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문제 정의
- 총당 및 환원당의 경우 추출물의 대부분을 차지하는 물 잔류물에서 높게 나타났다. 이러한 결과는 주박의 ethanol 및 열수 추출물과 이들의 분획물이 각각 다른 다양한 성분들을 함유하고 있음을 제시하고 있으며, ethylacetate 분획의 유용 생리활성 가능성을 제시한다.
- 가능함을 제시한 바 있다[9]. 이에 본 연구에서는 우국생주박의 ethanol 및 열수 추출물로부터 순차적 유기용매 분획물들을 조제하여 혈액응고 저해활성, 혈소판 응집저해 활성, 인간 적혈구 용혈활성 및 항산화 활성을 평가한 결과 강력한 항혈전 활성분획을 확인하였으며, 우국생 주박 추출물의 활성 분획을 이용한 항혈전제 개발 가능성을 확인하였기에 이에 보고하는 바이다.
제안 방법
- PRP의 전처리 및 수세과정은 기존의 보고[9, 10] 와동일하게 하였으며, 혈소판 응집은 Whole Blood Aggregome- ter (Chrono-log, PA, U.S.A)를 사용해 37℃에서 측정하였다. 먼저 10 mM CaCl2 50 μl, suspending buffer 147.
- 우국생 주박 시료의 항산화 활성은 DPPH (1, 1-diphenyl-2- picryl hydrazyl) anion scavenging activity [DSA], ABTS [2, 2-azobis(3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonate)] cation scav- enging activity [ASA] 및 nitrite scavenging activity [NSA] 측정으로 평가하였으며, 활성평가의 대조구로는 vitamin C (Sigma Co.)를, 용매 대조구로는 DMSO를 사용하였다[6]. 먼저 DSA 측정의 경우, 다양한 농도로 희석한 시료 20 μl에 99.
- 우국생 주박 추출물 및 분획물의 안전성 평가의 일환으로 인간 적혈구(4%)를 이용하여 용혈 활성을 평가하였다. PBS로 3회 수세한 인간 적혈구 100 μl를 96-well microplate에 가하고 다양한 농도의 시료용액 100 μl를 가한 다음 37℃에서 30 분간 반응시켰으며, 이후, 반응액을 10분간 원심분리(1, 500 rpm)하여 상등액 100 μl를 새로운 microtiter plate로 옮긴 후 용혈에 따른 헤모글로빈 유출 정도를 414 nm에서 측정하였다[9].
- 우국생 주박의 항혈전 활성 평가를 위해 혈액응고 저해활성을 평가하였다. 먼저 대조구로 사용된 항혈전제 aspirin (1.
- 5 μl를 넣고 혈소판 응집을 측정하였다. 응집반응은 collagen 첨가 후 12분간 측정하였으며 amplitude, slope, area under 를 측정하여 평가하였다[27]. 이때, amplitude (ohm)는 혈소판에 응집유도제를 첨가하였을 때 일어나는 최대 응집정도를 나타내며, slope 는 응집유도제를 첨가한 직후부터 1분 동안의 응집곡선의 기울기를 나타내며, area under 는 전체적인 혈소판 응집 정도를 표시하는 것으로 전기저항 증가에 따른 slope 곡선의 하강면적을 나타낸다[27].
- )를 가하고 혼합하였다. 이후 15분간 실온에서 방치 후 520 nm에서 흡광도를 측정하여 잔존 nitrite 양을 측정하였다. NSA (%)는 다음 의식에 의해 계산하였다[6].
- 이후 유기용매 분획물도 상기와 동일한 방법으로 조제하였다. 주박의 다양한 추출물 및 분획물의 분말시료들은 DMSO에 적당한 농도로 녹여, in-vitro 항혈전 활성, 적혈구 용혈활성 및 항산화 활성 평가에 사용하였다. 항혈전 활성평가에 사용한 혈장은 시판 control plasma (MD Pacific Technology Co.
- 유기용매 분획물 제조의 경우, 추출물을 물에 현탁한 후 n-hexane, ethylacetate 및 bu- tanol을 이용하여 순차적으로 분획하고 최종적으로 물 잔류물을 회수하였으며, 각각의 분획물들은 상기와 동일한 방법으로 감압건조하여 분말화 하였다[10]. 한편 ethanol 추출물 제조를 위해서는 주박 시료 무게에 대해 10배의 95% ethanol (Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd. Korea)을 가한 후 상온에서 24시간, 3회 반복 추출하였으며, 추출액은 상기와 동일한 방법으로 감압건조하여 분말로 조제하였다. 이후 유기용매 분획물도 상기와 동일한 방법으로 조제하였다.
