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문제 정의
- 본 연구에서는 포도의 anthocyanin 조성을 ultra-performance liquid chromatography(UPLC)를 mass spectrometer(MS)를 이용해서 분석하였으며, 품종 고유의 anthocyanin 특성을 구명하고 포도 착색에 관한 기초 데이터를 구축하고자 하였다.
제안 방법
- ‘개량머루’, ‘거봉’, ‘홍이슬’ 과피의 anthocyanin 조성을 UPLC-ESI-MS/MS를 이용하여 조사하였다.
- 600 pump, autosampler, PDA detector로 구성 된 UPLC system(Accela, Thermo, US)과 mass spectrometry(LTQ velos, Thermo, US)를 연결하였으며 hypersil gold 컬럼(100 × 2.1mm, particle size 3µm)을 이용하여 물질을 분리하였다.
- Anthocyanin의 분석은 UPLC-ESI-MS/MS를 이용해 분석하였다. 600 pump, autosampler, PDA detector로 구성 된 UPLC system(Accela, Thermo, US)과 mass spectrometry(LTQ velos, Thermo, US)를 연결하였으며 hypersil gold 컬럼(100 × 2.
- ESI source를 결합하여 collision-induced dissociation(CID) mode로 collision energy를 35%로 설정하였으며 positive mode로 scan range 10-1000m/z에서 기록하였다. Capillary 275.
- ‘개량머루’는 파주, ‘거봉’, ‘홍이슬’ 포도는 안성 인근 농가에서 품종별 성숙기에 수확하였으며 수확 직후 과피는 과육으로부터 분리하여 -80℃에서 보관하였다. 과방당 10개 과립을 무작위로 사용하였으며, 1개 과방을 1반복으로 하여 품종당 6반복 하였다.
- 먼저 anthocyanin 표준물질의 fragment pattern을 확인하였고, 추출액에서 검출된 물질은 검출시간, MS에서 분자량, MS/MS에 의한 ion fragment pattern을 표준물질과 비교하였다. 또한 기존 문헌에서 보고된 검출순서와 일치하는지 확인하였다.
- ‘개량머루’, ‘거봉’, ‘홍이슬’ 과피의 anthocyanin 조성을 UPLC-ESI-MS/MS를 이용하여 조사하였다. 먼저 anthocyanin 표준물질의 fragment pattern을 확인하였고, 추출액에서 검출된 물질은 검출시간, MS에서 분자량, MS/MS에 의한 ion fragment pattern을 표준물질과 비교하였다. 또한 기존 문헌에서 보고된 검출순서와 일치하는지 확인하였다.
- 위의 과정을 통해 3개 품종에서 추출된 anthocyanin을 검출된 순서로 비교하였다(Table 1). Cyanidin, delphinidin, petunidin, peonidin, malvidin의 anthocyanidin과 mono-glucoside, diglucoside, non-acylated, acylated form(acetyl, caffeoyl, coumaroyl, feruloyl)으로 구분되어 총 29종의 anthocyanin이 확인되었다.
- 으로 흘려주었다. 이동상의 조성은 gradient를 설정하여 100% methanol(이동상 B)을 기준으로 5%에서 시작해서 20분(24%), 38분(45%), 40분(100%), 44분(100%), 46분(13%), 56분(13%)이 되도록 하였다. PDA는 520nm에서 검출하였고, 컬럼 30℃, 트레이 10℃로 온도를 설정하고, 시료는 10µL를 주입하였다.
대상 데이터
- 표준 물질로 Cyanidin glucoside, delphinidin glucoside, malvidin glucoside, pelargonidin glucoside, petunidin glucoside(Polyphenols Laboratories AS, Sadness, Norway), peonidin glucoside(Extrasynthèse, Genay, France)를 구입하였다. 시약은 HPLC용 Methanol(J.T. Baker, Center Valley, PA), formic acid와 hydrochloric acid(Sigma Aldrich, St. Louis, MO)를 사용하였다. 초순수 증류수는 Direct-Q3 purification system(Millipore Milford, MA, USA)을 사용해 얻었다.
- 표준 물질로 Cyanidin glucoside, delphinidin glucoside, malvidin glucoside, pelargonidin glucoside, petunidin glucoside(Polyphenols Laboratories AS, Sadness, Norway), peonidin glucoside(Extrasynthèse, Genay, France)를 구입하였다.
성능/효과
- (2003)의 보고와 같이 교잡종 품종에서는 상대적으로 다양한 anthocyanin으로 구성되어 있는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 ‘거봉’에는 mono-, di-glucoside 및 acylation 형태가 다양하고 고르게 존재하는 것이 확인되었고, 따라서 교잡종 포도의 anthocyanin 조성은 LC-MS를 이용해서 분석하는 것이 가장 적합한 것으로 판단되었다.
