대장암세포주 HT29에서의 Treculia africana 추출물의 항산화 및 항암 활성 분석 Anti-oxidative and Anti-cancer Activities of Treculia africana Extract in Human Colon Adenocarcinoma HT29 Cells원문보기
Treculia africana Decne는 빵나무종으로 뽕나무과, Treculia 속에 속하는 식물로서, 이 식물의 다양한 부위에서 추출한 물질은 항염증, 항균등의 효과를 가지고 있어 백일해의 치료등 다양한 질환에서 민간요법으로 사용되어 왔다. 하지만 정확한 생리활성에 관한 연구는 보고된 바가 없다. 따라서 본 연구에서는 T. africana Decne 메탄올추출물(META)을 사용하여 항산화능 및 인체 대장암 세포주인 HT29에 대한 항암활성에 관하여 분석하였다. DPPH radical scavenging activity를 통해 분석한 결과, META의 IC50가 4.53 μg/ml로 강력한 항산화능을 보유하 였음을 확인하였다. 또한 META 처리에 의해 HT29의 생존율이 감소함과 더불어 IC50가 66.41 μg/ml로 강력한 세포사멸효과를 나타냈다. META 처리에 의해 HT29의 subG1 세포비율 및 Annexin V+ 세포의 비율이 증가하고, DAPI로 염색된 apoptotic body가 증가하였다. 또한 apoptosis 관련 단백질인 Fas, Bax, cytochrome c의 발현이 증가하였으며, 이는 caspase 3, 8, 9를 활성화 시켜 최종적으로 PARP가 분해되어 apoptosis가 유도되었음을 확인하였다. 이러한 결과들을 통해 META는 강한 항산화 활성과, 대장암세포에서 apoptosis 유도에 의한 높은 항암활성을 보유한 물질임을 확인하였다.
Treculia africana Decne는 빵나무종으로 뽕나무과, Treculia 속에 속하는 식물로서, 이 식물의 다양한 부위에서 추출한 물질은 항염증, 항균등의 효과를 가지고 있어 백일해의 치료등 다양한 질환에서 민간요법으로 사용되어 왔다. 하지만 정확한 생리활성에 관한 연구는 보고된 바가 없다. 따라서 본 연구에서는 T. africana Decne 메탄올추출물(META)을 사용하여 항산화능 및 인체 대장암 세포주인 HT29에 대한 항암활성에 관하여 분석하였다. DPPH radical scavenging activity를 통해 분석한 결과, META의 IC50가 4.53 μg/ml로 강력한 항산화능을 보유하 였음을 확인하였다. 또한 META 처리에 의해 HT29의 생존율이 감소함과 더불어 IC50가 66.41 μg/ml로 강력한 세포사멸효과를 나타냈다. META 처리에 의해 HT29의 subG1 세포비율 및 Annexin V+ 세포의 비율이 증가하고, DAPI로 염색된 apoptotic body가 증가하였다. 또한 apoptosis 관련 단백질인 Fas, Bax, cytochrome c의 발현이 증가하였으며, 이는 caspase 3, 8, 9를 활성화 시켜 최종적으로 PARP가 분해되어 apoptosis가 유도되었음을 확인하였다. 이러한 결과들을 통해 META는 강한 항산화 활성과, 대장암세포에서 apoptosis 유도에 의한 높은 항암활성을 보유한 물질임을 확인하였다.
Treculia africana Decne, a breadfruit species, is native to many parts of West and Tropical Africa. The breadfruit belongs to the family Moraceae and is one of the four members of the genera Treculia. The crude extract of T. africana has been used in folk medicine as an anti-inflammatory agent for v...
Treculia africana Decne, a breadfruit species, is native to many parts of West and Tropical Africa. The breadfruit belongs to the family Moraceae and is one of the four members of the genera Treculia. The crude extract of T. africana has been used in folk medicine as an anti-inflammatory agent for various ailments, such as whooping cough. In this study, we evaluated the anti-oxidative and anti-cancer activities of the methanol extract of T. africana Decne (META) and the molecular mechanisms of its anti-cancer effects in human colon carcinoma HT29 cells. The META exhibited anti-oxidative activity through a DPPH radical scavenging capacity and inhibited cell growth in a dose-dependent manner in HT29 cells. META treatment induced apoptosis of HT29 cells, showing an increase in the percentage of both SubG1 cells and Annexin V-positive cells and the formation of apoptotic bodies in a dose-dependent manner. META-mediated apoptosis was associated with the up-regulation of the death receptor FAS and Bax and a decrease in the Bcl-2 expression. META-treated HT29 cells also showed the release of cytochrome c from the mitochondria into the cytosol, activation of caspase-3, caspase-8, and caspase-9, and proteolytic cleavage of poly ADP-ribose polymerase (PARP). These findings suggest META may exert an anti-cancer effect in HT29 cells by inducing apoptosis through both intrinsic and extrinsic pathways.
