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문제 정의
- 이번 연구는 식품산업에서 큰 비중을 차지하고 있는 소시지에 대한 보존료의 신속한 검사를 위한 동시 분석법을 확립하였다. 85% MeOH screening 방법을 이용한 간편하고 효율적인 시료 전처리 후 LC-MS/MS를 이용하여 9종의 보존료 동시분석 조건을 검토하였다.
제안 방법
- 이번 연구는 식품산업에서 큰 비중을 차지하고 있는 소시지에 대한 보존료의 신속한 검사를 위한 동시 분석법을 확립하였다. 85% MeOH screening 방법을 이용한 간편하고 효율적인 시료 전처리 후 LC-MS/MS를 이용하여 9종의 보존료 동시분석 조건을 검토하였다. 칼럼은 phenyl-hexyl (2.
- ESI negative mode에서 주로 사용하는 용매로 ammonium acetate와 ammonium formate에 대해서도 검토하였다. Noise 제거, 머무름, 분리도 및 감도를 고려하여 ammonium acetate를 선택하였으며, 순차적으로 ammonium acetate 농도를 변화시키면서 적정농도를 확인한 결과 20 mM이 가장 적합하였다.
- 정확성과 정밀성은 보존료가 전혀 검출되지 않은 시료에 2 mg/L, 5 mg/L 및 10 mg/L 농도로 표준용액을 첨가한 후 4가지 시료 전처리 방법에 따라 회수율과 상대표준편차(relative standard deviation, RSD%)를 측정하였다. LOD는 신호대 잡음비(signal to noise, S/N) 3.3배 이상인 농도로 계산하였으며, LOQ는 S/N비가 10배 이상인 농도로 계산하였다. LOD와 LOQ는 혼합 표준용액을 단계적으로 희석하여 6회 반복 분석하여 얻은 검 량선의 기울기와 y-절편의 표준편차를 이용하여 축수산물 유해물질 분석법 편람(식품의약품안전평가원, 2014)에 따라 값을 구하였다.
- BA 등 9종의 보존료는 negative mode에서 좋은 감도를 나타내었으며, 다른 연구결과와 일치하였다(Horiyama 등, 2008; Lv 등, 2012; Tsuruda 등, 2013; Zu-xiang 등, 2011; Ujiie 등, 2007). 각 보존료는 전체주사 방식(full scan mode)에서 질량 스펙트럼을 확인한 다음 선구 이온(precursor ion)을 선택하여 multiple reaction monitorning (MRM) 방식으로 정량 분석하기 위한 생성 이온(product ion) 선정과 collision energy (CE) 등을 검토한 결과는 Table 3과 같았다. 감도가 좋은 생성이온을 정량이온으로 분석하였으며, 나머지 이온은 정성이온으로 활용하였다.
- 각각의 표준용액을 메탄올/증류수(85/15, v/v)로 희석하여 BA와 DHA는 1.0 μg/mL, SA는 8.0 μg/mL, 6종의 paraben은 0.1 μg/mL가 되도록 혼합하여 9종의 보존료 혼합 표준용액을 제조하였다.
- 각 보존료는 전체주사 방식(full scan mode)에서 질량 스펙트럼을 확인한 다음 선구 이온(precursor ion)을 선택하여 multiple reaction monitorning (MRM) 방식으로 정량 분석하기 위한 생성 이온(product ion) 선정과 collision energy (CE) 등을 검토한 결과는 Table 3과 같았다. 감도가 좋은 생성이온을 정량이온으로 분석하였으며, 나머지 이온은 정성이온으로 활용하였다.
- 정확도 및 정밀도는 보존료가 함유되어 있지 않은 시료에 표준물질을 첨가하여 각 표준물질의 농도가 10 mg/L, 5 mg/L, 2 mg/L이 되도록 한 시료를 85% MeOH를 이용한 시료 전처리 방법을 이용하여 실험하였다. 동일한 날에 6회 반복 분석하여 일내 정밀도(intra-day precision) 및 회수율을 확인하였고 3일간 반복 분석하여 일간 정밀도 (inter-day precision) 및 회수율을 확인하였다(Table 5). 회수율은 BA 94.
