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문제 정의
- 따라서, 본 연구에서는 가정에서 직접 제조된 매실농축액과 상업용 매실농축액을 수집하여 에틸카바메이트의 분석방법을 정립하여 정량 분석한 후, 매실농축액 섭취를 통한 에틸카바메이트의 노출량을 추정하고자 하였다.
- 본 연구에서는 매실농축액의 에틸카바메이트의 존재 여부를 확인하기 위하여 분석방법을 정립하고 우리 국민이 섭취하고 있는 매실농축액을 수집하여 그 존재를 확인함으로써 건강 위해 요인을 확인하는데 목적을 두었다. 매실농축액을 중화시킨 후 고체상 추출법을 이용하여 수분과 비극성 물질을 제거하였다.
제안 방법
- 2011년 국민영양통계에서 우리 국민의 체중 kg 당 1인1 일 매실농축액 평균섭취량(Korea Health Industry Devel opment Institute 2013)과 본 연구에서 얻은 매실농축액의에틸카바메이트 함량을 이용하여 우리 국민의 에틸카바메이트 노출량을 추정하였다. BMDLUbenchmark dose lower confidence limit)은 mice의 폐포 및 세기관지 선종 또는 암종 (alveolar and bronchiolar adenoma or carcinoma) 에서 도출된 0.
- 5, 10, 25, 50, 100 ng의 5가지농도로 조제하여 검량곡선을 작성하였다. 검량곡선은 표준용액에서 얻어진 표준물질과 내부표준물질의 m/z 62와 m/z 64의 피크에 대한 면적 비율을 Y 축으로 하고 표준용액과 내부표준물질의 농도 비율을 X축으로 하여 검량곡선을 작성하였다. 시료의 면적 비를 Y축에 대입하여 에틸카바메이트의 농도를 계산하였다.
- 분석법의 유효성을 검증(method validation) 하기 위해 intra-day는 동일한 날에 3가지 농도를 각각 3 반복으로 실시하였으며, inter-day는 서로 다른 날짜에 3일 동안 1반복씩 실시하여 회수율을 측정하였다. 검출한계(limit of detection, LOD) 와 정량한계 (limit of quantification, LOQ)는 최소농도의 표준편차와 검량선의 기울기를 이용하여 계산하였다.
- 용출액은 25°C 이하의 water bath(SB-1200, EYELA, Shanghai, China) 에서2-3 mL로 감압농축 하였다. 농축액을 파스퇴르 피펫(Hilgenberg GmbH, Malsfeld, Germany)으로 눈금이 있는v-vial 로 옮기고 플라스크에 남아있는 농축액을 디클로로메탄 1 mL 로 2 회 씻어 옮긴 후 질소농축기 (EYELA, MG- 2200, Tokyo, Japan) 를 이용하여 1 mL 로 정확하게 농축하였다. 농축액은 Table 1의 분석조건에서 기체크로마토그래피/질량분석기(7820A Gas Chromatograph/5977E Mass Spectrometer, Agilent Technologies Inc.
- 디 클로로메탄을 이용하여 내부표준용액은 400 ng/mL 로 희석하고, 표준용액은 7.5, 10, 25, 50, 100 ng의 5가지농도로 조제하여 검량곡선을 작성하였다. 검량곡선은 표준용액에서 얻어진 표준물질과 내부표준물질의 m/z 62와 m/z 64의 피크에 대한 면적 비율을 Y 축으로 하고 표준용액과 내부표준물질의 농도 비율을 X축으로 하여 검량곡선을 작성하였다.
- 2). 따라서, 선택성과 감도가 높은 토막이온인 m/z 62(에틸카바메이트)와 m/z 64(d5-ethyl carbamate) 가 에틸카바메이트의 정량 분석에 이용되었다. 에틸카바메이트의 농도 별(7.
- 2008) 에 근거하였으며, 분석효율을 높이기매실농축액의 에틸카바메이트 분석과 노출량 평가 113위해 전처리 방법을 일부 수정하였다. 매실농축액 (pH 2.76~3.14)은 1 N 수산화나트륨 용액으로 중화시킨 후 pH meter(3200P, Agilent, Shanghai, China)로 확인하였다.중화된 시료 10 g을 칭량하여 내부표준물질인 ds-ethyl carbamate(250 卩 L of 400 ng/mL) 를 첨가하고 증류수를 가해 총 40 g 이 되게 한 후 염화나트륨을 첨가하였다.
