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문제 정의
- 본 연구에서는 염증의 전형적인 증상을 확인하기 위해 체중 변화 측정을 측정하였다. 생황금 추출물과 주초(酒炒) 한 황금 추출물에서 체중 감소를 대조군에 비해 유의하게 방지한 것을 확인할 수 있었다.
- 이에 본 연구에서는 황금과 에탄올 주초(酒炒)한 황금 추출물을 이용하여 LPS 유도된 급성 장염 모델을 쥐에서 항산화와 항염증에 대한 효과를 연구한 바이다.
제안 방법
- ICR mouse (6주령, 수컷)로부터 실험군을 총 4개의 군으로 정상군 (Normal) 5마리, 급성 장염을 유발하고 증류수 처리한 대조군 (Vehicle) 5마리, 급성 장염을 유발하고 황금 추출물을 100㎎/㎏으로 처리한 약물투여군 (SR) 5마리, 200℃ 주초(酒炒)한 황금 추출물을 100㎎/㎏으로 처리한 약물투여군 (SR200) 5마리로 나누어 황금 및 주초(酒炒)한 황금 추출물을 3일간 100 ㎎/㎏/body weight의 농도로 각 1회 경구 투여를 하였다. 마지막 약물 투여 1시간 후 LPS 20㎎/㎏ 체중의 농도로 복강주사를 실시하였다.
- 마지막 약물 투여 1시간 후 LPS 20㎎/㎏ 체중의 농도로 복강주사를 실시하였다. LPS 투여 24시간 후, 심장 천자 방법으로 혈액을 채취하여 즉시 원심분리기를 이용해 혈청을 분리하였고 그 후에, saline (0.9% NaCl, pH 7.4) 관류하여 장기를 채취해 분석 전까지 빠르게 –80℃ 보관하였다.
- 준비된 membrane에 각각의 1차 antibody 를 처리하여 4℃에서 overnight 시킨 다음 PBST로 6분마다 5회 세척하고, 각각 처리된 1차 항체에 사용되는 2차 항체 (PBST로 1:3000로 희석해서 사용)를 사용하여 상온에서 1시간 반응시킨 후, PBST로 6분마다 5회 세척하였다. 그리고 enhanced chemiluminescence (ECL) 용액을 GE Healthcare (Arlington Heights, IL, USA)에 노출시킨 후, Sensi-Q2000 Chemidoc (Lugen Sci Co., Ltd., Seoul, Korea)에 감광시켜 단백질 발현을 확인한 후, 해당 band를 ATTO Densitograph Software (ATTO Corporation, Tokyo, Japan) 프로그램을사용하여 정량하였다.
- 8% 수율로 추출되었다. 그리고 건조된 생황금 절편 또한 같은 방법으로 분쇄하여 22.8% 수율로 추출하였다.
- 급성 장염을 유발시킨 생쥐에 생황금(SR)과 200℃ 주초(酒 炒)한 황금(SR200) 추출물의 투여가 항산화 효과를 통한 장조직의 손상 및 항염증작용 효과를 알아본 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 마지막 약물 투여 1시간 후 LPS 20㎎/㎏ 체중의 농도로 복강주사를 실시하였다. LPS 투여 24시간 후, 심장 천자 방법으로 혈액을 채취하여 즉시 원심분리기를 이용해 혈청을 분리하였고 그 후에, saline (0.
- flavonoid계는 의학적 및 임상적으로 항균작용, 항알러지작용, 항바이러스작용, 항암작용, 항산화작용과 항염증작용 보고되었다36, 37). 본 연구에서는 황금이 LPS로 유도된 급성 장염 생쥐 모델38) 에서 생황금과 주초(酒炒)한 황금 추출물을 이용하여 항산화 및 항염증 효과를 측정하였다.
- 부검 시 심장에서 채취한 혈액을 원심 분리 후 혈청을 분리 하였다. 분리된 혈청을 이용하여 산화적 스트레스의 마커인 ROS와 NO를 측정하였다.