- 따라서 이번 연구는 식품공전과 축산물의 가공기준 및 성분규격에 기재되어 있는 시험용액의 조제 방법을 비교하고 LC-MS/MS를 이용하여 9종의 보존료 (SA, BA, DHA 및 6종 paraben) 동시분석법을 확립하여 시중 유통 중인 축산물가공품을 대상으로 그 함유 실태를 조사하였다.
- 보존료 9종 동시다성분 분석법을 확립하기 위해서 시료 전처리 방법과 보존료 음성 시료에 2.0, 5.0 및 10.0 mg/L의 농도로 첨가하여 회수율을 비교하였다. 수증기 증류법을 이용하여 증류액 500 mL을 취한 다음, 이를 여과하여 LC-MS/MS로 평균회수율을 분석하였다.
- 보존료 분석을 위해 사용한 분석장비는 QTRAP® 4500 (AB Sciex, MA, USA) 질량분석기기와 Agilent Technologies 1290 infinity LC system (Agilent, Böblingen, Germany)를 사용하였다.
- 보존료의 분리능과 감도 등을 검사하기 위해서 C18칼럼과 CSHTM phenyl-hexyl 칼럼을 비교하였다. 이번 실험에 길이가 100 mm인 C18 칼럼에서 paraben류 이성질체 간의 peak 분리능이 좋지 않아서 길이가 150 mm인 CSHTM phenyl-hexyl 칼럼을 선택하였다.
- 0 mg/L의 농도로 첨가하여 회수율을 비교하였다. 수증기 증류법을 이용하여 증류액 500 mL을 취한 다음, 이를 여과하여 LC-MS/MS로 평균회수율을 분석하였다. 이중 10.
- 시료 전처리는 축산물의 가공기준 및 성분규격과 식품공전에 따라 에탄올을 이용한 추출법(EtOH screening), Sep-Pak® C18 카트리지를 이용한 고체상 추출법(solid phase extraction, SPE), 수증기 증류법(distillation method)을 비교하여 실험하였다(식품의약품안전처, 2014a&2014c).
- 3% 범위로 이번 실험결과와 유사한 결과를 보고하였다. 시료 전처리를 위한 초음파 처리시간은 20분 정도가 적절하다고 보고하였으며, 이번 실험에서는 관련 규정에 따라 30분 동안 시료를 전처리하였다. Zu-xiang 등(2011)은 BA와 SA의 회수율은 84∼98%와 82∼96%로 보고하였다.
- 0을 유지하는 것이 중요하다(Ujiie 등, 2007). 이번 실험에서 용리액의 pH를 조절하기 위해서 acetic acid와 formic acid를 비교하였다. Formic acid를 사용한 경우에는 DHA에서만 감도 저하와 피크 깨짐 현상이 발생하였고, 그 이외의 보존료에서는 acetic acid와 formic acid에 상관없었다.
- 정확도 및 정밀도는 보존료가 함유되어 있지 않은 시료에 표준물질을 첨가하여 각 표준물질의 농도가 10 mg/L, 5 mg/L, 2 mg/L이 되도록 한 시료를 85% MeOH를 이용한 시료 전처리 방법을 이용하여 실험하였다. 동일한 날에 6회 반복 분석하여 일내 정밀도(intra-day precision) 및 회수율을 확인하였고 3일간 반복 분석하여 일간 정밀도 (inter-day precision) 및 회수율을 확인하였다(Table 5).
- 1 mg/L 범위 내에서 6 단계 농도로 희석한 후 LS-MS/MS에 주입하여 얻어진 피크면적으로 검량선(calibration curve)을 작성하여 구하였다. 정확성과 정밀성은 보존료가 전혀 검출되지 않은 시료에 2 mg/L, 5 mg/L 및 10 mg/L 농도로 표준용액을 첨가한 후 4가지 시료 전처리 방법에 따라 회수율과 상대표준편차(relative standard deviation, RSD%)를 측정하였다. LOD는 신호대 잡음비(signal to noise, S/N) 3.