- 항산화 활성은 혈전 생성을 포함한 다양한 생명현상 유지에필수적이므로[6, 31], 우국생 주박의 다양한 추출물과 분획물의 항산화 활성을 비교하였다. 먼저 대조구로 사용된 vitamin C는 0.
- 항혈전 활성 중 혈액응고저해 활성은 시료의 thrombin time (TT), prothrombin time (PT) 및 activated partial throm- boplastin time (aPTT) 을 측정하여 평가하였다[10]. 혈액 응고에서 중추적 역할을 수행하는 thrombin [2]의 활성을 평가하는 TT는 37℃에서 0.
- 주박의 다양한 추출물 및 분획물의 분말시료들은 DMSO에 적당한 농도로 녹여, in-vitro 항혈전 활성, 적혈구 용혈활성 및 항산화 활성 평가에 사용하였다. 항혈전 활성평가에 사용한 혈장은 시판 control plasma (MD Pacific Technology Co., Ltd, Huayuan Industrial Area, China)를 사용하였으며, PT re- agent와 aPTT reagent는MD Pacific Hemostasis (MD Pacific Technology Co., Ltd, Huayuan Industrial Area, China)의 분석시약을 사용하여 측정하였다[9, 10]. 기타 사용한 시약은 시약급 이상으로 Sigma Co.
- time (aPTT) 을 측정하여 평가하였다[10]. 혈액 응고에서 중추적 역할을 수행하는 thrombin [2]의 활성을 평가하는 TT는 37℃에서 0.5 U thrombin (Sigma Co., St. Louis, MO, USA) 50 μl와 20 mM CaCl₂50 μl, 다양한 농도의 시료 10 μl를 Amelung coagulometer KC-1A (Amelung. Lemgo, Germany)의 튜브에 혼합하여 2분간 반응시킨 후, 혈장 100 μl를 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였으며, thrombin저해 활성은 3회 이상 반복한 시료 TT 실험의 평균치를 용매 대조구인 DMSO의 TT 평균치의 비로 나타내었다[9]. 한편 외인성 응고계(Ⅱ, V, VII 및 X 인자)의 응고 활성을 종합적으로 측정하는 PT는 혈장 70 μl와 다양한 농도의 시료 10 μl를 coagulometer 의 튜브에 첨가하여 37℃에서 3분간 가온 후, 130 μl의 PT reagent를 첨가하고 혈장이 응고될 때까지의 시간을 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, prothrombin 저해 활성은 3회 이상 반복한 시료 PT 실험의 평균치를 DMSO의 PT 평균치의 비로 나타내었다[10].
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 우국생 주박은 2013년 (주)국순당의 상업적 시설에서 생산된 주박을 공급받아 사용하였으며, 주박의열수 추출물 제조를 위해서는 주박 시료 무게에 대해 10배의 증류수를 가한 후 100℃에서 30분간 3회 반복 추출하였으며, 이후 추출액은 filter paper (Whatsman No. 2)로 거른 후 감압농축(Eyela Rotary evaporator N-1000, Tokyo Rikakikai Co., Ltd. Japan)하여 분말로 조제하였다. 유기용매 분획물 제조의 경우, 추출물을 물에 현탁한 후 n-hexane, ethylacetate 및 bu- tanol을 이용하여 순차적으로 분획하고 최종적으로 물 잔류물을 회수하였으며, 각각의 분획물들은 상기와 동일한 방법으로 감압건조하여 분말화 하였다[10].
- PBS로 3회 수세한 인간 적혈구 100 μl를 96-well microplate에 가하고 다양한 농도의 시료용액 100 μl를 가한 다음 37℃에서 30 분간 반응시켰으며, 이후, 반응액을 10분간 원심분리(1, 500 rpm)하여 상등액 100 μl를 새로운 microtiter plate로 옮긴 후 용혈에 따른 헤모글로빈 유출 정도를 414 nm에서 측정하였다[9]. 시료의 용매 대조구로는 DMSO (2%)를 사용하였으며, 적혈구 용혈을 위한 실험 대조구로는 triton X-100 (1.0 mg/ml) 및amphotericin B (0.02 mg/ml)를 사용하였다. 용혈 활성은 다음의 수식을 이용하여 계산하였다.
- Louis, MO, USA) 의 제품을 구입하여 사용하였다. 실험에 사용한 주박 시료는 안동대학교 식품영양학과에서 보관하고 있다(voucher speci- men 2013-KSD-W2-1~5, KSD-E2- 1~5).
