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문제 정의
- 따라서 효율적으로 한천을 분해할 수 있는 한천분해효소 개발이 해양바이오메스 홍조류의 이용에 절대적으로 필요하다. 본 연구그룹은 활성이 뛰어난 고온성 agarase를 생산하는 신규 미생물을 분리하기 위해, 대한민국 제주도 연안의 해수로부터 agarase를 생산하는 신규 미생물을 확보하여 동정하고 그 특성을 규명하였다. 본 연구에서는 agarase 생산균주 S4의 분리 및 동정, S4 균주가 생산하는 agarase 효소의 생화학적 특성을 서술하였다.
- 본 연구그룹은 활성이 뛰어난 고온성 agarase를 생산하는 신규 미생물을 분리하기 위해, 대한민국 제주도 연안의 해수로부터 agarase를 생산하는 신규 미생물을 확보하여 동정하고 그 특성을 규명하였다. 본 연구에서는 agarase 생산균주 S4의 분리 및 동정, S4 균주가 생산하는 agarase 효소의 생화학적 특성을 서술하였다.
제안 방법
- 회수된 균체로부터 genomic DNA를 Genomic DNA extraction kit(DyneBio, Korea)로 추출하여 PCR 주형으로 사용하였다. 16S rRNA 유전자는 bacterial universal primer(27F와 1492R)를 사용하여 증폭하였으며[21], 증폭된 DNA 단편은 pGEM-T easy vector(Promega, USA)에 클로닝 한 후 염기서열을 분석하였다. 분석된 16S rRNA 유전자 서열은 GenBank에 JN578474로 등록하였으며, National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 BlastN program[1]을 사용하여 GenBank database의 정보로부터 염기서열의 상동성 검사를 수행하였다.
- 1%로 agar가 첨가된 ASW-YPA 액체배지에 각각 5일 동안 배양하면서(40℃, 180 rpm), 24시간 간격으로 샘플을 채취하였다. 600 nm에서 흡광도를 측정하여 샘플의 균체 성장을 측정하였고, 15,000 rpm에서 10분간 원심분리 후 샘플 상등액만을 취하여 agarase 활성을 측정하였다. Agarase 활성은 0.
- pH 변화에 따른 균주 S4의 성장은, pH 4.0−11.0(pH 1.0의 간격)의 고체배지를 만들어 균주를 접종한 후 3일간 배양하여 성장을 관찰하였다.
- pH 조건에 따른 agarase의 효소활성은 pH 6.0−10.0(pH 1.0의 간격)의 조건에서 40℃에서 10분간 효소반응을 실시하여 측정하였다.
- 반면, agar 를 첨가하지 않은 배양액에서의 agarase 활성은 무시할만한 수준이었으며, 이는 균주의 agarase 유전자 발현이 agar에 의해 유도됨을 시사하고 있다. 균주 S4가 세포외부로 분비하는 총 agarase는 45℃와 pH 7.0에서 최상의 효소 활성을 보였으며, agarose를 분해하여 (neo)agarotetraose와 (neo)agarohexaose를 생산하였다.
- 균주 S4는 Gram stain kit(BD, USA)를 사용하여 염색한 후 현미경으로 관찰하였다. 균주 S4의 균체 크기 및 모양 그리고 flagella의 유무는 2일간 고체배지에서 배양된 균체를 1% phosphotungstic acid(PTA)로 염색한 후 투과전자현미경(JEM1010, JEOL, Japan)으로 관찰하였다.
- 균주 S4를 ASW-YP 액체배지와 최종농도 0.1%로 agar가 첨가된 ASW-YPA 액체배지에 각각 5일 동안 배양하면서(40℃, 180 rpm), 24시간 간격으로 샘플을 채취하였다. 600 nm에서 흡광도를 측정하여 샘플의 균체 성장을 측정하였고, 15,000 rpm에서 10분간 원심분리 후 샘플 상등액만을 취하여 agarase 활성을 측정하였다.
- 균주 S4의 24시간 배양액으로부터 준비된 조효소를 이용하여 agarose를 기질로 하는 효소반응을 유도한 후 반응산 물을 TLC로 분석하였다(Fig. 5). 그 결과, 균주 S4에 의해서 세포외부로 생산되는 agarase는 agarose를 분해하여 (neo)agarotetraose와 (neo)agarohexaose를 최종산물로 생산할 수 있음을 확인하였다.