- 직선성은 혼합 표준용액 농도 BA와 DHA 0.031∼1.0 mg/L, SA 0.25∼8.0 mg/L 및 6종 paraben 0.003∼0.1 mg/L 범위 내에서 6 단계 농도로 희석한 후 LS-MS/MS에 주입하여 얻어진 피크면적으로 검량선(calibration curve)을 작성하여 구하였다.
- 축산식품에서 보존료 분석 조건을 검토하기 위해 표준용액(1.0 mg/L)을 개별적으로 질량분석기에 직접주입하여 electrospray ionization (ESI) positive와 negative mode에서 이온화 조건을 비교하였다. BA 등 9종의 보존료는 negative mode에서 좋은 감도를 나타내었으며, 다른 연구결과와 일치하였다(Horiyama 등, 2008; Lv 등, 2012; Tsuruda 등, 2013; Zu-xiang 등, 2011; Ujiie 등, 2007).
- 칼럼은 phenyl-hexyl (2.5 μm, 2.1×150 mm, Waters), 이동상은 20 mM ammonium acetate (0.1% acetic acid)과 아세토니트릴을 사용하여 농도구배 조건으로 각 성분을 분리하였으며 ESI negative/MRM 방식으로 정량 분석하였다.
- 카트리지를 이용한 고체상 추출법(solid phase extraction, SPE), 수증기 증류법(distillation method)을 비교하여 실험하였다(식품의약품안전처, 2014a&2014c). 한편, 이번 실험에서 EtOH screening에 의한 추출된 시료에 대한 LC-MS/MS 분석 peak 중 IPP와 PP간 그리고 IBP와 BP간의 peak가 분리되지 않고 합쳐져서 용출되어 에탄올 대신 85% MeOH를 이용한 추출실험(MeOH screening)을 병행하였으며, 시험용액 제조절차는 Fig. 1과 같다. 축산물의 가공기준 및 성분규격에 따른 EtOH screening과 SPE 시험용액 조제에 각각 1 g과 5 g의 시료를 사용하였다.
- 한편, 축산물의 가공기준 및 성분규격에 기재된 EtOH screening을 이용한 시료 전처리 방법에서 IPP와 PP 그리고 IBP와 BP간의 피크가 분리되지 않아 회수율 조사에서 제외하고 나머지 5종 보존료에 대해서만 회수율을 조사하였다(Fig. 5). BA의 평균회수율 108.
대상 데이터
- Louis, MO, USA)에서 구매하였으며, isobutyl- (IBP), isopropyl- (IPP), propyl-paraben (PP)은 Tokyo chemical industry (Tokyo, Japan)에서 구매하였다. Methanol과 acetonitrile 등의 용매는 Merck (Darmstadt, Germany)사 LC급으로 사용하였으며, 그 이외의 분석용 시약 및 용매는 특급 또는 분석용을 사용하였다. 증류수는 Milli-Q purification system (Millipore, Bedford, MA, USA)을 이용하여 조제한 3차 증류수를 사용하였다.
- 시료는 2014년 11월에 광주지역에서 유통 중인 소시지 33건을 구매하여 사용하였다. 대상 시료는 4℃에 냉장보관 후 실험 전 분쇄하여 사용하였다.
- phenyl-hexyl 칼럼을 비교하였다. 이번 실험에 길이가 100 mm인 C18 칼럼에서 paraben류 이성질체 간의 peak 분리능이 좋지 않아서 길이가 150 mm인 CSHTM phenyl-hexyl 칼럼을 선택하였다. 하지만 이 칼럼을 이용한 DHA 분석 peak에서 꼬리끌림(tailing) 현상이 크게 나타났다.
- 이번 연구에 사용한 표준물질 BA, SA, DHA, butyl-(BP), ethyl- (EP), methyl-paraben (MP)은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구매하였으며, isobutyl- (IBP), isopropyl- (IPP), propyl-paraben (PP)은 Tokyo chemical industry (Tokyo, Japan)에서 구매하였다. Methanol과 acetonitrile 등의 용매는 Merck (Darmstadt, Germany)사 LC급으로 사용하였으며, 그 이외의 분석용 시약 및 용매는 특급 또는 분석용을 사용하였다.
