본 연구에서는 장미꽃 methanol 추출물의 항염증 활성을 조사하기 위하여 LPS에 의해 염증이 유도된 RAW 264.7 대식세포에서 염증억제 효과를 알아보았다. 염증 억제의 지표로서는 세포가 방출하는 NO 생성량과 iNOS 및 $NF-{\kappa}B$ 발현 정도를 측정하였다. 실험 결과, RAW 264.7 대식세포에 대한 품종별 장미꽃 methanol 추출물($500{\mu}g/mL$)이 NO의 함량을 감소시키는 경향을 나타내었다. NO의 생성에 영향을 미치는 iNOS 단백질의 발현량을 측정한 결과, LPS 처리에 의해 활성화된 iNOS 단백질의 발현이 장미꽃 methanol 추출물 처리 시 유의적으로 수준으로 억제하는 경향을 보였다. Luciferase activity를 실행한 결과, LPS로 자극한 세포와 비교하였을 때 염증과 관련된 $NF-{\kappa}B$ promoter activity가 장미꽃 methanol 추출물 처리시 현저히 감소하는 경향을 나타내었고, 세포질의 $I{\kappa}B{\alpha}$의 인산화를 저해함으로써 전사요소인 $NF-{\kappa}B$ p65, p50을 핵 속으로 유리시키는 과정을 억제하였다. 이 결과로 장미꽃 methanol 추출물이 전사단계에서 저해활성을 나타낸다는 것을 확인하였다. 본 연구결과, 장미꽃 methanol 추출물은 항염증 효과를 나타냄에 따라 만성 질환 예방을 위한 기능성 식품의 원료로 활용될 수 있을 것으로 여겨진다.
본 연구에서는 장미꽃 methanol 추출물의 항염증 활성을 조사하기 위하여 LPS에 의해 염증이 유도된 RAW 264.7 대식세포에서 염증억제 효과를 알아보았다. 염증 억제의 지표로서는 세포가 방출하는 NO 생성량과 iNOS 및 $NF-{\kappa}B$ 발현 정도를 측정하였다. 실험 결과, RAW 264.7 대식세포에 대한 품종별 장미꽃 methanol 추출물($500{\mu}g/mL$)이 NO의 함량을 감소시키는 경향을 나타내었다. NO의 생성에 영향을 미치는 iNOS 단백질의 발현량을 측정한 결과, LPS 처리에 의해 활성화된 iNOS 단백질의 발현이 장미꽃 methanol 추출물 처리 시 유의적으로 수준으로 억제하는 경향을 보였다. Luciferase activity를 실행한 결과, LPS로 자극한 세포와 비교하였을 때 염증과 관련된 $NF-{\kappa}B$ promoter activity가 장미꽃 methanol 추출물 처리시 현저히 감소하는 경향을 나타내었고, 세포질의 $I{\kappa}B{\alpha}$의 인산화를 저해함으로써 전사요소인 $NF-{\kappa}B$ p65, p50을 핵 속으로 유리시키는 과정을 억제하였다. 이 결과로 장미꽃 methanol 추출물이 전사단계에서 저해활성을 나타낸다는 것을 확인하였다. 본 연구결과, 장미꽃 methanol 추출물은 항염증 효과를 나타냄에 따라 만성 질환 예방을 위한 기능성 식품의 원료로 활용될 수 있을 것으로 여겨진다.
The genus Rosa (Rosaceae) is an abundant source of phenolics and is traditionally used as a food supplement and as herbal medicine. Various plant phenolics are known to have anticancer, antioxidant, and anti-inflammatory properties. In this study, we investigated the anti-inflammatory effects of ros...