- 이후 65 μl CaCl2 (35 mM)을 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, aPTT 연장 활성은 3회 이상 반복한 시료 aPTT 실험의 평균치를 DMSO의 aPTT 평균치의 비로 나타내었다[10]. 이때 시료 대조군으로는 aspirin (Sigma Co., St. Louis, MO, USA)을, 용매 대조군으로는 DMSO를 사용하였다.
- 총폴리페놀(Total poly- phenol) 함량은 시료 400 μl에 50 μl의 Folin-ciocalteau, 100 μl의 Na2CO3 포화용액을 넣고 실온에서 1시간 방치한 후 725 nm에서 흡광도를 측정하였다[26]. 표준시약으로는 tannic acid를 사용하였다. 총당 정량의 경우에는 phenol-sulfuric acid법을, 환원당 정량의 경우에는 DNS 변법을 이용하였다 [29].
데이터처리
- 실험 결과는 SPSS 21.0 버전을 사용하여 mean±SD 로 나타내었으며, 각 군간의 차이는 ANOVA로 분석하였으며, Dun- can 다중비교 검증법으로 통계적 유의성 검정을 조사하였다. 유의수준은 p<0.
이론/모형
- 표준시약으로는 tannic acid를 사용하였다. 총당 정량의 경우에는 phenol-sulfuric acid법을, 환원당 정량의 경우에는 DNS 변법을 이용하였다 [29]. 각각의 분석결과는 3회 반복한 실험의 평균과 편차로 나타내었다.
- 총플라보노이드(Total flavonoid) 함량 측정은 기존의 보고된 방법[26]에 따라 측정하였으며, 각각의 시료를 18시간 methanol교반 추출하고 여과한 추출액 400 μl에 90% dieth- ylene glycol 4 ml를 첨가하고 다시 1 N NaOH 40 μl를 넣고 37℃에서 1시간 반응 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 rutin을 사용하였다.
- 항혈전 활성 중 혈소판 응집저해 활성은, 미세전극에 혈소판이 부착되어 응집됨에 따라 발생하는 전기 저항값의 변화를 측정하는 impedance 법[27]을 사용하였으며, 인간 농축 혈소판(platelet rich plasma: PRP)은 적십자로부터 공급받아 사용하였다. PRP의 전처리 및 수세과정은 기존의 보고[9, 10] 와동일하게 하였으며, 혈소판 응집은 Whole Blood Aggregome- ter (Chrono-log, PA, U.
성능/효과
- 또한 총당 및 환원당 함량은 대부분이 butanol 분획 및 물 잔류물에서 425~520 mg/g및 322~502 mg/g으로 높은 함량을 나타내었다. 그러나 열수 추출물 및 이의 분획물의 경우, 폴리페놀 함량은 ethylacetate 분획 및 butanol 분획에서 높게 나타났으나 그 함량은 43.8~46.9 mg/g으로 ethanol 추출물보다는 낮게 나타났으며, 총플라보노이드 함량은 n-hexane 분획에서 1.8 mg/g으로 가장 높게 나타났다(Table 2). 총당 및 환원당의 경우 추출물의 대부분을 차지하는 물 잔류물에서 높게 나타났다.
- 8의 area under 값을 나타내어 동일 농도의 aspirin 에 필적하는 응집저해를 나타내었다. 또한 주박의 열수 추출물에서도 amplitude 12Ω, area under 83.1을 나타내어 DMSO의 70.4% 혈소판 응집능을 나타내었으며, ethylacetate 분획 및 butanol 분획에서는 DMSO에 비해 58.1~ 60.8%의 혈소판 응집이 나타났다. 특이한 것은, 각 추출물의 n-hexane 분획에서 매우 강력한 혈소판 응집 촉진 활성이 나타난 바, 이에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다.
- 0 mg/g으로 상대적으로 높게 나타났다(Table 1). 또한 총당 및 환원당 함량은 대부분이 butanol 분획 및 물 잔류물에서 425~520 mg/g및 322~502 mg/g으로 높은 함량을 나타내었다. 그러나 열수 추출물 및 이의 분획물의 경우, 폴리페놀 함량은 ethylacetate 분획 및 butanol 분획에서 높게 나타났으나 그 함량은 43.