- 1과 같다. 축산물의 가공기준 및 성분규격에 따른 EtOH screening과 SPE 시험용액 조제에 각각 1 g과 5 g의 시료를 사용하였다. 식품공전에 기재된 HPLC 분석을 위한 수증기 증류법에는 시료 50 g을 사용하였다.
이론/모형
- 9종 보존료에 대한 동시분석법을 식품의약품안전처(2013) 가이드라인에 따라 직선성, 정확성, 검출한계(limit of detection, LOD), 정량한계(limit of quantitation, LOQ) 및 회수율을 측정하여 유효성을 검증하였다. 직선성은 혼합 표준용액 농도 BA와 DHA 0.
- 3배 이상인 농도로 계산하였으며, LOQ는 S/N비가 10배 이상인 농도로 계산하였다. LOD와 LOQ는 혼합 표준용액을 단계적으로 희석하여 6회 반복 분석하여 얻은 검 량선의 기울기와 y-절편의 표준편차를 이용하여 축수산물 유해물질 분석법 편람(식품의약품안전평가원, 2014)에 따라 값을 구하였다. 회수율과 매질효과는 Matuszewski 등(2003)의 방정식에 따라 측정하였다.
- 4. Recovery data and % matrix effects data for nine preservatives obtained using extraction procedure with distillation method (A) and SPE method (B) (n=6). Mean % recovery for preservatives spiked in sausage at 10 mg/L, 5 mg/L and 2 mg/L concentrations.
- 축산물의 가공기준 및 성분규격에 따른 EtOH screening과 SPE 시험용액 조제에 각각 1 g과 5 g의 시료를 사용하였다. 식품공전에 기재된 HPLC 분석을 위한 수증기 증류법에는 시료 50 g을 사용하였다.
- LOD와 LOQ는 혼합 표준용액을 단계적으로 희석하여 6회 반복 분석하여 얻은 검 량선의 기울기와 y-절편의 표준편차를 이용하여 축수산물 유해물질 분석법 편람(식품의약품안전평가원, 2014)에 따라 값을 구하였다. 회수율과 매질효과는 Matuszewski 등(2003)의 방정식에 따라 측정하였다.
성능/효과
- 4B). 10.0 mg/L의 농도로 첨가한 BA, SA 및 DHA의 회수율은 각각 97.14%, 106.73% 및 98.91%로 양호하였으며, RSD%는 각각 12.07, 7.97 및 9.79로 조사되었다. 그리고 10.
- BA의 평균회수율 108.33∼110.28%, 매질효과 1.87∼5.48%, SA의 평균회수율 105.41∼120.42%, 매질효과 1.17∼6.50%, DHA의 평균회수율 108.02∼114.27%, 매질효과 1.13∼10.61%, MP의 평균회수율 108.61∼114.03%, 매질효과 2.47∼8.78%, EP의 평균회수율 103.61∼110.88%, 매질효과 1.82∼10.77%이었다.
- ESI negative mode에서 주로 사용하는 용매로 ammonium acetate와 ammonium formate에 대해서도 검토하였다. Noise 제거, 머무름, 분리도 및 감도를 고려하여 ammonium acetate를 선택하였으며, 순차적으로 ammonium acetate 농도를 변화시키면서 적정농도를 확인한 결과 20 mM이 가장 적합하였다. Lv 등(2012)이 20 mM ammonium acetate-0.
- SA의 정성이온(111.0→66.9)은 고농도에서는 S/N비가 정량이온(111.0→83.0)의 것보다 우수하지만, 저농도에서는 Fig. 2에서처럼 S/N비가 저하되는 것이 관찰되었다.
- 56로 조사되었다. 그리고 10.0 mg/L의 농도로 첨가한 MP, EP, IPP, PP, IBP 및 BP의 회수율은 29.45%, 52.20%, 73.68%, 65.18%, 76.42% 및 73.61%로 조사되어 앞선 3종류 보존료의 회수율보다 낮았다(Fig. 4A). 9종 보존료의 평균회수율은 다음과 같았다.