The genus Rosa (Rosaceae) is an abundant source of phenolics and is traditionally used as a food supplement and as herbal medicine. Various plant phenolics are known to have anticancer, antioxidant, and anti-inflammatory properties. In this study, we investigated the anti-inflammatory effects of rose methanolic extracts (RMEs) from four different rose cultivars (Macarena, Onnuri, Oklahoma, and Colorado) in lipopolysaccharide (LPS)-activated RAW 264.7 cells. Our results demonstrated that pretreatment of REMs ($500{\mu}g/mL$) significantly reduced NO production by suppressing iNOS protein expression in LPS-stimulated cells. Anti-inflammatory effects by RMEs were observed in the following order: Oklahoma > Colorado > Onnuri > Macarena. Consistent with this finding, RMEs inhibited the translocation of $NF-{\kappa}B$ from the cytosol to the nucleus via the suppression of $I{\kappa}B{\alpha}$ phosphorylation and also inhibited LPS-stimulated $NF-{\kappa}B$ transcriptional activity. These findings suggest that RMEs exert anti-inflammatory actions and help to elucidate the mechanisms underlying the potential therapeutic values of RMEs. Therefore, RMEs could be regarded as a potential source of natural anti-inflammatory agents.
The genus Rosa (Rosaceae) is an abundant source of phenolics and is traditionally used as a food supplement and as herbal medicine. Various plant phenolics are known to have anticancer, antioxidant, and anti-inflammatory properties. In this study, we investigated the anti-inflammatory effects of rose methanolic extracts (RMEs) from four different rose cultivars (Macarena, Onnuri, Oklahoma, and Colorado) in lipopolysaccharide (LPS)-activated RAW 264.7 cells. Our results demonstrated that pretreatment of REMs ($500{\mu}g/mL$) significantly reduced NO production by suppressing iNOS protein expression in LPS-stimulated cells. Anti-inflammatory effects by RMEs were observed in the following order: Oklahoma > Colorado > Onnuri > Macarena. Consistent with this finding, RMEs inhibited the translocation of $NF-{\kappa}B$ from the cytosol to the nucleus via the suppression of $I{\kappa}B{\alpha}$ phosphorylation and also inhibited LPS-stimulated $NF-{\kappa}B$ transcriptional activity. These findings suggest that RMEs exert anti-inflammatory actions and help to elucidate the mechanisms underlying the potential therapeutic values of RMEs. Therefore, RMEs could be regarded as a potential source of natural anti-inflammatory agents.
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문제 정의
RAW 264.7 대식세포에 NF-κB promotor를 가진 luciferase promotor를 일시적으로 transfection하고, 이전 연구에서 장미꽃 methanol 추출물의 염증 매개 인자들의 생성 억제 효과가 NF-κB의 활성 억제를 통하여 일어나는지 알아 보았다.
본 연구에서는 장미꽃 methanol 추출물의 항염증 활성을 조사하기 위하여 LPS에 의해 염증이 유도된 RAW 264.7 대식세포에서 염증억제 효과를 알아보았다. 염증 억제의 지표로서는 세포가 방출하는 NO 생성량과 iNOS 및 NF-κB 발현정도를 측정하였다.
본 연구에서는 장미꽃 추출물은 LPS로 활성화된 RAW 264.7 대식세포에서 유도되는 NO의 생성을 효과적으로 억제시킴을 확인하였다. Li 등(2014)의 보고에 의하면, 품종별 장미꽃 methanol 추출물에는 Oklahoma, 129.
본 연구에서는 품종에 따른 장미꽃의 항염증 활성을 조사하기 위하여 LPS에 의해 염증이 유도된 RAW 264.7 대식세포에 장미꽃 methanol 추출물을 처리하여 세포내 염증억제 효과를 알아보았다.
제안 방법
Horseradish peroxidase-labeled IgG는 상온에서 1시간 동안 부착시키고, TBST buffer로 3번 washing하였다. ECL(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway Township, NJ, USA)을 처리한 membrane을 암실에서 X-ray film에 감광시켜 현상하였다.
Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 pNF-κB luciferas(Stratagene, La Jolla, CA, USA)를 24시간 동안 transfection하였다.
