 계산하였다.
- 식이섭취량은 매일 오전에 잔량을 측정하였으며, 체중은 주 1회 측정하였다. 식이효율(%)은 실험 사육 5주간의 체중증가량을 총 식이 섭취량으로 나누어 계산하였다.
- 실험군은 정상군(Normal, Rodent diet, Samyang Co., Korea), 고지방식이 급이군(HFD, 60% kcal fat, #55VXT0038, Samyang Co., Korea) 및 복분자 추출물 급이군(HFD+RCE, 150 mg/kg BW)으로 구분하였다. 사육기간 동안 물과 식이는 자유 급이 시켰으며, 복분자 추출물은 물에 용해하여 1일 1회 일정시간에 경구 투여하였다.
- 간 조직 1 g에 chloroform : methanol 혼합액(C:M=2:1, v/v)을 가하여 Poter-Elvehjem tissue grinder (WOS01010, Daihan, Korea)로 마쇄하여 30 mL로 정용한 다음 4℃에서 24시간 추출하였다. 이를 여과(Whatman No. 6)하여 용매를 모두 제거한 다음, 간 조직의 중성지방 함량은 중성지방 측정용 kit (AM 157S-k, Asan pharm. Co., Seoul, Korea), 총 콜레스테롤 함량은 총 콜레스테롤 측정용 kit (AM 202-k, Asan pharm. Co.) 시약으로 각각 분석하였다.
- 적출된 간 조직은 즉시 4% neutral buffered paraformaldehyde로 고정한 후, 이를 수세하여 고정액을 제거하고 70, 80, 90, 95 및 100% 에탄올과 xylene을 단계별로 사용하여 탈수와 투명화 과정을 거쳐 paraffin embedding center (Leica, Wetzlar, Germany)에서 포매하였다. 회전식 박절기(Leica, Wetzlar, Germany)를 이용하여 파라핀블록을 5 μm로 박절하였다.
- 회전식 박절기(Leica, Wetzlar, Germany)를 이용하여 파라핀블록을 5 μm로 박절하였다. 절편된 조직은 다시 xylene, 100, 95, 90, 80, 70% 에탄올의 단계로 탈파라핀 및 함수과정을 거친 후 hematoxylin과 eosin으로 염색하였으며, permount를 이용하여 봉입한 후, 현미경(Leica, Wetzlar, Germany)으로 간 조직 중 지질 분포 정도를 관찰하였다.
- 실험동물은 생후 5주령으로 150∼160 g의 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐를 (주)중앙실험동물(Seoul, Korea)로부터 분양받아, 온도 22±2℃, 습도 50±5%, 명암주기 12시간(07:00∼19:00)으로 자동 설정된 동물사육실에서 실험 사육하였다. 첫 1주간은 시판 고형사료로 적응시켰으며, 2주째 체중에 따른 난괴법에 의해 8마리씩 3그룹으로 구분하여 사육 상자에 2마리씩 넣어 5주간 사육하였다.
- 회전식 박절기(Leica, Wetzlar, Germany)를 이용하여 파라핀블록을 5 μm로 박절하였다.
대상 데이터
- 복분자(Rubus coreanus)는 진주시내 한약 재료상에서 완숙과 건조품을 구입하였으며, 시료 100 g에 1 l의 70% 에탄올을 가하여 실온에서 6시간씩 2회 반복하여 추출하였다. 이를 모두 모아 회전식 진공증발 농축기로 35℃이하에서 농축하여 완전 건조시킨 다음 −20℃에 보관해 두고 실험에 사용하였다.
- 실험동물은 생후 5주령으로 150∼160 g의 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐를 (주)중앙실험동물(Seoul, Korea)로부터 분양받아, 온도 22±2℃, 습도 50±5%, 명암주기 12시간(07:00∼19:00)으로 자동 설정된 동물사육실에서 실험 사육하였다.