- 균주 S4는 Gram stain kit(BD, USA)를 사용하여 염색한 후 현미경으로 관찰하였다. 균주 S4의 균체 크기 및 모양 그리고 flagella의 유무는 2일간 고체배지에서 배양된 균체를 1% phosphotungstic acid(PTA)로 염색한 후 투과전자현미경(JEM1010, JEOL, Japan)으로 관찰하였다. 탄소원 사용 및 발효, 효소생산 등의 생리적 특성은 API 20NE와 API ZYM kit(Biomérieux, France)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였다.
- 단, 제공되는 배지에 NaCl을 최종농도 1%가 되도록 첨가하여 40℃에서 3일간 배양한 후 관찰하였다. 균주 S4의 성장 특성은, NaCl을 최종농도 0, 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20%(w/v)가 되도록 첨가한 ASW-YP 고체배지에 균주를접종한 후 3일간 배양하여 성장을 관찰하였다. pH 변화에 따른 균주 S4의 성장은, pH 4.
- 탄소원 사용 및 발효, 효소생산 등의 생리적 특성은 API 20NE와 API ZYM kit(Biomérieux, France)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였다. 단, 제공되는 배지에 NaCl을 최종농도 1%가 되도록 첨가하여 40℃에서 3일간 배양한 후 관찰하였다. 균주 S4의 성장 특성은, NaCl을 최종농도 0, 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20%(w/v)가 되도록 첨가한 ASW-YP 고체배지에 균주를접종한 후 3일간 배양하여 성장을 관찰하였다.
- 분석된 16S rRNA 유전자 서열은 GenBank에 JN578474로 등록하였으며, National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 BlastN program[1]을 사용하여 GenBank database의 정보로부터 염기서열의 상동성 검사를 수행하였다. 또한 EzTaxon database(http://www.eztaxon.org/)로부터 표준 균주의 16S rRNA 유전자 서열을 확보하여 계통발생적 연관성을 분석하였다[7]. 확보된 염기서열들 간의 Multi alignment는 ClustalW program[25]을 사용하였고 5'-과 3'-말단의 gap은 BioEdit program[10]으로 편집하였다.
- 또한 배양온도에 따른 성장은 4, 15, 25, 37, 40, 45°C에서 각각 3일간 배양하여 성장 정도를 관찰하였다.
- 16S rRNA 유전자는 bacterial universal primer(27F와 1492R)를 사용하여 증폭하였으며[21], 증폭된 DNA 단편은 pGEM-T easy vector(Promega, USA)에 클로닝 한 후 염기서열을 분석하였다. 분석된 16S rRNA 유전자 서열은 GenBank에 JN578474로 등록하였으며, National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 BlastN program[1]을 사용하여 GenBank database의 정보로부터 염기서열의 상동성 검사를 수행하였다. 또한 EzTaxon database(http://www.
- 생화학적 특성 분석에는 균주 S4를 ASW-YP 고체배지로 40°C에서 2일간 배양 후 회수된 균체를 사용하였다.
- 진화적 거리(evolutionary distance matrix)는 Kimura’s two-parameter evolutionary model[12]에 의해 계산되었고, Neighbour-joining(NJ) 법[19]으로 계통수를 제작하였다. 신뢰도(bootstrap value)는 1,000회의 재구성된 자료로부터 새롭게 tree를 제작하여 계산하였다.
- 온도 조건에 따른 S4의 총 agarase의 효소활성을 조사하기 위해서, 준비된 조효소를 이용하여 20, 30, 37, 40, 45, 50°C에서 각각 agarose를 기질로 하는 효소 반응(20 mM Tris-Cl buffer, pH 7.0)을 10분간 실시하여, DNS법으로 활성을 측정하였다[16].
- 균주 S4를 ASW-YP 액체배지에서 2일간 진탕 배양 후 15,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 균체만을 회수하였다. 회수된 균체로부터 genomic DNA를 Genomic DNA extraction kit(DyneBio, Korea)로 추출하여 PCR 주형으로 사용하였다. 16S rRNA 유전자는 bacterial universal primer(27F와 1492R)를 사용하여 증폭하였으며[21], 증폭된 DNA 단편은 pGEM-T easy vector(Promega, USA)에 클로닝 한 후 염기서열을 분석하였다.