다양한 자극에 의해 활성화된 대식세포에서 유도된 iNOS 는 과량의 NO을 생성하는 것으로 보고되었다(Porta 등 2009; Sautebin 2000). iNOS 발현에 미치는 장미꽃 methanol 추출물의 영향을 확인하기 위하여 LPS에 의해 활성화된 RAW 264.7 대식세포에 장미꽃 methanol 추출물을 처리하여 western blotting을 통해 iNOS 단백질의 발현을 확인하였다(Fig. 2). LPS 처리 후 iNOS 단백질 발현은 정상세포와 비교하여 약 4배 이상 증가되었다.
따라서 장미꽃 methanol 추출물의 처리 농도를 RAW 264.7 대식세포에서 독성을 보이지 않은 500 μg/mL로 하여 다음 실험을 진행하였다.
세포배양액 150 μL와 Griess 시약의 20 μL를 혼합하여 37℃에서 10분 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였으며, sodium nitrate로 농도별 표준곡선을 작성하여 배양액 내의 NO 함량을 산출하였다.
염증 억제의 지표로서는 세포가 방출하는 NO 생성량과 iNOS 및 NF-κB 발현정도를 측정하였다.
18시간 처리 후, PBS로 세척 후 lysis buffer로 세포를 용해시켰다. 용해된 lysate와 dual luciferase reporter assay system(Promega, Madison, WI, USA)를 혼합하여 luminometer(Panomics, Inc., Santa Clara, CA, USA)로 firely와 renilla luciferase activity를 측정하였으며, 수치는 renilla luciferase activity로 정량하였다.
장미꽃 methanol 추출물은 RAW 264.7 대식세포에서 LPS에 의해 유도되는 NF-κB의 핵으로의 이동과 IκBα의 degradation에 미치는 영향을 조사하기 위하여 RAW 264.7 대식세포의 세포질과 핵 내 존재하는 IκBα와 NF-κB p50/p65 subunit의 발현을 Western blot으로 조사하였다.
품종별 장미꽃 methanol 추출물이 LPS 로 유도된 대식세포에서 NO 생성을 조절하는지 확인하기 위해서, 세포에 추출물(500 μg/mL)을 LPS 자극 1시간 전에 전 처리한 후 18시간 동안 배양했다.
핵과 세포질의 단백질은 NE-PER® nuclear and cytoplasmic extraction reagents(Thermo Scientific, Rockford, IL)을 사용하여 분리하였다.
대상 데이터
실험에 사용된 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc.(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였으며, zinc protoporphyrin IX(ZnPP)는 Porphyrin Products(Logan, UT, USA)에서 구입하여 사용하였다. 그 밖에 사용된 추출용매 및 시약은 analytical 및 HPLC 등급을 사용하였다.
본 실험에 사용된 품종별 장미꽃은 충북농업기술원에서 제공받아 사용하였다. Dimethyl sulfide(DMSO), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-di-phenyltetrazolium bromide(MTT) 시약 등은 Sigma Chemical Co.
본 실험에 사용된 항체는 iNOS(1:1000), β-actin(1:2,000), phospho-IκBα(1:500), p65(1: 500), p50(1:500), PCNB(1:1,000)로 4℃에서 24시간 부착시킨 후 tris buffered salin Tween-20(TBST) buffer로 10분간 3번 washing하였다.
실험에 사용된 RAW 264.7 대식세포는 한국세포주은행(KCLB, Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 분양 받아 사용하였다. RAW 264.
데이터처리
모든 실험은 3회 반복실험에 대한 평균(mean)±표준오차(standard error; SE)로 나타내었다.
실험 결과들의 유의성을 검정하기 위하여 t-test와 분산분석(one-way ANOVA)을 행한 후 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test를 실시하였다.
이론/모형
RAW 264.7 대식세포에 대한 장미꽃 methanol 추출물의 세포독성을 알아보기 위하여 MTT assay를 수행하였다. 장미꽃 methanol 추출물을 500 μg/mL로 18시간 동안 처리한 결과, 정상세포와 비교하여 4가지 품종 모두 RAW 264.