- 하였다. 분리된 혈청을 이용하여 산화적 스트레스의 마커인 ROS와 NO를 측정하였다. ROS에서 대조군은(708±15 fluorescence/min/ml) 정상군(456±20 fluorescence/min /ml (p<0.
- 동물 사육실의 조건은 conventional system으로 온도 22±2℃, 습도 50±5%, 명암주기(light : dark cycle)는 12시간 주기로 조절하였다. 사료는 고형사료 (조단백질 22.1% 이상, 조지방 8.0% 이하, 조섬유 5.0% 이하, 조회분 8.0% 이하, 칼슘 0.6% 이상, 인 0.4% 이상, 삼양사, 항생제 무첨가)와 물을 충분히 공급하였다. 대구한의대학교 동물실험 윤리위원회의 승인 (DHU 2015-014)을 얻어 시행하였으며 동물관리 규정을 준수하였다.
- 실험 기간 동안 체중 변화를 측정하였다. 정상군(2.
- 장 조직에서 western bolt을 실시하여 염증의 매개인자인 NF-B p65와 c-JUN을 측정하였다. 그 결과 NF-B p65 의 발현은 대조군(1.
- 장 조직에서 western bolt을 실시하여 항산화 효소인 SOD, CAT, GPx를 측정하였다. 그 결과 SOD의 발현은 대조군(0.
- 4℃에서 12,000rpm으로 10분간 원심 분리한 후 핵단백질을 포함하고 있는 상층액을 얻어 –80℃에서 각각 냉동 보관하였다. 장 조직의 세포질단백질의 SOD, CAT, GPx, iNOS, COX-2, TNF-, IL-6, β-actin 및 핵단백질 NF- B p65, c-JUN, Histone, 단백질의 발현을 측정하기 위해 10 ㎍의 단백질을 8~15% SDS-polyacrylamide gel을 이용하여 전기연동 후, acrylamide gel을 nitrocellulose membrane 으로 이동시켰다. 준비된 membrane에 각각의 1차 antibody 를 처리하여 4℃에서 overnight 시킨 다음 PBST로 6분마다 5회 세척하고, 각각 처리된 1차 항체에 사용되는 2차 항체 (PBST로 1:3000로 희석해서 사용)를 사용하여 상온에서 1시간 반응시킨 후, PBST로 6분마다 5회 세척하였다.
- 장의 세포질단백질을 얻기 위해 100 mM Tris-HCl (pH 7.4), 5mM Tris–HCl (pH 7.5), 2mM MgCl2, 15mM CaCl2, and 1.5M sucrose, and then 0.1M DTT and protease inhibitor cocktail을 첨가한 buffer A를 넣고 tissue grinder (Bio Spec Product, USA)로 분쇄한 후 10% NP-40 용액을 첨가하였다. 아이스 위에서 20분간 정치시킨 후 12,000 rpm으로 2분간 원심분리 하여 세포질 단백질을 포함하고 있는 상층액을 분리하였다.
- 정상군(2.0±0.2 (p<0.001)), LPS 유도된 급성 장염 생쥐인 대조군(-4.7± 0.3), 생황금 투여군(SR;-3.5±0.1 (p<0.05))과 주초(酒 炒)한 황금 투여군(SR200;-3.2±0.1 (p<0.01)) 체중 감소를 대조군에 비해 유의성 있게 방지하였다(Fig. 1).