Treculia africana Decne, a breadfruit species, is native to many parts of West and Tropical Africa. The breadfruit belongs to the family Moraceae and is one of the four members of the genera Treculia. The crude extract of T. africana has been used in folk medicine as an anti-inflammatory agent for various ailments, such as whooping cough. In this study, we evaluated the anti-oxidative and anti-cancer activities of the methanol extract of T. africana Decne (META) and the molecular mechanisms of its anti-cancer effects in human colon carcinoma HT29 cells. The META exhibited anti-oxidative activity through a DPPH radical scavenging capacity and inhibited cell growth in a dose-dependent manner in HT29 cells. META treatment induced apoptosis of HT29 cells, showing an increase in the percentage of both SubG1 cells and Annexin V-positive cells and the formation of apoptotic bodies in a dose-dependent manner. META-mediated apoptosis was associated with the up-regulation of the death receptor FAS and Bax and a decrease in the Bcl-2 expression. META-treated HT29 cells also showed the release of cytochrome c from the mitochondria into the cytosol, activation of caspase-3, caspase-8, and caspase-9, and proteolytic cleavage of poly ADP-ribose polymerase (PARP). These findings suggest META may exert an anti-cancer effect in HT29 cells by inducing apoptosis through both intrinsic and extrinsic pathways.
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문제 정의
META가 강력한 항산화 활성을 지니는 것을 확인하였으므로 다음으로 암세포에 대한 사멸효과를 보이는 지 알아보았다. META를 다양한 암세포, 인체 대장암 세포 HT29, 폐암 세포 A549 및 간암세포 HepG2에 처리하였을 경우, 암세포의 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 추출물을 처리한 후 WST assay를 사용하여 세포사멸 효과를 확인하였다.
이와 같이 사람들이 주로 섭취하는 음식에서 뿐만 아니라 여러 자생식물에서 항암효과를 가진 성분을 찾는 연구가 계속되어지고 있다. 따라서 본 연구는 항암효과를 가진 소재 개발을 위해, 자생식물 중 Treculia africana Decne를 메탄올로 추출하여 항산화 효과 및 대장암 세포에 대한 항암기전을 분석하였으며, 그 결과 META가 HT29의 강력한 apoptosis를 유도하였고 이는 항암효과를 가진 소재의 개발을 위한 중요한 기초자료가 될 것이라 사료된다.
이러한 이론을 바탕으로 최근에는 암세포의 세포주기를 제어하는 신 물질들을 찾는 연구가 활발히 진행되고 있다[26]. 따라서 본 연구에서는 META 처리로 인하여 감소한 생존율의 이유를 세포주기 변화 분석을 통하여 찾고자 하였다.
하지만 정확한 생리활성에 관한 연구는 보고된 바가 없다. 따라서 본 연구에서는 T. africana Decne의 메탄올 추출물을 사용하여 항산화능 및 인체대장암 세포주인 HT29에 대한 항암활성에 관하여 분석하였다.
제안 방법
세포독성을 측정하였다. 3-5-104 cell의 HT29, A549, HepG2, HEK293 및 3T3-L1 세포를 24-well plate에 분주하여 24시간 배양한 다음, 추출물을 농도별로 처리하고 37C에서 48시간동안 배양하였다. 이때 대조군은 0.
먼저 6-well plate에 HT29 세포를 5-105 cell의 농도로 분주하여 부착시킨 후, META를 다양한 농도로 처리하였다. 48시간 배양 후 세포를 회수하고 MuseAnnexin V & Dead reagent 100 ul를 첨가하여 실온에서 20분간 반응한 다음, Muse Cell Analyzer (Merck Millipore, Darmstadt, Germany)로 분석하였다.
HT29 세포에 META를 농도별로 처리한 후 PI 염색을 하여 세포주기의 변화를 Flow cytometry로 분석하였다. 그 결과, Fig.