데이터처리
- 각 실험군에 대한 유의차 검정은 SPSS 12.0을 사용하여 분산분석을 한 후 P＜0.05 수준에서 Duncan's multiple range test에 의해 분석하였다.
- 실험결과는 4회 반복 측정하여 평균±표준편차로 나타내었다.
이론/모형
- 005% DPPH 용액을 동량으로 혼합한 다음 실온에서 10분간 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다(Blois, 1958). ABTS [2,2-azinobis-(3-ethylbenz-thiazoline-6-sulphonate)] 라디칼 소거활성은 Re 등(1999)의 방법에 따라 ABTS 용액을 제조한 후 415 nm에서 1.5의 흡광도가 되도록 증류수로 조절한 ABTS 기질용액 1 mL에 시료액 0.5 mL를 혼합하여 실온에서 5분간 반응시켜 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. Hydroxyl 라디칼 소거활성은 0.
- )에 의한 검량선에 따라 계산하였다(Moreno 등, 2000). 안토시아닌 함량은 pH differential method (Hosseinian 등, 2008)에 따라 상기의 시료액 1 mL에 0.025 M potassium chloride 완충액(pH 1.0)과 0.4 M sodium acetate 완충액(pH 4.5)을 각각 가하여 최종부피를 5 mL로 조정하여 510 nm 및 700 nm에서 흡광도를 각각 측정하여 cyanidin-3-glucoside(Sigma Co.)를 표준물질로 하여 총 안토시아닌 함량을 계산하였다.
- 총 페놀 함량은 Folin-Denis법(Gutfinger, 1981)에 따라 복분자 추출물을 70% 에탄올에 일정농도로 재용해한 시료액 1 mL에 Folin-Ciocalteau 시약 0.5 mL, 10% Na2CO3 시약 0.5 mL를 혼합하여 실온에서 60분간 반응시켜 760 nm에서 분광광도계(Evolution 300 UV-VIS spectrophotometer, Thermoscientific, Worcester, MA, USA)로 흡광도를 측정하였다. 시료의 총 페놀 함량은 gallic acid (Sigma Co.
- 3 mL를 혼합하여 실온에서 40분간 반응시켜 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 quercetin (Sigma Co.)에 의한 검량선에 따라 계산하였다(Moreno 등, 2000). 안토시아닌 함량은 pH differential method (Hosseinian 등, 2008)에 따라 상기의 시료액 1 mL에 0.
성능/효과
- 지방의 함유율이 60%로 조절된 고지방 식이와 복분자 에탄올 추출물을 5주간 혼합급이하여 사육한 실험동물에서 식이섭취량, 체중 증가량, 식이효율 및 간 조직의 중량을 측정한 결과는 Table 3과 같다. 1일 식이섭취량은 정상군(Normal)에 비해 고지방 식이를 급이한 대조군(HFD)과 복분자 추출물을 급이한 HFD+RCE군간에 유의차가 없었으나, 5주간의 사육 기간 동안 체중 증가량은 대조군이 정상군에 비해 유의적으로 높았으며, 복분자 추출물의 급이군은 대조군에 비해 유의적인 감소를 보였다. 식이효율은 정상군에 비해 대조군에서 유의적으로 높았으나, HFD+RCE군과 HFD군 간에 유의차는 없었다.
- 2)Effective concentration values (EC50, μg/mL) were calculated from the regression lines using four different concentrations (50, 100, 250 and 500μg/mL) and their data were presented as 50% scavenging activity to the their radical.
- 50∼500 μg/mL의 시료 농도에서 시료의 첨가량이 많아짐에 따라 라디칼 소거활성은 유의적으로 증가하는 경향이었다.
- 식이효율은 정상군에 비해 대조군에서 유의적으로 높았으나, HFD+RCE군과 HFD군 간에 유의차는 없었다. 5주간의 고지방 식이 급이에 따른 간 조직의 중량은 정상군이 3.28 g/100 g BW로 가장 작았으며, 대조군이 유의적으로 높았으며, 복분자 추출물 급이군(3.75 g/100 g BW)은 대조군에 비해 유의적으로 감소되었다.