대상 데이터
- 대한민국 제주도 연안 해수로부터 agarase를 생산하는 균주 S4를 분리하였다. 균주 S4는 그람-음성의 막대형 세포로 부드러운 베이지색 원형 콜로니를 형성하며, 한 개의 극성편모를 갖는다.
- 도말한 평판고체배지는 40℃에서 1일간 배양한 후, Lugol's Iodine 용액(0.05 M Iodine in 0.12 M KI)으로 염색하여 colony 주변에 아가분해활성을 나타내 투명하게 보이는 colony를 300개 선별하였다.
- 12 M KI)으로 염색하여 colony 주변에 아가분해활성을 나타내 투명하게 보이는 colony를 300개 선별하였다. 이 중 최종적으로 활성이 우수한 균주 S4를 선택하여 본 연구에 사용하였다.
- 제주도 근해의 해수를 채취하여 멸균수에 10-1−10-5으로 희석한 후 ASW-YP 평판고체배지(6.1 g Tris base, 12.3 g MgSO4, 0.74 g KCl, 0.13 g(NH4)2HPO4, 17.5 g NaCl, 0.14 g CaCl2, 1% yeast extract, 0.3% bacto peptone; per liter; pH 7.2)에 도말하였다.
데이터처리
- 확보된 염기서열들 간의 Multi alignment는 ClustalW program[25]을 사용하였고 5'-과 3'-말단의 gap은 BioEdit program[10]으로 편집하였다.
이론/모형
- 이러한 결과로부터 균주 S4는 Vibrio 속의 한 종으로 판단되었다. 16S rRNA 유전자 서열을 토대로 표준균주들과의 계통발생적 연관관계를 규명하고자 N-J 법으로 계통수를 제작하였다. 그 결과, 균주 S4는 16S rRNA 유전자 서열 상동성 결과와 마찬가지로 V.
- 600 nm에서 흡광도를 측정하여 샘플의 균체 성장을 측정하였고, 15,000 rpm에서 10분간 원심분리 후 샘플 상등액만을 취하여 agarase 활성을 측정하였다. Agarase 활성은 0.2% agarose를 기질로 하는 3,5-dinitrosalicylic acid(DNS)법[8]으로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 단, 효소반응은 20 mM Tris-Cl buffer(pH 7.
- 생화학적 특성 분석에는 균주 S4를 ASW-YP 고체배지로 40°C에서 2일간 배양 후 회수된 균체를 사용하였다. 균체의 지방산은 methyl ester화[17] 시킨 fatty acid methyl esters(FAME) 혼합물을 Microbial Identification System(MIDI Inc., USA)의 지침에 따라 gas chromatography(GC) 분석법으로 분석하였다[20]. Genomic DNA의 G+C 농도는 역상-HPLC를 이용하였다[15].
- 0)에 첨가한 후 40°C에서 24시간 동안 반응하였다. 반응액은 Temuujin 등[23]에 의해서 서술된 방법에 따라서 silica gel 60 plate(Merck, USA)를 이용한 Thin layer chromatography(TLC)를 수행하여 가수분해산물을 분석하였다.
- 진화적 거리(evolutionary distance matrix)는 Kimura’s two-parameter evolutionary model[12]에 의해 계산되었고, Neighbour-joining(NJ) 법[19]으로 계통수를 제작하였다.
- 탄소원 사용 및 발효, 효소생산 등의 생리적 특성은 API 20NE와 API ZYM kit(Biomérieux, France)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였다.
- Agarase 1 unit(U)는 사용한 반응조건에서 1분당 1 μmol의 galactose를 생산할 수 있는 효소양으로 정의하였다. 환원당 정량을 위한 표준곡선 제작은 galactose를 사용하였다.
성능/효과
- 3A). ASW-YP 배지에서의 agarase 활성은 거의 무시할 만한 수준(최고 0.7 U/ml)이었으나, ASW-YPA 배지에서는 72시간 배양 시 최고 활성(17.7 U/ml)을 보였다. 이러한 결과로부터 균주 S4는 배지에 공급된 agar로부터 탄소 및 에너지원을 보충 함으로서 성장이 촉진될 뿐만 아니라 이에 필요한 agarase 생산도 유도적으로 생산하는 것으로 예상된다.