HT29 세포에 META를 농도별로 처리한 후 세포의 형태 변화를 유도하는 지 확인하기 위하여 위상차 현미경으로 관찰하였다. 그 결과, Fig.
HT29 세포에서 META의 세포주기에 미치는 영향을 알아보기 위하여, HT29 세포에 META를 농도 별로 처리한 다음 CycleTESTPLUS DNA Reagent Kit (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 사용하여 세포주기변화를 분석하였다. 먼저 6-well plate에 HT29 세포를 5-105 cell의 농도로 분주하여 부착시킨 후, 추출물들을 다양한 농도로 처리하였다.
META 처리에 따른 HT29의 apoptosis 유도를 관찰하기 위하여, HT29 세포에 농도 별로 추출물들을 처리한 다음 Muse Annexin V & Dead Cell Kit (Merck Millipore, Darmstadt, Germany)를 사용하여 염색하였다. 먼저 6-well plate에 HT29 세포를 5-105 cell의 농도로 분주하여 부착시킨 후, META를 다양한 농도로 처리하였다.
META를 다양한 암세포, 인체 대장암 세포 HT29, 폐암 세포 A549 및 간암세포 HepG2에 처리하였을 경우, 암세포의 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 추출물을 처리한 후 WST assay를 사용하여 세포사멸 효과를 확인하였다. 그 결과 Fig.
추출한 단백질의 농도를 Bradford assay로 결정한 후 30 ug의 단백질을 10% SDS-PAGE로 전기영동하고 nitrocellulose membrane 에 blotting한 후 대상 단백질의 항체와 hybridization하였다. Membrane washing 후 Horse radish peroxidase (HRP)가 tagging된 이차항체로 한 시간 동안 반응시킨 후 Western blotting luminol reagent (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA)를 적용시킨 다음 chemiluminescence detection system (FluoChem FC2; AlphaInnotech, San Leandro, CA, USA)을 사용하여 분석하였다. Fas, FaDD, Bcl-2, Cytochrome c, Capase-3, -8, -9, 및 actin의 일차항체와 HRP-conjugated anti-rabbit, anti-goat, anti-mouse 등 이차항체는 Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA)에서 구입하였으며, PARP, Bax의 일차항체는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
중요하다[3]. 따라서 META의 항산화능을 DPPH radical scavenging activity 측정을 통해 분석하였다. 그 결과 Table 1에 제시한 바와 같이 META의 농도가 증가함에 따라 DPPH radical 억제능이 0.
41 ug/ml에서는 50% 사멸효과(IC50)를 보여 세 종류의 암세포주 중 가장 강력한 세포사멸효과를 보였다. 따라서 이후 실험에는 HT29 세포를 사용하여 META의 항암활성 기전 분석을 수행하였다.
세포주기분석결과로부터 확인한 META 처리에 의한 SubG1 증가가 apoptosis와 직접 연관이 있는지 분석하기 위하여 Muse cell analysis를 이용하여 annexin V positive 세포의 빈도를 측정하였다. 그 결과 Fig.
수용성의 tetrazolium salt (WST, water soluble tetrazolium salt)를 이용한 dehydrogenase assay를 이용하여 META에 대한 세포독성을 측정하였다. 3-5-104 cell의 HT29, A549, HepG2, HEK293 및 3T3-L1 세포를 24-well plate에 분주하여 24시간 배양한 다음, 추출물을 농도별로 처리하고 37C에서 48시간동안 배양하였다.
5-10-4 M DPPH 40 ul와각 시료 160 ul를 분주한 혼합액을 실온에서 30분간 반응시킨후, microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 음성 대조군과 비교하여 free radical 소거 활성을 백분율로 나타내고, 50% 저해 농도(IC50)를 계산하였다. 양성 대조군으로는 대표적인 항산화제인 ascorbic acid를 사용하였으며 측정값은 3회 반복 실험의 평균값으로 나타내었다.
앞서 Muse analysis를 통해 추출물의 처리에 따른 apoptotic cell수가 늘어남을 확인하였으므로, 좀더 정확히 세포 핵 내의 변화를 관찰하기 위하여 DAPI 염색을 실시하였다. HT29 세포에 추출물을 농도별로 처리한 다음 DAPI로 염색하고 형광현미경을 이용하여 관찰한 결과 Fig.