- 8%를 나타내었다. 먼저 ethanol 추출의 경우 추출효율은 6.62%로 열수 추출의 2.1%보다 3.15배 높은 수율을 나타내었으며(Table 1, 2), ethanol 추출물의 경우 n- hexane 분획물이 추출물의 9.4%를 차지하여 지용성 성분 함량이 매우 높은 반면, 열수 추출물의 경우 n-hexane 분획물은 0.1% 이하를 나타내었다. 주박ethanol 추출물의 경우 ethyl- acetate 분획, butanol 분획 및 물 잔류물의 분획효율은 각각 2.
- 항산화 활성을 비교하였다. 먼저 대조구로 사용된 vitamin C는 0.006 mg/ml농도에서 각각 31.1%, 75.7% 및 28.7%의 DPPH 음이온 소거능, ABTS 양이온 소거능 및 nitrite 소거 능을 나타내었으며, 농도의존적인 소거능 활성 증가를 나타냄을 확인하였다. 우국생 주박 시료의 경우 ethanol 추출물이 열수 추출물보다 우수한 소거능을 나타내었으나, 0.
- 1). 상기 결과는, 우국생 주박이 수용성, 지용성의 다양한 내열성 항산화 물질을 포함하고 있음을 의미하고 있다. 본 연구 결과는 우국생 주박 추출물의 분획물들을 이용한 항혈전 및 혈행개선 제품개발이 가능함을 제시하며, 특히 ethanol 추출물의 ethylacetate 분획 및 물 잔류물을 이용한 혈액응고 저해 및 혈소판 응집저해제 개발이 가능함을 제시하고 있다.
- 7%의 DPPH 음이온 소거능, ABTS 양이온 소거능 및 nitrite 소거 능을 나타내었으며, 농도의존적인 소거능 활성 증가를 나타냄을 확인하였다. 우국생 주박 시료의 경우 ethanol 추출물이 열수 추출물보다 우수한 소거능을 나타내었으나, 0.5 mg/ml 농도에서 9.4%, 23.3%, 31.6%의 DPPH 음이온 소거능, ABTS 양이온소거능 및 nitrite 소거능을 나타내어 vitamin C보다는 미약한 활성을 나타내었다. 또한 우국생 주박의 항산화 활성은 Kim 등이 보고[13]한 Aspergillus kawachii를 종균으로 자가제조한 쌀 코지, 밀코지, 보리코지 및 상황버섯 코지를 이용한 현미 탁주 주박의 DPPH 음이온 소거능보다는 약한 소거능을 나타내었으며, Kwon 등이 보고[14]한 자가제조 코지를 이용한 현미 탁주의 주박의 nitrite 소거능보다는 약한 소거능을 나타내었다.
- 따라서 aspirin과 같은 효과적인 혈소판 응집저해제는 항혈전제로 사용되고 있다. 우국생 주박시료의 혈소판 응집능을 평가하기 위해, 먼저 용매 대조 구로 사용된 DMSO의 혈소판 응집능을 평가한 결과 area under 118.8을 나타내었으며, 상업적으로 이용되고 있는 혈소판 응집 저해제인 aspirin (0.25 mg/ml)은 area under 68.9를 나타내어 용매 대조구(DMSO)의 58.4% 혈소판 응집능을 나타내어 우수한 혈소판 응집저해활성을 나타내었으며, 농도 의존적인 응집저해를 나타내었다(Table 4). 주박 ethanol 추출물(0.
- 4배 연장시켜 우수한 혈액응고 저해활성을 나타내었다 (Table 3). 우국생 주박의 ethanol 추출물의 경우 미약한 저해 활성을 나타내었으나, butanol 분획과 ethylacetate 분 획에서 유의적인 thrombin 저해 및 prothrombin 저해활성이 나타났으며, 특히 ethylacetate 분획의 경우 5 mg/ml 농도에서 TT, PT, aPTT모두에서15배 이상의 연장된 응고시간을 나타내어 매우 강력한 thrombin, prothrombin 및 coagulation factor 저해 활성을 나타내었다(Table 3). 이러한 강력한 저해는 2.
- 8%를 나타내어, 열수 추출물은 ethylacetate 분획물 및 물 잔류물 함량이 ethanol 추출물에 비해 높음을 알 수 있었다. 주박 ethanol 추출물 및 이의 분획물의 총폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량 분석 결과, 폴리페놀 함량은 ethylacetate 분획(128 mg/g) 및 butanol 분획(6.2 mg/g)에서 높게 나타났으며, 플라보노이드 함량은 ethanol 추출물 및 물 잔류물에서 0.7~1.0 mg/g으로 상대적으로 높게 나타났다(Table 1). 또한 총당 및 환원당 함량은 대부분이 butanol 분획 및 물 잔류물에서 425~520 mg/g및 322~502 mg/g으로 높은 함량을 나타내었다.