- 사용하여 측정하였다. 매실농축액에 3가지 농도의 에틸카바메이트(10, 50, 100 ng)와 내부표준물질인 ds-ethyl carbamate(100 ng)을 첨가하여 시료와 동일한 방법으로 분석하였다. 분석법의 유효성을 검증(method validation) 하기 위해 intra-day는 동일한 날에 3가지 농도를 각각 3 반복으로 실시하였으며, inter-day는 서로 다른 날짜에 3일 동안 1반복씩 실시하여 회수율을 측정하였다.
- 두었다. 매실농축액을 중화시킨 후 고체상 추출법을 이용하여 수분과 비극성 물질을 제거하였다. 에틸카바메이트의 검출한계(2.
- 매실농축액에 3가지 농도의 에틸카바메이트(10, 50, 100 ng)와 내부표준물질인 ds-ethyl carbamate(100 ng)을 첨가하여 시료와 동일한 방법으로 분석하였다. 분석법의 유효성을 검증(method validation) 하기 위해 intra-day는 동일한 날에 3가지 농도를 각각 3 반복으로 실시하였으며, inter-day는 서로 다른 날짜에 3일 동안 1반복씩 실시하여 회수율을 측정하였다. 검출한계(limit of detection, LOD) 와 정량한계 (limit of quantification, LOQ)는 최소농도의 표준편차와 검량선의 기울기를 이용하여 계산하였다.
- 시료 전처리 방법은 포도주에서 에틸카바메이트를 분석하는 방법인 식약처 공고 2008-35호 (Korea Food and Drug Administration 2008) 에 근거하였으며, 분석효율을 높이기매실농축액의 에틸카바메이트 분석과 노출량 평가 113위해 전처리 방법을 일부 수정하였다. 매실농축액 (pH 2.
- 검량곡선은 표준용액에서 얻어진 표준물질과 내부표준물질의 m/z 62와 m/z 64의 피크에 대한 면적 비율을 Y 축으로 하고 표준용액과 내부표준물질의 농도 비율을 X축으로 하여 검량곡선을 작성하였다. 시료의 면적 비를 Y축에 대입하여 에틸카바메이트의 농도를 계산하였다.
- 에틸카바메이트 10, 50, 100 ng과 내부표준물질인 d5- ethyl carbamate 100 ng 을 시료에 첨가하여 회수율, 검줄한계(LOD), 검량한계(LOQ)를 확인하였다. 검출한계(LOD) 및 정량한계(LOQ)는 각각 2.
- 545 ng/g을 매실농축액 섭취량에 곱하여 에틸카바메이트 노출량을 산출하였다. 에틸카바메이트 섭취량에 의한 노출력(MoE)은 폐포, 세기관지 선종 또는 암에 대한 BMDL10값인 0.25 mg/kg of body weight/day값을 이용하여 산출하였다. 조사대상자전체 또는 매실농축액 섭취자의 평균섭취량으로 계산된노출력 (MoE) 은 각각 2, 165, 440과 94, 150이었다.
- 따라서, 선택성과 감도가 높은 토막이온인 m/z 62(에틸카바메이트)와 m/z 64(d5-ethyl carbamate) 가 에틸카바메이트의 정량 분석에 이용되었다. 에틸카바메이트의 농도 별(7.5, 10, 25, 50, 100 ng/mL) 용액과 내부표준물질(100 ng/mL)의 면적 비 (에틸카바메이트/d5-ethyl carbamate)를 Y축으로 하고 농도비를 X축으로 하여 검량곡선을 작성하였다(Fig. 3). 표준 검량곡선은 직선성을 나타내었다.
- 23 g이었다(Table 3). 우리 국민의 에틸카바메이트 노출량을 평가하기 위해 매실농축액 31 개의 에틸카바메이트 평균함량인 11.545 ng/g을 매실농축액 섭취량에 곱하여 에틸카바메이트 노출량을 산출하였다. 에틸카바메이트 섭취량에 의한 노출력(MoE)은 폐포, 세기관지 선종 또는 암에 대한 BMDL10값인 0.
- 14)은 1 N 수산화나트륨 용액으로 중화시킨 후 pH meter(3200P, Agilent, Shanghai, China)로 확인하였다.중화된 시료 10 g을 칭량하여 내부표준물질인 ds-ethyl carbamate(250 卩 L of 400 ng/mL) 를 첨가하고 증류수를 가해 총 40 g 이 되게 한 후 염화나트륨을 첨가하였다. 고체상 주추solid phase extraction)칼럼인 Chem Elut(Agilent Technologies, Milwaukee, WI, USA)에 시료 용액을 얹고, 증류수 10 mL로 비커의 잔류물을 씻어 Chem Elut에 넣었다.
- 회수율은 에틸카바메이트가 검출되지 않은 매실농축액 시료를 사용하여 측정하였다. 매실농축액에 3가지 농도의 에틸카바메이트(10, 50, 100 ng)와 내부표준물질인 ds-ethyl carbamate(100 ng)을 첨가하여 시료와 동일한 방법으로 분석하였다.
