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문제 정의
- , 2014; Shin, 2009; Shin and Rho, 2014)되고 있으나 아직까지 같은 방법으로 적용된 PVT 진단법은 보고되지 않았다. 따라서 본 연구에서는 감자 등에 감염될 수 있는 PVT를 검출할 수 있는 진단시스템을 개발하였다.
- Potato virus T (PVT)는 group IV (+) sense ssRNA viruses, Betaflexiviridae과에 속하는 식물병원체로, 주요기주는 감자이며 울루코, 괭이밥속 및 마수아 등에서도 보고된 바 있다. 본 연구에서는 PVT를 특이적으로 검출할 수 있는 RT-PCR과 nested PCR 검사방법 개발을 목적으로 하였다. 최종적으로 2개의 RT-PCR 조합이 선발되었으며, 산물은 각각 734와 828 bp를 증폭하였다.
제안 방법
- PVT를 특이적으로 검출 할 수 있는 최종 RT-PCR 프라이머 조합 중 검출감도가 높은 하나의 조합을 선정하였고, nested PCR 증폭산물이 반응하는 산물에 제한효소 Xho I이 반응할 수 있는 염기서열 ‘CTCGAG’ (6 bp)를 삽입하였다(Lee and Shin, 2014).
- , 2013). 또한, 추출한 PVT의 RNA를 정량하고 10-8까지 10배 단계희석 후 RT-PCR 검사법의 검출감도 실험을 수행하였다.
- PVT의 특이적인 프라이머는 총 16개(정방향 8, 역방향 8개)가 제작되었고, 각각의 위치와 염기서열 정보는 Table 1과 같다. 정방향 및 역방향 프라이머들을 조합하여, 최초 348-1,230 bp의 PCR 증폭이 가능한 32개 조합을 구성하였다. PVT의 RNA를 주형으로 특이적 실험을 수행한 결과, 32개의 조합 중 반응 강도가 뛰어나고, 진단에 장애를 주는 비 특이적 밴드가 형성되지 않은 12개의 조합(조합 1, 5, 6, 9, 14, 18, 19, 23, 24, 28, 29 및 32)을 선발하였다(Fig.
- 최종 선발한 PVT RT-PCR에 대한 각각의 nested PCR을 수행할 수 있도록 특이적 프라이머를 조합하였다. RT-PCR 프라이머 조합 6의 nested PCR 프라이머 조합은 PVT-N30과 PVT-C70이며, 조합 29의 nested PCR 프라이머 조합은 PVT-N70과 PVT-C30으로 설계되었고, 각각 315 및 529 bp을 증폭하여 PVT에 대한 특이성이 분석되었다(Fig.
- PVT를 특이적으로 검출 할 수 있는 최종 RT-PCR 프라이머 조합 중 검출감도가 높은 하나의 조합을 선정하였고, nested PCR 증폭산물이 반응하는 산물에 제한효소 Xho I이 반응할 수 있는 염기서열 ‘CTCGAG’ (6 bp)를 삽입하였다(Lee and Shin, 2014). 최종적으로 염기서열분석을 통해 삽입 여부를 분석하였다.
- 1A). 특이적 밴드로 선발된 12개의 조합을 대상으로 PVT와 유연관계 및 관련 숙주에 감염될 가능성을 가진 15종의 참고바이러스주 핵산을 반응하여 비 특이적인 반응을 분석하였다. 참고바이러스주들과의 비 특이적 분석결과 12개 조합 중 3개 조합(조합 19, 23 및 24)에서 비 특이적 밴드가 형성된 반면 나머지 9개 조합에서는 비 특이적 밴드가 형성되지 않았다(Fig.
대상 데이터
- 정방향 및 역방향 프라이머들을 조합하여, 최초 348-1,230 bp의 PCR 증폭이 가능한 32개 조합을 구성하였다. PVT의 RNA를 주형으로 특이적 실험을 수행한 결과, 32개의 조합 중 반응 강도가 뛰어나고, 진단에 장애를 주는 비 특이적 밴드가 형성되지 않은 12개의 조합(조합 1, 5, 6, 9, 14, 18, 19, 23, 24, 28, 29 및 32)을 선발하였다(Fig. 1A). 특이적 밴드로 선발된 12개의 조합을 대상으로 PVT와 유연관계 및 관련 숙주에 감염될 가능성을 가진 15종의 참고바이러스주 핵산을 반응하여 비 특이적인 반응을 분석하였다.
- PVT의 특이적 프라이머 선발을 위하여 PVT 및 15개의 참고바이러스 주[Alfalfa mosaic virus (AMV), Andean potato mottle virus (APMoV), Arracacha virus B (AVB), Cucumber mosaic virus (CMV), Potato spindle tuber viroid (PSTVd), Potato virus A (PVA), Potato virus S (PVS), Potato virus X (PVX), Potato virus Y (PVY), Tobacco mosaic virus (TMV), Tobacco necrosis virus (TNV), Tomato mosaic virus (ToMV), Tobacco rattle virus (TRV), Tobacco streak virus (TSV) 및 Tomato spotted wilt virus (TSWV)]의 이병시료, RNA 또는 cDNA를 구매(Adgen, England; Bione, Korea) 또는 수집하였다. 또한 PVT의 특이적 프라이머는 BioEdit version 7.
- PVT의 특이적인 프라이머는 총 16개(정방향 8, 역방향 8개)가 제작되었고, 각각의 위치와 염기서열 정보는 Table 1과 같다. 정방향 및 역방향 프라이머들을 조합하여, 최초 348-1,230 bp의 PCR 증폭이 가능한 32개 조합을 구성하였다.