RAW 264.7 대식세포에서 분비되는 염증 매개인자 중 하나인 NO의 농도는 Bae 등(2005)의 방법에 따라 측정하였다. RAW 264.
장미꽃 methanol 추출물의 RAW 264.7 대식세포에 대한 세포독성은 MTT 방법으로 분석하였다(Kim 등 2006). RAW 264.
성능/효과
세포질에서 핵 내로 NF-κB의 이동은 대조군과 비교한 결과, LPS 처리에 의해 NF-κB가 핵 내로 이동하여 발현이 증가되는 것으로 나타났다.
Luciferase activity를 실행한 결과, LPS로 자극한 세포와 비교하였을 때 염증과 관련된 NF-κB promoter activity가 장미꽃 methanol 추출물 처리시 현저히 감소하는 경향을 나타내었고, 세포질의 IκBα의 인산화를 저해함으로써 전사요소인 NF-κB p65, p50을 핵 속으로 유리시키는 과정을 억제하였다.
Luciferase activity를 실행한 결과, 염증과 관련된 NF-κB promoter activity가 장미꽃 methanol 추출물 처리시 현저히 감소하는 경향을 나타냈으며, Oklahoma 품종이 가장 효과적인 것으로 나타났다(Fig. 3).
7 대식세포에 대한 품종별 장미꽃 methanol 추출물(500 μg/mL)이 NO의 함량을 감소시키는 경향을 나타내었다. NO의 생성에 영향을 미치는 iNOS 단백질의 발현량을 측정한 결과, LPS 처리에 의해 활성화된 iNOS 단백질의 발현이 장미꽃 methanol 추출물 처리 시 유의적으로 수준으로 억제하는 경향을 보였다. Luciferase activity를 실행한 결과, LPS로 자극한 세포와 비교하였을 때 염증과 관련된 NF-κB promoter activity가 장미꽃 methanol 추출물 처리시 현저히 감소하는 경향을 나타내었고, 세포질의 IκBα의 인산화를 저해함으로써 전사요소인 NF-κB p65, p50을 핵 속으로 유리시키는 과정을 억제하였다.
따라서 LPS로 활성화된 RAW 264.7 대식세포에서 장미꽃 methanol 추출물 처리 시 IκBα 인산화가 억제되면서 NF-κB의 subunit인 p50, p65가 핵으로 translocation되는 것을 저해하여 염증매개인자인 NO의 생성이 감소되었음을 확인하였다.
따라서 LPS에 의해 활성화된 RAW 264.7 대식세포로부터 분비되는 다양한 염증 매개물질들을 장미꽃 methanol 추출물이 억제하는 것이 주요 전사인자인 NF-κB pathway의 차단과 연관됨을 알 수 있었다.
7 대식세포로부터 분비되는 다양한 염증 매개물질들을 장미꽃 methanol 추출물이 억제하는 것이 주요 전사인자인 NF-κB pathway의 차단과 연관됨을 알 수 있었다. 또한 장미꽃 methanol 추출물에 함유된 폴리페놀의 강력한 항산화 활성으로 인해 염증 억제력이 우수한 것으로 판단된다. Terra 등(2007)은 폴리페놀이 풍부한 procyanidin은 NF-κB의 target gene인 IκB-α의 down-regulation을 통하여 염증매개 인자들이 감소되었다고 보고하였다.
실험 결과, RAW 264.7 대식세포에 대한 품종별 장미꽃 methanol 추출물(500 μg/mL)이 NO의 함량을 감소시키는 경향을 나타내었다.