- 장 조직의 세포질단백질의 SOD, CAT, GPx, iNOS, COX-2, TNF-, IL-6, β-actin 및 핵단백질 NF- B p65, c-JUN, Histone, 단백질의 발현을 측정하기 위해 10 ㎍의 단백질을 8~15% SDS-polyacrylamide gel을 이용하여 전기연동 후, acrylamide gel을 nitrocellulose membrane 으로 이동시켰다. 준비된 membrane에 각각의 1차 antibody 를 처리하여 4℃에서 overnight 시킨 다음 PBST로 6분마다 5회 세척하고, 각각 처리된 1차 항체에 사용되는 2차 항체 (PBST로 1:3000로 희석해서 사용)를 사용하여 상온에서 1시간 반응시킨 후, PBST로 6분마다 5회 세척하였다. 그리고 enhanced chemiluminescence (ECL) 용액을 GE Healthcare (Arlington Heights, IL, USA)에 노출시킨 후, Sensi-Q2000 Chemidoc (Lugen Sci Co.
- 아이스 위에서 20분간 정치시킨 후 12,000 rpm으로 2분간 원심분리 하여 세포질 단백질을 포함하고 있는 상층액을 분리하였다. 핵단백질을 얻기 위해 10% NP-40가 더해진 buffer A에 두 번 헹구고 100㎕ 의 buffer C (50mM HEPES, 50mM KCl, 0.3mM NaCl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 0.1mM PMSF and 10% glycerol)를 첨가해 재부유 시킨 뒤 10분마다 voltex를 3번 하였다. 4℃에서 12,000rpm으로 10분간 원심 분리한 후 핵단백질을 포함하고 있는 상층액을 얻어 –80℃에서 각각 냉동 보관하였다.
- 4)를 이용하여 분쇄하였다. 혈청 내의 ROS를 측정하기 위하여 25mM DCFH-DA를 혼합한 후, 형광 광도계를 이용하여 0분부터 매 10분씩 emission wavelength of 530nm와 excitation wavelength of 485 nm를 이용하여 30분간 측정한 산출 값을 계산하였다29). 혈청 NO 측정을 측정하기 위하여 Misko et al.
대상 데이터
- LPS from Escherichia coli (serotype O127:B8, purity over 99.9%; L3137), Nitrocellulose membranes는 Amersham GE Healthcare (Little. Chalfont, UK)에서 구입하였고, Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), nuclear factor- kappa B p65 (NF-B p65), Inducible nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygenase-2 (COX-2), tumor necrosis factor alpha (TNF-), interleukin-6 (IL-6), superoxide dimutase (SOD), catalase(CAT), glutathione peroxidase(GPx), Histone, β-actin 과 2차 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였다. c-JUNe cell signaling에서 구입하였다.
- c-JUNe cell signaling에서 구입하였다. Protease inhibitor mixture DMSO, solutionethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka. Japan)에서 구입하였다. 또한, 2', 7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFH -DA)와 Dihydrorhodamine 123는 Molecular Probes (Eugene, OR, U.
- Chalfont, UK)에서 구입하였고, Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), nuclear factor- kappa B p65 (NF-B p65), Inducible nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygenase-2 (COX-2), tumor necrosis factor alpha (TNF-), interleukin-6 (IL-6), superoxide dimutase (SOD), catalase(CAT), glutathione peroxidase(GPx), Histone, β-actin 과 2차 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였다. c-JUNe cell signaling에서 구입하였다. Protease inhibitor mixture DMSO, solutionethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
- Japan)에서 구입하였다. 또한, 2', 7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFH -DA)와 Dihydrorhodamine 123는 Molecular Probes (Eugene, OR, U.S.A.)에서 ECL Western Blotting Detection Reagents는 GE Healthcare로부터 구입하여 사용하였다. 단백질 정량을 위한 BCA protein assay kit는 Thermo Scientific (Rockford, IL, USA)에서 구입하였다.
- 본 실험에 사용한 황금은 Ominherb ㈜ (영천, 한국) 에서구입한 것으로 생약규격집에 맞춰 관능검사하여 약전 규격에 합격한 것만을 선정하여 사용하였고, 관능검사는 대구한의대학교 한의과대학 노성수 교수에 의해서 실시되어졌다.