- 79로 조사되었다. 그리고 10.0 mg/L의 농도로 첨가한 MP, EP, IPP, PP, IBP 및 BP의 회수율은 78.94%, 75.29%, 60.65%, 60.99%, 48.53% 및 44.77%로 조사되었다(Fig 4B). 따라서 우리나라에서 paraben에 대한 축산물의 가공기준 및 성분규격은 불검출로 규정하고 있어 회수율을 고려하여 시료 전처리 방법을 개선해야 할 것으로 생각한다.
- 따라서 9종의 보존료에 대한 평균회수율은 98.60∼109.16%, 상대표준편차는 0.80∼8.93% 그리고 매질효과는 −5.64∼10.26%로 조사되었으며, 다른 시료 전처리 방법보다 가장 우수한 회수율을 보였다(Fig. 6).
- 보존료를 2.0∼10.0 mg/L의 수준으로 첨가한 소시지로부터 평균 회수율은 98.60∼109.16% 범위이었으며, 상대표준편차는 8.93%이하로 조사되었다.
- 이번 연구에서 수증기 증류법과 SPE 전처리 방법에 대한 실험한 결과 BA, SA 그리고 DHA가 비교적 좋은 회수율로 조사되었으며, 6종 paraben은 회수율이 좋지 않았다. 수증기 증류법에 의한 시료 전처리에서 MP의 회수율은 첨가농도 2 mg/L의 시료에서 14.83%로 이번 연구에서 가장 낮은 회수율로 조사되었다. 수증기 증류법에서 가장 좋은 회수율은 89.
- 수증기 증류법에서 가장 좋은 회수율은 89.99∼99.59%로 조사된 DHA이었고, SPE 전처리 방법에서 가장 좋은 회수율은 98.17∼106.73%로 조사된 SA이었다.
- 이번 실험에서 Sep-Pak® C18 카트리지를 이용한 paraben의 회수율 15.74∼78.94%보다 Tsuruda 등(2013)이 보고한 Oasis-WAX 카트리지를 이용한 회수율이 좋은 결과를 보였다.
- 이번 연구에서 6종 paraben의 LOD와 LOQ는 각각 0.0003∼0.001 mg/L와 0.001∼0.002 mg/L로 Lv 등(2012)의 결과보다 우수하였다.
- 이번 연구에서 수증기 증류법과 SPE 전처리 방법에 대한 실험한 결과 BA, SA 그리고 DHA가 비교적 좋은 회수율로 조사되었으며, 6종 paraben은 회수율이 좋지 않았다. 수증기 증류법에 의한 시료 전처리에서 MP의 회수율은 첨가농도 2 mg/L의 시료에서 14.
- 수증기 증류법을 이용하여 증류액 500 mL을 취한 다음, 이를 여과하여 LC-MS/MS로 평균회수율을 분석하였다. 이중 10.0 mg/L의 농도로 첨가한 BA, SA 및 DHA의 회수율은 각각 88.25%, 94.46% 및 99.59%로 양호하였으며, RSD%는 각각 8.68, 8.43 및 6.56로 조사되었다. 그리고 10.
- 33%으로 조사되었다. 한편, 확립된 분석법을 소시지에 대한 보존료의 동시 분석에 적합하다고 판단되어 광주지역에서 유통 중인 소시지 33건을 대상으로 조사한 결과 모두 불검출로 확인되었다.
- 회수율은 BA 94.35∼105.98%, SA 97.08∼108.19%, DHA 95.41∼109.94%, MP 97.71∼105.80%, EP 97.23∼105.28%, IPP 96.07∼106.66%, PP 95.09∼105.71%, IBP 98.32∼104.00%, BP 99.57∼104.56%이었으며, 9종 보존료에 대한 일내 상대표준편차(RSD%)가 6.16이하, 일간 상대표준편차는 13.33% 이하의 결과를 확인하였다.
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