대상 데이터
- 2014년 1~5월에 가정에서 직접 제조된 매실농축액 24 개를 전국에서 수집하였으며, 수집된 지역은 서울, 경기도, 강원도, 충청도, 경상도, 전라도이었다. 시중에 유통되고 있는 매실농축액 7개를 2014년 10월에 온라인으로 구입하였다.
- 내부표준물질인 diethyl carbamate는 CDN isotopes(Pointe- Claire, Quebec, Canada) 제품을 사용호]였다. 시료의 전처리에 사용된 정제컬럼(Chem Elut, 50 mL)은 Agilent(Milwaukee, WI, USA)에서 구입하였다.
- 강원도, 충청도, 경상도, 전라도이었다. 시중에 유통되고 있는 매실농축액 7개를 2014년 10월에 온라인으로 구입하였다.
- 실험에 사용된 디클로로메啟dichloromethane) 은 J.T. Baker사(California, PA, USA) 의 HPLC등급을 사용하였으며, 염화나트륨과 수산화나트륨 및 에틸카바메이트는 시그마-알드리치(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 내부표준물질인 diethyl carbamate는 CDN isotopes(Pointe- Claire, Quebec, Canada) 제품을 사용호]였다.
이론/모형
- 에틸카바메이트 표준용액과 diethyl carbamate 내부표준 용액은 AOAC(2000) 의 방법에 근거하여 제조되었다. 에틸카바메이트와 ds-ethyl carbamate를 칭량하여 아세톤에 녹여 1, 000 卩 g/mL 가 되도록 표준원액 및 내부 표준원액을 각각 제조하고, 아세톤을 가해 10 卩g/mL로 희석하였다.
성능/효과
- 매실과 설탕을 원료로 사용되는 매실농축액은 i) 발효.숙성 중 분해된 시안화수소와 고농도의 당에 존재하는 효모에 의해 생성된 에탄올과의 반응으로 에틸카바메이트가 생성될 수 있으며, ii) 에틸카바메이트는 수용성 물질이며 당에 의한 삼투압 현상으로 매실 내부의 수분이 용출되면서 시안화 화합물과 함께 용출 될 가능성이 있다. Park LY 등(2007)은 매실주 제조 시 매실에 존재하는 에틸카바메이트 전구체인 시안 배당체는 숙성과정 중에 용출될 우려가 있으므로 침출기간은100일 이내가 적절하다고 하였다.
- 가정에서 제조된 24개 매실농축액 중 8개 시료에서 에틸카바메이트가 검출되었고, 나머지 16개 시료에서는 검출되지 않았다. 검출된 매실농축액의 범위는 3.
- 9%이었다. 가정에서 제조된 매실농축액 시료 2개의 에틸카바메이트 함량이 61-80 ng/g 범위로 높게 나타났다. 상업용 매실농축액의 에틸카바메이트검출 빈도는 가정용 매실농축액에 비해 높았지만, 전반적으로 에틸카바메이트 농도가 높지 않았다.
- 57%)가 국제기준에 부합되어, 매실농축액의 에틸카바메이트 분석에 적절한 것으로 나타났다. 가정에서 제조된 매실농축액과 상업용 매실농축액의 에틸카바메이트 검출농도 범위는 3.39-75.76 ng/g과 11.67-20.16ng/g이었으며, 총 시료 31개의 에틸카바메이트 평균함량은 11.545 ng/g이었다. 우리 국민의 체중 kg당 1인 1일 매실농축액의 평균섭취량과 본 연구에서 도출된 에틸카바메이트 함량을 곱하여 산출된 노출력 (MoE) 이 2, 165, 440 이었다.
- 4에 나타내었다. 가정용과 상업용 매실농축액 시료 중 에틸카바메이트가 검출된 시료의 빈도는 각각 33.3% 와 42.9%이었다. 가정에서 제조된 매실농축액 시료 2개의 에틸카바메이트 함량이 61-80 ng/g 범위로 높게 나타났다.
- 감도가 높은 질량분석기를 검출기로 사용하여 50에서 200 원자질량범위 에서 주사된 총이 온크로마트그램(total ion chromatogram)에서 에틸카바메이트와 내부표준물질인 ds-ethyl carbamate 가 분리되었다(Fig. 1). 에틸카바메이트의 질량스펙트럼에서 m/z 62, 74, 89^ 주 토막이온이었으며, ds-ethyl carbamate 의 질량스펙트럼에서는 m/z 64, 76, 94가 주요 토막이온이었다(Fig.