- 실험에 사용된 동물은 ICR 생쥐 6주령 수컷으로 샘타코 (오산, 한국)에서 구입하여 일주일 동안 실험실 환경에 적응시킨 후 사용하였다. 동물 사육실의 조건은 conventional system으로 온도 22±2℃, 습도 50±5%, 명암주기(light : dark cycle)는 12시간 주기로 조절하였다.
데이터처리
- 모든 수치는 평균±표준오차 (Mean±S.E)로 표시하였으며, SPSS (18.0 for Windows program)을 사용하여 one-way analysis of variance (ANOVA)로 유의수준 p-value<0.05 에서 검정하였다.
이론/모형
- 42). 본 실험에서는 장 조직에서 항산화 효소 단백질을 측정하기 위해 western blot를 실시하였다. 생황금 추출물에서는 SOD, CAT와 GPx 모두 유의성 없이 감소하는 경향만 있었고, 주초(酒炒)한 황금에서는 SOD를 제외한 CAT와 GPx는 정상군처럼 유의하게 증가하였다.
- 혈청 내의 ROS를 측정하기 위하여 25mM DCFH-DA를 혼합한 후, 형광 광도계를 이용하여 0분부터 매 10분씩 emission wavelength of 530nm와 excitation wavelength of 485 nm를 이용하여 30분간 측정한 산출 값을 계산하였다29). 혈청 NO 측정을 측정하기 위하여 Misko et al., 30)의 방법을 시행하여 측정하였다.
성능/효과
- 1. 황금 추출물 투여군과 200℃ 주초(酒炒)한 황금 추출물투여 군은 LPS에 의하여 유도된 급성 장염 모델 생쥐에 비해 체중 감소를 유의하게 방지하였다.
- 2. 황금 추출물 투여군은 LPS에 의하여 증가한 혈액 내의 ROS와 NO를 감소하는 경향을 확인하였고, 200℃ 주초(酒炒)한 황금 추출물 투여군은 모두 유의성있게 감소하였다.
- LPS에 의하여 급성 장염 모델 생쥐의 장 조직 내에서 감소한 항산화 효소 단백질인 SOD는 황금 추출물 투여군에서 증가하는 경향을 확인했고 CAT와 GPx는 유의하게 증가하였다. 200℃ 주초(酒炒)한 황금 추출물투여 군은 SOD에서 증가하는 경향을 확인하였고, CAT 와 GPx는 정상 수준으로 회복시켰다.
- 3. LPS에 의하여 급성 장염 모델 생쥐의 장 조직 내에서 감소한 항산화 효소 단백질인 SOD는 황금 추출물 투여군에서 증가하는 경향을 확인했고 CAT와 GPx는 유의하게 증가하였다. 200℃ 주초(酒炒)한 황금 추출물투여 군은 SOD에서 증가하는 경향을 확인하였고, CAT 와 GPx는 정상 수준으로 회복시켰다.
- 4. LPS에 의하여 급성 장염 모델 생쥐의 장 조직 내에서 증가한 전사인자인 c-JUN과 NF-B p65은 황금 추출물 투여군은 감소되는 경향을 확인할 수 있었고, 200℃ 주초(酒炒)한 황금 추출물 투여군은 NF-B p65의 발현이 감소되는 경향과 c-JUN에서 정상 수준으로 회복시켰다.
- 5. LPS에 의하여 급성 장염 모델 생쥐의 장 조직 내에서 증가한 COX-2, iNOS, TNF-와 IL-6의 발현은 황금 추출물 투여군에서 감소되는 경향을 확인할 수 있었고, 200℃ 주초(酒炒)한 황금 추출물 투여군은 COX-2, iNOS와 TNF-의 발현이 정상 수준으로 회복시켰지만 IL-6에서는 감소되는 경향만 확인되었다.