- DPPH 및 ABTS 라디칼 소거활성은 500μg/mL 농도에서 70% 이상이었으며, 특히 ABTS 라디칼 소거활성은 경우 100 μg/mL의 농도에서 50%이상의 활성을 보였다.
- 7%정도의 유의적인 감소를 보였다. 간 조직의 라디칼 소거활성은 대조군이 가장 낮았으며, HFD+RCE군에서 46.34%의 소거활성으로 정상군과 유사한 수준으로 회복되었다.
- 75 g/100 g BW)이 대조군에 비해 유의적으로 감소되었다. 간 조직의 중성지방 및 총 콜레스테롤 함량은 대조군에 비해 HFD+RCE군에서 유의적으로 감소되었다. 지질과산화물 함량은 복분자 추출물 급이군이 대조군에 비해 유의적으로 감소되었으며, 간 조직의 라디칼 소거활성은 HFD+RCE군에서 정상 군과 유사한 수준이었다.
- 1과 같다. 대조군의 중성지방 함량은 정상군(5.79 mg/g)에 비해 약 136%의 수준으로 유의적인 증가를 보였으며, HFD+RCE군은 5.75 mg/g으로 대조군과 유의차를 보이지 않았다. 총 콜레스테롤 함량도 중성지방과 유사한 경향으로 대조군(6.
- 복분자 에탄올 추출물 급이 군에서는 간 조직의 지질 축적이 대조군에 비해 다소간 낮으며 소포성의 지방세포 수가 감소된 것으로 관찰되었다. 따라서 복분자는 총 페놀 함량에 의존하여 항산화 활성과 간 조직의 지질 개선에 효과적인 것으로 판단된다.
- 지질과산화는 생체 내에서 자연적으로 발생될 수 있는 여러 가지 유리라디칼에 의해 세포막의 다가불포화지방산이 과산화되는 현상으로 고지방식이의 지속적인 섭취에 의해 가속화될 수 있다. 따라서 유리 라디칼의 소거활성이 큰 물질일수록 생체 내 지질과 산화 억제 효과가 높은데(Park 등, 2004), 본 연구에서 고지방 식이에 대한 복분자 추출물의 급이는 간 조직내 지질과산화물의 수준을 유의적으로 감소시켰을 뿐만 아니라 간 조직의 항산화 활성에도 유의적인 효과를 보였다. 또한 간세포 내 공포 형태의 지방구 침착수준을 감소시켜 지방간 억제 소견이 관찰되어 복분자 추출물은 체내 지질 축적 감소에 효과적인 것으로 판단되었다.
- 따라서 유리 라디칼의 소거활성이 큰 물질일수록 생체 내 지질과 산화 억제 효과가 높은데(Park 등, 2004), 본 연구에서 고지방 식이에 대한 복분자 추출물의 급이는 간 조직내 지질과산화물의 수준을 유의적으로 감소시켰을 뿐만 아니라 간 조직의 항산화 활성에도 유의적인 효과를 보였다. 또한 간세포 내 공포 형태의 지방구 침착수준을 감소시켜 지방간 억제 소견이 관찰되어 복분자 추출물은 체내 지질 축적 감소에 효과적인 것으로 판단되었다. 고지방 식이에 포도박을 혼합급이한 실험동물의 간 조직은 고지방 식이군에 비해 지방세포의 크기에는 변화를 보이지 않았으나, 간 조직의 괴사나 염증 유발 현상을 보이지 않아 포도박의 간 보호 효과가 확인된 바 있는데(Zhang 등, 2010) 이러한 현상은 포도에 함유된 폴리페놀성 물질에 의존적이라고 보고(Kammerer 등, 2004)되어 본 연구와 유사한 결과였다.