- 1% 이하를 나타내었다. 주박ethanol 추출물의 경우 ethyl- acetate 분획, butanol 분획 및 물 잔류물의 분획효율은 각각 2.4%, 20.4%, 67.8%를 나타낸 반면, 열수 추출물의 경우 4.0%, 11.1%, 84.8%를 나타내어, 열수 추출물은 ethylacetate 분획물 및 물 잔류물 함량이 ethanol 추출물에 비해 높음을 알 수 있었다. 주박 ethanol 추출물 및 이의 분획물의 총폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량 분석 결과, 폴리페놀 함량은 ethylacetate 분획(128 mg/g) 및 butanol 분획(6.
- 한편 분획물 시료에서는 ethylacetate 및 butanol 분 획에서 상대적으로 우수한 소거능을 나타내었으며, 전체적으로 활성 음이온 보다는 활성 양이온에 대한 소거능이 더욱 우수하였다 (Fig. 1). 상기 결과는, 우국생 주박이 수용성, 지용성의 다양한 내열성 항산화 물질을 포함하고 있음을 의미하고 있다.
- 상기의 결과는 우국생 주박 ethanol추출물의 butanol 분획 및 물 잔류물이 혈소판 응집저해 활성이 우수하며, 향후우국생 주박으로부터 혈소판 응집저해제 개발이 가능함을 제시하고 있다. 한편 인간 적혈구를 이용한 우국생 주박시료의용혈활성을 평가한 결과, 다양한 추출물 및 분획물은 0.5 mg/ml 농도까지 3.5% 이하의 용혈활성을 나타내어 적혈구 용혈에 따른 급성독성은 나타나지 않으리라 판단되었다 (Table 5).
후속연구
- 상기 결과는, 우국생 주박이 수용성, 지용성의 다양한 내열성 항산화 물질을 포함하고 있음을 의미하고 있다. 본 연구 결과는 우국생 주박 추출물의 분획물들을 이용한 항혈전 및 혈행개선 제품개발이 가능함을 제시하며, 특히 ethanol 추출물의 ethylacetate 분획 및 물 잔류물을 이용한 혈액응고 저해 및 혈소판 응집저해제 개발이 가능함을 제시하고 있다.
- 본 연구팀에서는 주박을 이용한 고부가가치 향장소재 개발을 목표로 다양한 주박의 유용생리활성을 보고한 바 있으며[9, 10, 18-21, 23], 최근 5종의 탁주 및 약주 주박 추출물의 항혈전 활성을 평가한 결과, 우국생 주박의 열수 및 ethanol 추출물에서 유의적인 트롬빈 저해활성을 확인하였으며, 특히 혈소판응집저해 활성 평가에서는 대조구로 사용된 aspirin에 필적하는 강력한 활성이 나타나, 우국생 주박 추출물이 항 혈전 제로 이용 가능함을 제시한 바 있다[9]. 이에 본 연구에서는 우국생주박의 ethanol 및 열수 추출물로부터 순차적 유기용매 분획물들을 조제하여 혈액응고 저해활성, 혈소판 응집저해 활성, 인간 적혈구 용혈활성 및 항산화 활성을 평가한 결과 강력한 항혈전 활성분획을 확인하였으며, 우국생 주박 추출물의 활성 분획을 이용한 항혈전제 개발 가능성을 확인하였기에 이에 보고하는 바이다.
- 특이한 것은, 각 추출물의 n-hexane 분획에서 매우 강력한 혈소판 응집 촉진 활성이 나타난 바, 이에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다. 상기의 결과는 우국생 주박 ethanol추출물의 butanol 분획 및 물 잔류물이 혈소판 응집저해 활성이 우수하며, 향후우국생 주박으로부터 혈소판 응집저해제 개발이 가능함을 제시하고 있다. 한편 인간 적혈구를 이용한 우국생 주박시료의용혈활성을 평가한 결과, 다양한 추출물 및 분획물은 0.
- 8%의 혈소판 응집이 나타났다. 특이한 것은, 각 추출물의 n-hexane 분획에서 매우 강력한 혈소판 응집 촉진 활성이 나타난 바, 이에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다. 상기의 결과는 우국생 주박 ethanol추출물의 butanol 분획 및 물 잔류물이 혈소판 응집저해 활성이 우수하며, 향후우국생 주박으로부터 혈소판 응집저해제 개발이 가능함을 제시하고 있다.
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