- 않았다. 검출된 매실농축액의 범위는 3.39-75.76 ng/g 이였으며, 분석된 모든 시료의 평균 함량은 8.14 ng/g 이었다. 상업용 매실농축액 7개 중 3개 시료에서 에틸카바메이트가 검출되었으며, 나머지 4개 매실농축액에서는 검출되지 않았다.
- 17 g 으로 평균섭취량에 비해 5배 정도 높았다. 결과적으로 과다섭취자<95%)의 노출력 (MoE) 도 18, 508로 크게 감소되어, 유럽식품안전청이 에틸카바메이트의 노출량이 우려되는 수치라고 보고한 18, 000에 매우 근접하였다.
- 57%이었다. 또한 3일 동안 반복적인 작업을 실시하여 도출된 일간 정확성은 100.09- 114.30%이었으며, 정밀성은 6.97-11.03%로 나타났다. Codex 에서 제시하는 10-100 ng/g 인 화합물의 정량분석에 적합한 정확도와 정밀도의 범위가 70~120%이므로 (Codex Alimentarius Commission 2007), 본 연구의 분석법은 국제 기준에 적합하다고 판단하였다.
- 14 ng/g 이었다. 상업용 매실농축액 7개 중 3개 시료에서 에틸카바메이트가 검출되었으며, 나머지 4개 매실농축액에서는 검출되지 않았다. 상업용 매실농축액 중 검출된 시료의 에틸카바메이트 검출 범위는 11.
- 상업용 매실농축액 7개 중 3개 시료에서 에틸카바메이트가 검출되었으며, 나머지 4개 매실농축액에서는 검출되지 않았다. 상업용 매실농축액 중 검출된 시료의 에틸카바메이트 검출 범위는 11.67-20.16 ng/g 이였으며, 분석된 모든 시료의 평균함량은 6.70 ng/g이었다. 가정에서 제조된 매실농축액과 상업용 매실농축액의 에틸카바메이트 함량 분포를 Fig.
- 매실농축액을 중화시킨 후 고체상 추출법을 이용하여 수분과 비극성 물질을 제거하였다. 에틸카바메이트의 검출한계(2.91 ng/g), 검량한계(8.83 ng/g), 정밀도(91.40-120.90%)및 정확도(12.57%)가 국제기준에 부합되어, 매실농축액의 에틸카바메이트 분석에 적절한 것으로 나타났다. 가정에서 제조된 매실농축액과 상업용 매실농축액의 에틸카바메이트 검출농도 범위는 3.
- 이상의 결과를 종합하였을 때 매실농축액에 존재하는 에틸카바메이트 함량은 우리 국민의 평균적인 식습관을 기준으로 건강에 유해하게 작용하지는 않을 것이다. 하지만, 매실농축액의 제조방법에 따라서 에틸카바메이트 함량이 차이가 클 뿐만 아니라 매실농축액 섭취량도 개인에 따라 큰 차이가 있으므로 지속적인 모니터링이 필요할 것이다.
- 25 mg/kg of body weight/day값을 이용하여 산출하였다. 조사대상자전체 또는 매실농축액 섭취자의 평균섭취량으로 계산된노출력 (MoE) 은 각각 2, 165, 440과 94, 150이었다. 유럽식품안전청은 에틸카바메이트의 노출력(MoE)이 18, 000 이상인 경우에는 우려되는 수준이 아니라고 하였다(European Food Safety Authority 2007).
- 구분하여 Table 2에 나타내었다. 하루에 반복적인 작업을 3회 실시하여 도출된 일내 정확성은 91.40-120.90% 이었으며, 정밀성은 5.37-12.57%이었다. 또한 3일 동안 반복적인 작업을 실시하여 도출된 일간 정확성은 100.
후속연구
- 최근, 매실을 이용한 다양한 발효식품이 음료 및 조미식품으로서의 이용이 증가함에 따라 매실관련 식품의 1인 1일 섭취량이 증가하고 있다. 따라서 매실 제품에 의한 위해성을 정확하게 평가하기 위해서는 매실농축액 이외의 다른 매실발효제품에서의 에틸카바메이트 정량이 필수적이며, 생성기전 등을 밝히는 연구가 필요하다고 하겠다.
- 하지만, 매실농축액의 제조방법에 따라서 에틸카바메이트 함량이 차이가 클 뿐만 아니라 매실농축액 섭취량도 개인에 따라 큰 차이가 있으므로 지속적인 모니터링이 필요할 것이다. 최근, 매실을 이용한 다양한 발효식품이 음료 및 조미식품으로서의 이용이 증가함에 따라 매실관련 식품의 1인 1일 섭취량이 증가하고 있다.
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