- 5). Acylation을 형성하는 4종의 organic acid가 확인되었으며 p-coumaric acid, acetic acid, caffeic acid, ferulic acid였다. 세 품종에서 모두 coumaric acid와 결합된 형태가 가장 많았고, 특히 ‘홍이슬’(70.
- Anthocyanin 표준물질과 과피 추출물에서의 MS/MS의 결과에서 mono glucoside는 M+-162의 fragment ion(m/z 287, 301, 303, 317, 331)이 검출되었고, di glucoside는 M+-162,M+-324의 fragment ion이 검출되었다(Fig. 2A). 이러한 패턴은 anthocyanin에서 glucose 분자(m/z 162)가 떨어지기 때문에 발생되는 것으로 확인되었다.
- Anthocyanin에 결합된 당의 개수를 기준으로 분류한 결과(Fig. 4), 세 품종에서 공통적으로 mono-glucoside가 diglucoside보다 많아 2.3-5.9배 차이를 보였으며, 특히 홍이슬은 85.5%로 mono-glucoside가 다른 품종에 비해 많았다.
- Anthocyanin의 acylation된 organic acid를 기준으로 anthocyanin을 분류한 결과, non-acylation은 ‘홍이슬’(25.7%), ‘거봉’(58.6%), ‘개량머루’(98.0%)의 순이었다(Fig. 5).
- 위의 과정을 통해 3개 품종에서 추출된 anthocyanin을 검출된 순서로 비교하였다(Table 1). Cyanidin, delphinidin, petunidin, peonidin, malvidin의 anthocyanidin과 mono-glucoside, diglucoside, non-acylated, acylated form(acetyl, caffeoyl, coumaroyl, feruloyl)으로 구분되어 총 29종의 anthocyanin이 확인되었다.
- 각 품종에서 상대적으로 검출량이 많았던 anthocyanin은 ‘개량머루’ 8종, ‘거봉’ 14종 및 ‘홍이슬’ 5종이었다.
- 각 품종에서 확인된 anthocyanin은 ‘개량머루’와 ‘거봉’이 25종, ‘홍이슬’이 21종이었다(Table 2).
- 검출되는 anthocyanidin의 순서는 delphinidin, cyanidin, petunidin, peonidin, malvidin이었고 di-glucoside는 monoglucoside보다 먼저 검출되었다. Acylation 중에서는 acetic acid, caffeic acid, p-coumaric acid의 순서로 확인되어 기존에 보고된 organic acid에 따른 검출 순서와 일치하였다(García-Beneytez et al.
- 검출된 anthocyanin을 anthocyanidin을 기준으로 분류한 결과(Fig. 3) malvidin은 ‘개량머루’와 ‘거봉’에서 각각 44.1%와 56.5%로 가장 풍부했다.
- 결과적으로 ‘홍이슬’의 anthocyanin 조성이 가장 수가 적고 단순하였고, cyanidin 이외의 anthocyanin은 소량 존재하는 특징을 확인하였다.
- 다른 organic acid는 소량 존재했으며 ferulic acid는 홍이슬에서만 발견되었다. 따라서 본 연구에서의 품종별 anthocyanin의 분류는 acylation의 유무와 organic acid의 종류에 따른 차이가 가장 큰 것을 확인하였다.
- 본 연구의 결과에 의하면 mono-glucoside와 di-glucoside는 ‘개량머루’, ‘거봉’, ‘홍이슬’에서 모두 검출되었고, acylation은 거봉과 홍이슬에서만 확인되었다.
- 세 품종에서 모두 coumaric acid와 결합된 형태가 가장 많았고, 특히 ‘홍이슬’(70.7%)에서 가장 많았다.
- , 2003; Wu and Prior, 2005). 즉 검출되는 순서는 di-glucoside, mono-glucoside, acetyl di-glucoside, caffeoyl di-glucoside, coumaroyl di-glucoside, acetyl monoglucoside, caffeoyl mono-glucoside, coumaroyl mono-glucoside이었다.
후속연구
- ‘개량머루’는 acylation이 진행되지 않았고, ‘홍이슬’은 cyanidin으로 구성된 단순한 조성이므로 이 품종들을 이용해서 anthocyanin의 생합성 과정의 flavonoid 3’, 5’ hydroxylase, methyltransferase, acyltransferase와 관련된 연구에 활용될 것으로 기대된다.
- amurensis 혹은 그 교잡종일 것으로 판단되었다. 이를 증명하기 위해서는 자생하고 있는 V. amurensis의 다양한 변종 수집과 분자 수준에서의 검증이 반드시 필요할 것으로 판단된다.
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