Luciferase activity를 실행한 결과, LPS로 자극한 세포와 비교하였을 때 염증과 관련된 NF-κB promoter activity가 장미꽃 methanol 추출물 처리시 현저히 감소하는 경향을 나타내었고, 세포질의 IκBα의 인산화를 저해함으로써 전사요소인 NF-κB p65, p50을 핵 속으로 유리시키는 과정을 억제하였다. 이 결과로 장미꽃 methanol 추출물이 전사단계에서 저해활성을 나타낸다는 것을 확인하였다. 본 연구결과, 장미꽃 methanol 추출물은 항염증 효과를 나타냄에 따라 만성 질환 예방을 위한 기능성 식품의 원료로 활용될 수 있을 것으로 여겨진다.
장미꽃 methanol 추출물 처리군은 IκBα의 degradation을 억제하여 세포만 배양했을 때와 유사한 결과를 보였으며, 품종 중 Oklahoma와 Colorado에서 더 우수한 결과를 얻을 수 있었다.
장미꽃 methanol 추출물을 500 μg/mL로 18시간 동안 처리한 결과, 정상세포와 비교하여 4가지 품종 모두 RAW 264.7 대식세포에서 독성이 나타나지 않았다(Fig. 1A).
장미꽃 methanol 추출물을 처리하였을 경우에는 핵 내로의 NF-κB의 이동이 감소하였으며, 장미꽃 품종 중 Oklahoma와 Colorado는 다른 품종보다 우수한 억제 효과를 보였다(Fig. 4).
품종별 장미꽃 methanol 추출물을 500 μg/mL의 농도로 처리하였을 때, Oklahoma와 Colorado에서 LPS로 증가된 iNOS의 단백질 발현을 유의적인 차이로 각각 22%, 33% 수준으로 감소되었다.
후속연구
이 결과로 장미꽃 methanol 추출물이 전사단계에서 저해활성을 나타낸다는 것을 확인하였다. 본 연구결과, 장미꽃 methanol 추출물은 항염증 효과를 나타냄에 따라 만성 질환 예방을 위한 기능성 식품의 원료로 활용될 수 있을 것으로 여겨진다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
민간용법에서 사용된 장미의 효능은?
장미는 분류학적으로 장미과(Rosaceae), 장미속(Rosa)에 속하는 다년생 목본식물이며, 전통적으로 꽃과 열매는 약용 및 식용으로 이용되어 왔다. 또한 민간용법으로 이뇨, 강장, 수렴 등의 효능이 있음이 알려져 있다. 장미꽃에는 폴리페놀, 카로티노이드, 안토시아닌 함량이 높은 것으로 나타났으며(Cai 등 2005; Lee 등 2011; Ren 등 2003; Salminen 등 2005), 생리활성으로는 다양한 항산화, 항암 및 항염증 활성 등이 보고되고 있다(Mizawa 등 2000; Mueller 등 2010; Tateyama 등 1997; Thring 등 2009).
대식세포를 활성화하는 자극은?
염증(inflammation)은 생체 내에서 상처나 감염되었을 때, 대식세포(macrophages)에 의해 일어나는 후천적인 생체보호 반응으로, 발병원의 중화 및 손상된 조직을 복구시켜 정상적인 기능을 하게 한다(Morson BC 1970). 체내 면역반응에 관여하는 주요 세포인 대식세포는 염증 촉진성 cytokines과 lipo- polysaccharides(LPS) 등의 자극으로 활성화된다. 활성화된 대식세포는 inducible nitric oxide synthase(iNOS)와 cyclooxy- genase-2(COX-2)의 발현을 통해 각각 nitric oxide(NO)와 pro- staglandin E2(PGE2)와 같은 다양한 염증 매개인자들을 생성한다(Cline MJ 1970).
염증이란?
염증(inflammation)은 생체 내에서 상처나 감염되었을 때, 대식세포(macrophages)에 의해 일어나는 후천적인 생체보호 반응으로, 발병원의 중화 및 손상된 조직을 복구시켜 정상적인 기능을 하게 한다(Morson BC 1970). 체내 면역반응에 관여하는 주요 세포인 대식세포는 염증 촉진성 cytokines과 lipo- polysaccharides(LPS) 등의 자극으로 활성화된다.
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