48시간 배양 후 세포를 회수하고 PBS로 세척한 다음, ribonuclease A를 실온에서 10분간 처리하고 propidium iodide (PI) 용액을 첨가하여 4C에서 10분간 염색하였다. 염색된 세포는 Flow cytometry (Cell Lab Quanta SC, Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.
3-5-104 cell의 HT29, A549, HepG2, HEK293 및 3T3-L1 세포를 24-well plate에 분주하여 24시간 배양한 다음, 추출물을 농도별로 처리하고 37C에서 48시간동안 배양하였다. 이때 대조군은 0.1% DMSO를 처리하였다. 48시간 배양 후 WST assay reagent (Daeillab, Seoul, Korea)를 well당 500 ul 첨가하여 37C에서 30분 동안 반응시킨 후, microplate reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
louis, MO, USA) 용액을 이용하여 염색하였다. 차광한 상태로 상온에서 20분간 염색한 다음, PBS로 세척 후 Anti-fade mounting 용액을 사용하여 mounting하고, 형광현미경(Carl Zeiss, Jena, Germany)을 이용하여 200배 배율로 핵의 형태변화를 관찰하고 Axio Vision Program을 이용하여 촬영하였다.
또한 Cytosolic 단백질 추출을 위해서는 sonication 단계를 제외하고 진행하였다[18]. 추출한 단백질의 농도를 Bradford assay로 결정한 후 30 ug의 단백질을 10% SDS-PAGE로 전기영동하고 nitrocellulose membrane 에 blotting한 후 대상 단백질의 항체와 hybridization하였다. Membrane washing 후 Horse radish peroxidase (HRP)가 tagging된 이차항체로 한 시간 동안 반응시킨 후 Western blotting luminol reagent (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA)를 적용시킨 다음 chemiluminescence detection system (FluoChem FC2; AlphaInnotech, San Leandro, CA, USA)을 사용하여 분석하였다.
48시간 배양 후 WST assay reagent (Daeillab, Seoul, Korea)를 well당 500 ul 첨가하여 37C에서 30분 동안 반응시킨 후, microplate reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정값은 3회 반복실험을 하여 그에 대한 평균값으로 나타내었으며, 본 실험결과를 바탕으로 이후 적정 처리 농도를 결정하였다.
대상 데이터
Membrane washing 후 Horse radish peroxidase (HRP)가 tagging된 이차항체로 한 시간 동안 반응시킨 후 Western blotting luminol reagent (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA)를 적용시킨 다음 chemiluminescence detection system (FluoChem FC2; AlphaInnotech, San Leandro, CA, USA)을 사용하여 분석하였다. Fas, FaDD, Bcl-2, Cytochrome c, Capase-3, -8, -9, 및 actin의 일차항체와 HRP-conjugated anti-rabbit, anti-goat, anti-mouse 등 이차항체는 Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA)에서 구입하였으며, PARP, Bax의 일차항체는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
Treculia africana Decne 메탄올 추출물(Methanol extracts of Treculia africana Decne, META)은 한국생명공학연구원, 해외 생물소재 허브센터에서 구입(분양번호; FBM117-096)하여 사용하였으며, methyl alcohol 95.0% GR급을 사용하여 45C에서 sonicator를 이용하여 3일 동안 반복하여 추출하고 농축후 동결 건조시킨 시료로서 100 mg/ml 농도로 dimethyl sulfoxide (DMSO; Sig ma, St. Louis, MO, USA)에 용해하여 -20C 에서 보관하고 세포에 처리 전 배지에 희석하여 사용하였다.
본 연구에 사용한 인체 대장암 세포주 HT29, 폐암 세포주 A549, 간암 세포주 HepG2 및 인간 정상 신장세포 HEK293, 마우스 지방전구세포 3T3-L1은 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)로부터 구입하여 사용하였으며, 10% fetal bovine serum (FBS) 및 1% pen-icillin/streptomycin이 포함된 Dul becco's modified Eagle's medium (DMEM)을 사용하여 37C, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다.
시료를 첨가하지 않은 음성 대조군과 비교하여 free radical 소거 활성을 백분율로 나타내고, 50% 저해 농도(IC50)를 계산하였다. 양성 대조군으로는 대표적인 항산화제인 ascorbic acid를 사용하였으며 측정값은 3회 반복 실험의 평균값으로 나타내었다. 억제능의 백분율 공식은 다음과 같다.