- 라디칼 소거활성은 50∼500 μg/mL에서 시료의 농도에 따라 소거활성이 증가되었으며, DPPH 및 ABTS 라디칼 소거활성은 500 μg/mL 농도에서 70% 이상이었다.
- 라디칼의 50%를 소거하는데 소요되는 시료의 농도는 ABTS 라디칼 소거에서 78.04 μg/mL로 가장 적은 함량으로 복분자 추출물이 ABTS 라디칼 소거에 가장 민감하게 반응하는 것으로 나타났다.
- 지질과산화물 함량은 복분자 추출물 급이군이 대조군에 비해 유의적으로 감소되었으며, 간 조직의 라디칼 소거활성은 HFD+RCE군에서 정상 군과 유사한 수준이었다. 복분자 에탄올 추출물 급이 군에서는 간 조직의 지질 축적이 대조군에 비해 다소간 낮으며 소포성의 지방세포 수가 감소된 것으로 관찰되었다. 따라서 복분자는 총 페놀 함량에 의존하여 항산화 활성과 간 조직의 지질 개선에 효과적인 것으로 판단된다.
- 본 연구에서 고지방 식이와 복분자 추출물의 혼합 급이 시 간 조직의 중량이 대조군(HFD)에 비해 유의적으로 감소되었는데, 이는 고지방 식이에 오미자 추출물을 혼합급이한 흰쥐의 간 조직 중량이 대조군에 비해 유의적으로 감소되어 시료 중의 안토시아닌 및 리그난의 함량과 관련성이 있다는 보고(Song 등, 2014)로 볼 때 본 연구에서 복분자에 함유된 안토시아닌을 비롯한 페놀 화합물이 체내 지질 축적 저해와 관련이 높은 것으로 판단된다. C57BL/6 mice에서 복분자 미숙과 주정 추출물의 100 mg/kg BW 급이군은 고콜레스테롤 급이군에 비해 유의적으로 간 중량의 감소를 보였다는 보고(Jung 등, 2014)도 본 연구와 유사한 결과였다.
- 더욱이 DPPH 라디칼 소거활성은 생체막 구성성분의 파괴, 여러 산화작용을 초래하는 활성산소의 소거능 평가, ABTS 라디칼 소거활성은 친수성 및 lipophilic 물질에 대한 항산화 활성을 평가하는데 이용되며(Cho 등, 2005), hydroxyl 라디칼은 활성산소 중에서 화학적인 반응성이 크며 생체 내 산화 작용의 원인으로써 DNA 손상이나 돌연변이 유발 물질로 알려져 있다(Qi 등, 2013). 본 연구에서 복분자 에탄올 추출물의 ABTS 라디칼 소거활성이 DPPH 라디칼 소거활성에 비해서 다소 높은 경향이었으며, hydroxyl 라디칼 소거활성은 이보다는 낮은 활성이었으나, 복분자 에탄올 추출물에 대한 이들 라디칼의 소거활성은 생체 내 항산화 시스템에서도 유사하게 적용될 수 있을 것으로 생각된다. 또한 페놀화합물은 superoxide anion 라디칼, 과산화수소 및 hydroxyl 라디칼 등의 활성산소종의 제거에도 효과적으로, 인체 건강을 위한 효율적인 항산화제로 이용되고 있다(Lee 등, 2011).
- 폴리페놀 화합물은 1개 이상의 벤젠고리와 1개 이상의 수산기로 구성되며, 크게 페놀산류와 플라보노이드류로 대별되는데, 복분자를 비롯한 베리류는 폴리페놀 화합물의 좋은 급원으로 플라보노이드류로써 quercetin, kaempferol, myricetin 등의 flavonol 함량이 높은 것으로 알려져 있다(Häkkinen 등, 1999). 본 연구에서 복분자의 70% 에탄올 추출물로부터 생리활성과 관련된 유효성분으로 페놀 화합물을 분석한 결과, 총 페놀 함량에 대한 플라보노이드 함량의 비율은 25.9%, 안토시아닌 함량의 비율은 38.1%로 시료 중 페놀산 류의 함량이 더 많은 것으로 추정되었다. 품종이 다른 완숙 복분자의 에탄올 추출물에서 총 페놀 함량은 20.