- p65와 c-JUN을 측정하였다. 그 결과 NF-B p65 의 발현은 대조군(1.18±0.16)은 정상군(1.00±0.11)에 비해 증가하는 경향이 있었고, 생황금 투여군(1.09±0.15)와주초(酒炒)한 황금 투여군에서는(0.90±0.10) 감소하는 경향이 있었다. 또, c-JUN의 발현은 대조군(1.
- CAT, GPx를 측정하였다. 그 결과 SOD의 발현은 대조군(0.82±0.04)은 정상군(1.00±0.06 (p<0.05))에 비해 유의하게 감소하였고, 생황금 투여군(0.81±0.06)과 주초(酒 炒)한 황금 투여군에서 (0.91±0.17) 증가하는 경향을 확인할 수 있었다. CAT의 발현 역시 대조군(0.
- 급성 장염 모델 생쥐에서 200℃ 주초(酒炒)한 황금 추출물 투여한 결과 항산화 관련 효소인 SOD, CAT와 GPx의 발현증가를 통해 c-JUN의 발현은 뚜렷하게 감소되었고 그로 인하여 발현되었던 iNOS48), COX-249), TNF-48)와 Ⅱ.
- 3). 또한 대조군의 장조직에서 COX-2, iNOS와 TNF-, IL-6의 발현을 확인한 결과, 대조군에서의 COX-2(1.63±0.16)의 발현은 정상군(1.00±0.10(p< 0.01))에 비해 크게 증가하였으나 생황금 투여군(1.52± 0.17)에서는 감소하는 경향이 있었고, 주초(酒炒)한 황금 투여군(1.20±0.10 (p<0.05)) 유의하게 감소하였다. iNOS의발현은 정상군(1.
- IL-6는 T세포 분화을 자극하고, 세포 성장, 생존 그리고 분화에 주요 조절자이면서 면역반응, 염증, 조혈 및 종양 형성과 같은 다양한 생물학적 반응을 관계돼 있다47). 본 실험에서는 western blot를 통해 NF-B p65와 AP-1 관련 염증 단백질과 염증 사이토카인의 발현을 측정한 결과 대조군에 비해서 생황금 추출물에서는 모두 감소하는 경향을 보았고, 주초(酒炒)한 황금 추출물은 유의성 있게 감소하였다. 하지만 IL-6의 발현은 감소하는 경향만 확인하였다.
- . 본 실험에서는 대조군에 비해 NF-B p65에서 추출물마다 유의한 차이를 얻진 못하였으나, c-JUN에서는 주초(酒炒)한 군에서 정상군에 가까운 유의한 차이를 얻을 수 있었다. NF-B p65와 c-JUN 과 같은 전사인자들은 iNOS와 COX-2와 같은 염증 효소를 조절하고, TNF-나 IL-6와 같은 염증성 사이토카인을 조절한다44).
- 따라서 ROS와, NO 억제는 조직 손상 개선에 주요한 요인이다. 본 연구에서는 혈액 내에서 산화적 스트레스의 바이오 마커인 ROS 및 NO 수치가 생황금 추출물에서는 유의성 없이 감소하는 경향이 있었지만 주초(酒炒)한 황금 추출물에서는 유의하게 감소하였다.
- 본 연구에서는 염증의 전형적인 증상을 확인하기 위해 체중 변화 측정을 측정하였다. 생황금 추출물과 주초(酒炒) 한 황금 추출물에서 체중 감소를 대조군에 비해 유의하게 방지한 것을 확인할 수 있었다.
- 본 실험에서는 장 조직에서 항산화 효소 단백질을 측정하기 위해 western blot를 실시하였다. 생황금 추출물에서는 SOD, CAT와 GPx 모두 유의성 없이 감소하는 경향만 있었고, 주초(酒炒)한 황금에서는 SOD를 제외한 CAT와 GPx는 정상군처럼 유의하게 증가하였다. 이를 통하여 생황금 추출물보다는 주초(酒炒)한 황금 추출물이 효과적으로 CAT와 GPx 발현 증가로 인해서 조직 손상을 억제하는 것으로 보여준다.
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