데이터처리
모든 결과는 mean - SD (Standard deviation)로 나타내었으며, 분석된 실험 데이터의 통계적 유의성은 대조군과 각 시료처리 군의 실험데이터로부터 Student's t test를 통하여 검증하였다.
이론/모형
META의 항암 활성 기전을 밝히기 위해 apoptosis 조절에 관여하는 단백질 발현을 Western blot hybridization으로 분석하였다. 농도별로 META를 처리한 HT29 세포를 회수하여 PBS로 세척한 후, lysis buffer [20 mM Tris-HCl (pH 7.
따라서 세포사멸에 관련된 단백질들이 META 처리에 의해 어떤 변화가 있는지 Western blot analysis로 확인하였다. 그 결과 Fig.
전자공여작용은 인체 내에서 생성되는 프리라디칼의 전자를 공여하여 프리라디칼에 의한 노화와 질병을 억제하는 작용으로 이용되고있다. 전자공여능 측정은 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical 소거법을 이용하여 측정하였다. DPPH는 비교적 안정한 free radical로써, ascorbic acid, tocopherol, polyhydroxy 방향족 화합물, 방향족 아민류에 의해 환원되어 짙은 자색이 탈색되는 원리를 이용하여 항산화 활성을 간단히 측정할 수있는 동시에 식물체의 항산화 활성과도 연관성이 매우 높기 때문에 많이 이용되고 있는 방법이다[13].
성능/효과
앞서 Muse analysis를 통해 추출물의 처리에 따른 apoptotic cell수가 늘어남을 확인하였으므로, 좀더 정확히 세포 핵 내의 변화를 관찰하기 위하여 DAPI 염색을 실시하였다. HT29 세포에 추출물을 농도별로 처리한 다음 DAPI로 염색하고 형광현미경을 이용하여 관찰한 결과 Fig. 5에서와 같이 0.1% DMSO를 처리한 대조군의 경우와 비교하여 보았을 때 시료 처리 농도가 증가할수록 핵 내 염색체가 농축된 apoptotic body가 증가함을 알 수 있었다.
META를 다양한 암세포, 인체 대장암 세포 HT29, 폐암 세포 A549 및 간암세포 HepG2에 처리하였을 경우, 암세포의 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 추출물을 처리한 후 WST assay를 사용하여 세포사멸 효과를 확인하였다. 그 결과 Fig. 1A에 제시한 바와 같이 HT29 세포에서는 50 ug/ml 의 META 처리시 뚜렷한 사멸효과를 보였으며, A549 세포와 HepG2 세포는 200 ug/ml의 META 처리시 사멸효과를 보여 암세포에 따라 사멸효과의 정도가 다름을 알 수 있었다. 반면 정상 세포인 3T3-L1과 HEK293 세포에서는 추출물의 독성 이거의 없음을 확인하였다.
측정하였다. 그 결과 Fig. 4A에서 나타낸 바와 같이 대조군에서의 annexin V positive 세포는 4.35%였으나, META 처리에 의해 농도의존적으로 증가하여 최고농도인 100 ug/ml에서는 84.55%까지 증가하였다. Annexin V 염색결과는 정량화하여 Fig.
그 결과 Fig. 6에서와 같이 death receptor인 Fas와 Bcl-2 family 중 pro-apoptotic 단백질인 Bax 단백질이 증가되었고, an-ti-apoptotic 단백질인 Bcl-2가 감소되었다. 또한 이러한 단백질들의 변화에 맞추어 cytosolic cytochrome c가 증가됨에 따라 pro-caspase들이 활성화되어 cleaved caspase 3, 8, 9가 증가되었다.
따라서 META의 항산화능을 DPPH radical scavenging activity 측정을 통해 분석하였다. 그 결과 Table 1에 제시한 바와 같이 META의 농도가 증가함에 따라 DPPH radical 억제능이 0.51 ug/ml에서는 25.02%, 2.56 ug/ ml에서는 41.67% 그리고 12.8 ug/ml에서는 96.14%까지 억제시키는 것을 확인하였다. 또한 억제능 50%일 때의 META의 농도 (IC50)는 4.
그 결과, Fig. 2에서와 같이 META의 처리 농도에 따라 세포사멸효과에 의해 세포밀도가 점차 감소하였고, 50 ug/ml 의 META를 처리하였을 때부터 점차적으로 세포 형태가 불규칙적으로 변하고, 무리를 이루어 자라는 형태가 단일 세포형태로 변하는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 다수의 부유세포가 관찰되었다.