- 이에 반해 복분자 에탄올 추출물 급이군에서는 간 조직의 지질 축적이 대조군에 비해 크게 감소하고 소포성의 지방세포 수가 확연하게 저하되는 것으로 관찰되었다. 이로써 간 조직의 형태학적 관찰에 의해 고지방 식이에 의해 유도된 식이성 지방간에 대한 복분자 추출물은 간세포의 소포성 지방세포를 감소시킴으로써 지방간 형성을 강하게 억제할 수 있을 것으로 판단되었다.
- 고지방 식이를 급이한 HFD군에서 간 조직은 흰색의 지방이 축적되어 전형적인 식이성 지방간의 형태를 보였다. 이에 반해 복분자 에탄올 추출물 급이군에서는 간 조직의 지질 축적이 대조군에 비해 크게 감소하고 소포성의 지방세포 수가 확연하게 저하되는 것으로 관찰되었다. 이로써 간 조직의 형태학적 관찰에 의해 고지방 식이에 의해 유도된 식이성 지방간에 대한 복분자 추출물은 간세포의 소포성 지방세포를 감소시킴으로써 지방간 형성을 강하게 억제할 수 있을 것으로 판단되었다.
- 간 조직의 중성지방 및 총 콜레스테롤 함량은 대조군에 비해 HFD+RCE군에서 유의적으로 감소되었다. 지질과산화물 함량은 복분자 추출물 급이군이 대조군에 비해 유의적으로 감소되었으며, 간 조직의 라디칼 소거활성은 HFD+RCE군에서 정상 군과 유사한 수준이었다. 복분자 에탄올 추출물 급이 군에서는 간 조직의 지질 축적이 대조군에 비해 다소간 낮으며 소포성의 지방세포 수가 감소된 것으로 관찰되었다.
- 고지방식이에 복분자 에탄올 추출물을 급이한 흰 쥐의 간 조직 중 지질과산화물 함량 및 DPPH 라디칼 소거에 의한 항산화 활성은 Table 4와 같다. 지질과산화물 함량을 TBARS값으로 나타낸 결과, 정상군에 비해 대조군에서 유의적인 증가를 보였으며, 복분자 추출물 급이군은 대조군에 비해 17.7%정도의 유의적인 감소를 보였다. 간 조직의 라디칼 소거활성은 대조군이 가장 낮았으며, HFD+RCE군에서 46.
- 75 mg/g으로 대조군과 유의차를 보이지 않았다. 총 콜레스테롤 함량도 중성지방과 유사한 경향으로 대조군(6.68 mg/g)에서 가장 높았으며, 정상군과 복분자 추출물 급이군은 각각 5.12 및 5.49 mg/g으로 두 실험군간에 유의차는 없었다.
- 복분자의 70% 에탄올 추출물 중 총 페놀, 플라보노이드 및 안토시아닌 함량은 Table에 나타낸 바와 같다. 총 페놀 함량은 157.93 mg gallic acid/g, 플라보노이드 함량은 40.83 mg quercetin/g이었으며, 안토시아닌 함량은 60.23 mg cyanidin/g이었다.
후속연구
- 따라서 지방 섭취율이 증가되고 있는 현대인의 식생활에서 복분자의 보충 섭취가 유효물질에 의존적으로 체내 지질 개선, 간 보호 효과에 긍정적인 영향을 줄 수 있을 것으로 기대되며, 본 연구는 복분자를 이용한 간 보호용 2차 가공품 개발을 위한 기초 자료로써 활용성이 높을 것으로 생각된다.
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