- D-glucose, D-fructose, D-mannose, D-maltose, D-lactose, D-trehalose, D-mannitol, D-melibiose(약함), D-xylose, D-saccharose, methyl-α-D glucopyranoside(약함), N-acetylglucosamine로부터 유기산 생성이 관찰되었다(Table 1).
- 결론적으로, 계통발생학적 연관관계가 높은 균들과 S4의 형태적·생화학적 특성의 많은 차이점을 감안하여 균주 S4를 Vibrio sp.
- 균주 S4의 16S rRNA 유전자 서열을 해독하여 NCBI의 BlastN 프로그램으로 다른 미생물들과의 상동성을 조사한 결과, S4는 Vibrio 속의 균들과 높은 상동성을 보였다. 특히, 균주 S4의 16S rRNA 유전자 서열은 Vibrio variabilis R-40492T(99.
- 균체를 제거한 배양액의 세포외 총 단백질을 ultrafiltration(10 kDa cut-off)으로 농축하여 0.1% SDS-12% polyacrylamide gel 전기영동으로 분석한 결과, 적어도 세 종류의 단백질이 agar 첨가 배지(ASW-YPA)에서 생산이 유도되는 것으로 확인되었다. 이 들 세 종류 단백질의 agarase 활성을 zymography 분석으로 확인하였으며, SDS-PAGE 전기영동결과 분자량은 대략 25-, 50-, 66-kDa 정도로 추정되었다(Fig.
- 16S rRNA 유전자 서열을 토대로 표준균주들과의 계통발생적 연관관계를 규명하고자 N-J 법으로 계통수를 제작하였다. 그 결과, 균주 S4는 16S rRNA 유전자 서열 상동성 결과와 마찬가지로 V. neptunius LMG 20536T (98.31%), V. coralliilyticus ATCC BAA-450T(97.09%), V. variabilis R-40492T(99.23%) 등과 clade를 형성하였으며, 특히 V. variabilis R-40492T와 보다 밀접한 subcluster를 형성하였다(Fig. 2).
- 5). 그 결과, 균주 S4에 의해서 세포외부로 생산되는 agarase는 agarose를 분해하여 (neo)agarotetraose와 (neo)agarohexaose를 최종산물로 생산할 수 있음을 확인하였다.
- 그러나 S4 균주는 Vibrio 속의 계통발생적 연관관계가 높은 다른 종 V. neptunius LMG 20536T, V. coralliilyticus ATCC BAA-450T, V. variabilis R-40492T들과는 생리·생화학적 특성들에서 많은 차이점들을 보였다(Table 1).
- 3B). 또한, 약 80-kDa 정도의 agarase 활성을 갖는 단백질이 agar 무첨가 배지(ASW-YP)에서만 생산되는 것을 확인하였다. 따라서 agarase 효소 발현에도 정교한 조절시스템이 작동하고 있는 것으로 판단되며, 이들 단백질 발현 조절에 대한 구체적인 연구가 필요하다.
- 균주 S4의 16S rRNA 유전자 서열을 해독하여 NCBI의 BlastN 프로그램으로 다른 미생물들과의 상동성을 조사한 결과, S4는 Vibrio 속의 균들과 높은 상동성을 보였다. 특히, 균주 S4의 16S rRNA 유전자 서열은 Vibrio variabilis R-40492T(99.23%), Vibrio neptunius LMG 20536T (98.31%), Vibrio coralliilyticus ATCC BAA-450T(97.09%) 등과 높은 상동성을 나타냈다(Table 1). 이러한 결과로부터 균주 S4는 Vibrio 속의 한 종으로 판단되었다.
후속연구
- 또한, 약 80-kDa 정도의 agarase 활성을 갖는 단백질이 agar 무첨가 배지(ASW-YP)에서만 생산되는 것을 확인하였다. 따라서 agarase 효소 발현에도 정교한 조절시스템이 작동하고 있는 것으로 판단되며, 이들 단백질 발현 조절에 대한 구체적인 연구가 필요하다.
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