변화를 Flow cytometry로 분석하였다. 그 결과, Fig. 3에서 보여지는 바와 같이, META 농도의존적으로 Sub G1기의 세포비율이 4.33%에서 27.73%로 증가되는 것을 확인하였다. 반면 대조군에서 16.
특히 early apoptotic 세포 (Annexin V/7-AAD-)가 late apoptotic 세포의 수(Annexin V-/7-AAD- )보다 더 크게 증가함을 확인할 수 있었다. 따라서 이와 같은 결과는 META에 의해 세포막에 존재하는 포스파티딜세린(PS)이 세포표면으로 노출되었고 apoptosis가 일어났음을 나타낸다.
하지만 G1기는 농도변화에 따라 세포비율의 큰 변화는 없었으나 최고농도에서는 약간 감소하였다. 따라서 이와 같은 결과로부터 META에 의해 HT29 세포의 S기 및 G2/M기의 세포비율이 감소되면서 apoptosis 유발군인 subG1기의 세포분포가 증가됨을 알 수 있었다.
반면 정상 세포인 3T3-L1과 HEK293 세포에서는 추출물의 독성 이거의 없음을 확인하였다. 또한 Fig. 1B에서 보는 바와 같이 A549 세포와 HepG2 세포의 경우 META의 농도 의존적으로 세포 생존율이 감소하는 것을 볼 수 있었으나 50% 사멸효과 (IC50) 농도가 각각 217.87 ug/ml와 225.51 ug/ml로 사멸 효과가 HT29 세포에 비해 크지 않았다. 반면 HT29 세포의 경우, META 처리농도 25 ug/ml에서부터 세포증식이 억제되었으며, 66.
02%로 감소되었다. 또한 G2/M기의 세포비율은 대조군에서 11.63%였지만 점차적으로 감소하여 200 ug/ml의 META 처리시에는 5.11%로 감소되었다. 하지만 G1기는 농도변화에 따라 세포비율의 큰 변화는 없었으나 최고농도에서는 약간 감소하였다.
14%까지 억제시키는 것을 확인하였다. 또한 억제능 50%일 때의 META의 농도 (IC50)는 4.53 ug/ml, 양성 대조군인 ascorbic acid의 IC50는 1.61 ug/ml로서 양성대조군과 비교하였을 때, 단일물질이 아닌 여러 물질이 섞여있는 추출물인 것을 감안하면 매우 강력한 항산화 활성을 지니는 것을 알 수 있었다.
이러한 변화로서 최종적으로 PARP가 분해되고 apoptosis가 일어남에 따라 세포사멸이 이루어짐을 확인하였다. 이러한 결과로부터 META는 미토콘드리아를 통한 내인성 경로 (intrinsic pathway)와 사멸 수용체를 통하는 외인성 경로 (extrinsic pathway)의 두 가지 경로를 통해 HT29의 apoptosis 를 유도한다고 사료된다.
또한 다수의 부유세포가 관찰되었다. 이러한 결과로부터 META의 처리에 의해 HT29 의 세포 형태에 변화가 일어남을 확인하였다.
또한 이러한 단백질들의 변화에 맞추어 cytosolic cytochrome c가 증가됨에 따라 pro-caspase들이 활성화되어 cleaved caspase 3, 8, 9가 증가되었다. 이러한 변화로서 최종적으로 PARP가 분해되고 apoptosis가 일어남에 따라 세포사멸이 이루어짐을 확인하였다. 이러한 결과로부터 META는 미토콘드리아를 통한 내인성 경로 (intrinsic pathway)와 사멸 수용체를 통하는 외인성 경로 (extrinsic pathway)의 두 가지 경로를 통해 HT29의 apoptosis 를 유도한다고 사료된다.
4B에서 알 수 있듯이 살아있는 세포는 META 농도의존적으로 감소하고, 반면 apoptotic 세포는 점점 증가함을 볼 수 있었다. 특히 early apoptotic 세포 (Annexin V/7-AAD-)가 late apoptotic 세포의 수(Annexin V-/7-AAD- )보다 더 크게 증가함을 확인할 수 있었다. 따라서 이와 같은 결과는 META에 의해 세포막에 존재하는 포스파티딜세린(PS)이 세포표면으로 노출되었고 apoptosis가 일어났음을 나타낸다.
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