- 유전자변형-양성대조구 제작을 위하여 RT-PCR 조합 29의 nested PCR 프라이머 조합을 선정하였다. Nested PCR (PVT-N70/PVT-C30, 529 bp) 증폭산물을 대상으로 제한효소 Xho I이 반응할 수 있는 염기서열 ‘CTCGAG’ (6 bp)를 삽입하였으며, 염기서열을 분석한 결과 6개의 염기서열 삽입이 분석되었다(Fig.
- 1B). 이에 따라 증폭위치, 산물의 증폭크기 및 밴드의 강도 등을 고려하여 최종적으로 조합 6과 29를 선발하였다. 또한 최초 PVT가 포함된 RNA 농도는 150.
이론/모형
- PCR 진단시스템에서 실험실 오염으로 인한 거짓 양성반응을 검증할 수 있는 양성대조구로 개발을 위하여, pGEM®- T easy vector (Promega, USA)와 site-directed mutagenesis kit (Enzynomics, Korea)를 사용하였다(Nelson and McClelland, 1992).
- PVT의 특이적 프라이머 선발을 위하여 PVT 및 15개의 참고바이러스 주[Alfalfa mosaic virus (AMV), Andean potato mottle virus (APMoV), Arracacha virus B (AVB), Cucumber mosaic virus (CMV), Potato spindle tuber viroid (PSTVd), Potato virus A (PVA), Potato virus S (PVS), Potato virus X (PVX), Potato virus Y (PVY), Tobacco mosaic virus (TMV), Tobacco necrosis virus (TNV), Tomato mosaic virus (ToMV), Tobacco rattle virus (TRV), Tobacco streak virus (TSV) 및 Tomato spotted wilt virus (TSWV)]의 이병시료, RNA 또는 cDNA를 구매(Adgen, England; Bione, Korea) 또는 수집하였다. 또한 PVT의 특이적 프라이머는 BioEdit version 7.1.3 (Hall, 1999)와 DNAMAN DNA analysis software package version 6.0 (Lynnon Biosoft, Canada)를 사용하여 탐색하였다(Lee and Shin, 2014).
성능/효과
- 최종 선발한 PVT RT-PCR에 대한 각각의 nested PCR을 수행할 수 있도록 특이적 프라이머를 조합하였다. RT-PCR 프라이머 조합 6의 nested PCR 프라이머 조합은 PVT-N30과 PVT-C70이며, 조합 29의 nested PCR 프라이머 조합은 PVT-N70과 PVT-C30으로 설계되었고, 각각 315 및 529 bp을 증폭하여 PVT에 대한 특이성이 분석되었다(Fig. 2).
- 더욱 높은 검출감도로 PVT를 검출할 수 있으며 RT-PCR을 검증하기 위한 nested PCR 프라이머 조합은 734→315 bp와 828→529 bp 크기로 각각 증폭되었다.
- 또한 최초 PVT가 포함된 RNA 농도는 150.4 ng/μl로 측정되었으며, 이것을 단계희석하여 최종 선발한 RT-PCR 프라이머 조합 6과 29의 검출감도를 분석한 결과 두 개 조합이 모두 10-6으로 분석됨에 따라 PVT 진단을 위한 적합한 RT-PCR 프라이머 조합으로 분석되었다(Fig. 1C).
- 본 연구에서는 PVT를 특이적으로 검출할 수 있는 RT-PCR과 nested PCR 검사방법 개발을 목적으로 하였다. 최종적으로 2개의 RT-PCR 조합이 선발되었으며, 산물은 각각 734와 828 bp를 증폭하였다. 더욱 높은 검출감도로 PVT를 검출할 수 있으며 RT-PCR을 검증하기 위한 nested PCR 프라이머 조합은 734→315 bp와 828→529 bp 크기로 각각 증폭되었다.
후속연구
- , 2014; Shin, 2009; Shin and Rho, 2014), 이러한 진단 시스템들은 검역현장 등 검사수요가 많은 기관에서 표준 검사방법으로 활용 중이다. 또한 검역바이러스 등 수집하기 힘든 대하여 유전자합성을 기반으로 PCR 및 nested PCR 진단시스템을 개발한 사례가 보고되는 등 향후에도 관련된 연구가 지속적으로 필요할 것이라고 사료된다(Lee et al., 2014). 한편 본 연구에서 개발한 분자생물학적 진단 시스템은 향후 감자 등 관련 작물에서 PVT를 진단하는데 기여할 것이라고 기대된다.
- 더욱 높은 검출감도로 PVT를 검출할 수 있으며 RT-PCR을 검증하기 위한 nested PCR 프라이머 조합은 734→315 bp와 828→529 bp 크기로 각각 증폭되었다. 또한, 본 연구에서 개발한 유전자변형-양성대조구 플라스미드는 PVT 검출에서 실험실 오염 검증에 사용될 것이다. 본 연구는 감자 및 PCT 관련 숙주에서 PVT를 진단하는데 기여할 것이다.
- 또한, 본 연구에서 개발한 유전자변형-양성대조구 플라스미드는 PVT 검출에서 실험실 오염 검증에 사용될 것이다. 본 연구는 감자 및 PCT 관련 숙주에서 PVT를 진단하는데 기여할 것이다.
- , 2014). 한편 본 연구에서 개발한 분자생물학적 진단 시스템은 향후 감자 등 관련 작물에서 PVT를 진단하는데 기여할 것이라고 기대된다.
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