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문제 정의
- 위와 같이 황칠나무줄기 열수추출물의 폐암 및 자궁경부암의 항암효과, 항염작용에 대한 결과가 보고되었으나 유방암 세포주에 대한 연구는 접하지 못하였기에 본 연구에서는 유방암세포인 MCF-7과 MDA-MB-231를 이용하여 황칠나무열수추출물의 항암 효과를 세포사멸 관련 유전자 발현 분석을 통해 확인하고자 하였다.
- 이에 본 논문에서는 황칠나무(Dendropanax morbifera)의 열수추출물이 estrogen 비의존성 유방암세포(MDA-MB-231)와 estrogen 의존성 유방암세포(MCF-7)의 증식에 미치는 영향, NO의 생성과 apoptosis 기전에 관여하는 유전자를 mRNA 수준에서 분석하여 apotosis를 통한 천연항암물질로서의 가능성을 확인하고자 하였다.
제안 방법
- 유방암세포(MCF-7, MDA-MB-231)에 DP를 0, 50, 100, 250, 500 μg/ml로 처리하여 24시간동안 배양한 뒤 세포 생존율을 측정하였고, 이것으로 증식 억제 효과를 계산하였다. MCF-7과 MDA-MB-231 세포에 대한 DP의 암세포 증식 억제율은 500 μg/ml 농도에서 MCF-7은 58.
- 그렇기 때문에 항암치료제 물질의 억제 효과를 측정 시 ER-positive와 ER-negative 세포에서 모두 효과를 나타내는지 확인 할 필요가 있다. 이에 ER-positive인 MCF-7과 ER-negative인 MDA-MB-231 세포를 사용하여 DP가 암세포 증식에 미치는 영향을 측정하였다.
- 황칠나무(Dendropanax morbifera)의 열수추출물이 estrogen 비의존성 유방암세포(MDA-MB-231)와 estrogen 의존성 유방암세포(MCF-7)의 증식에 미치는 영향, NO의 생성과 apoptosis 기전에 관여 하는 유전자를 mRNA 수준에서 분석을 통하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
대상 데이터
- 7 세포는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 분양 받아 사용하였다. MCF-7과 MDA-MB-231 세포는 10% FBS가 포함된 RPMI1640배지를 사용하였고, RAW 264.7 세포는 10% FBS가 포함된 DMEM배지를 사용하여 5% CO2, 37℃ 조건하에서 배양 하였다. 세포가 배양 접시의 70~80% 정도 증식하면 1×phosphate buffered saline(PBS, PH 7.
- 이 실험에 사용된 사람유래 유방암 세포주인 MCF-7과 MDA-MB-231 세포와 마우스 유래 단핵구인 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 분양 받아 사용하였다. MCF-7과 MDA-MB-231 세포는 10% FBS가 포함된 RPMI1640배지를 사용하였고, RAW 264.
- 이 실험에 사용한 황칠나무는 완도 자생지에서 채취하였으며, 황칠나무 줄기 분쇄가루 150 g을 1:25의 비율로 3차 증류수를 첨가하여 3시간 동안 환류 열수 추출하였다. 추출된 용액은 whatman No.
이론/모형
- 분리한 total RNA로부터 표적유전자의 mRNA를 역전사시켜 cDNA를 합성하고 SYBR-green Ex Taq(TAKARA Bio INC, Japan)에 세포사멸에 관여하는 유전자인 Bcl-2, Bcl-xL, Bad, Bax, caspase-3, caspase-8, caspase-9, p53, p21, survivin, Rip1을 첨가하여 qPCR을 수행하였다. 모든 반응 실험은 3회 시행 하였으며, 2-ΔΔCT method로 분석하였다. 이 실험에 사용한 primer는 아래와 같다(Table 1).
- 황칠나무 열수추출물(DP)처리에 따른 세포 사멸효과를 측정하기 위해 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT assay)분석법을 이용하였다. 살아있는 세포의 mitochondria dehydrogenase의 능력을 이용하여 노란색 수용성 기질인 MTT를 보라색의 비수용성 formazan으로 변환시키는 방법으로 생성된 formazan의 양은 살아있는 세포수에 비례한다.
성능/효과
- 8. DP가 MCF-7 세포에서 survivin의 발현을 유의하게 억제하였다.9. DP가 Rip1의 발현을 유의하게 증가시켰다.
- 2. DP가 NO의 생성을 억제하였다.3. DP가 MCF-7 세포에서 G1 phase의 정지를 유도하였다.
- 9. DP가 Rip1의 발현을 유의하게 증가시켰다.
- 1. DP가 유방암 세포에서 호르몬 의존성과 상관없이 농도 의존적으로 세포증식을 억제하였다.2. DP가 NO의 생성을 억제하였다.
- DP를 유방암 세포주(MCF-7, MDA-MB-231)에 농도별로 처리하여 유전자의 발현을 mRNA 수준에서 측정한 결과 Bcl-xL의 발현이 DP 300 μg/ml에서 유의하게 감소했으며 Bax의 발현은 DP 300 μg/ml에서 유의하게 증가하였다. 또한 MCF-7 세포에서는 caspase-3, caspase-8, caspase-9의 발현이 증가되었으며, MDA-MB-231 세포에서는 caspase-3, caspase-9의 발현이 증가되었다.
- DP의 0, 50, 100, 250, 500 μg/ml 처리 농도에서 LPS에 의해 유도된 NO의 생성 억제 효과를 측정한 결과 농도 의존적으로 NO의 생성을 억제 하였으며, 이는 DP가 NO의 생성을 억제하여 염증의 진행을 막고, 유해 활성산소의 체내 축적 및 주변 조직 및 세포 손상으로부터 세포를 보호할 수 있음을 시사한다. 따라서 DP는 NO나 NO대사물에 의한 유전자 독성을 억제하여 암 억제 효과가 있을 것으로 사료된다.
- MCF-7, MDA-MB-231 두 유방암세포 모두에서 150, 300 μg/ml 농도로 DP를 처리하면 세포 증식이 억제 되는 것을 현미경을 통해 관찰할 수 있었다. 또한 DP에 의한 증식 억제가 세포가 성장 하고 분열하는 과정에 영향을 끼쳐 세포 주기를 억제 하는지를 분석한 결과, DP가 MCF-7 세포에서 G1 phase의 정지를 유도하고, MDA-MB-231에서 G2/M phase의 정지를 유도하여 세포 증식에 영향을 주는 것으로 사료된다.
- 그러므로 황칠나무 열수추출물은 유방암세포의 세포 증식 억제와 NO 생성 저해뿐만 아니라 세포 주기의 억제와 세포사멸 프로그램에 관여하는 유전자들의 발현 조절을 통해 세포증식을 억제하여 항암효과를 갖는 것으로 사료된다. 이러한 결과는 향후 유방암 치료를 위한 천연물신약의 개발에 참고할 수 있을 것이며 정상 세포에 대한 연구 및 인체 내에서 일어나는 더욱 정확한 기전에 대한 심도있는 연구가 보강되어야 할 것으로 생각된다.
- MCF-7, MDA-MB-231 두 유방암세포 모두에서 150, 300 μg/ml 농도로 DP를 처리하면 세포 증식이 억제 되는 것을 현미경을 통해 관찰할 수 있었다. 또한 DP에 의한 증식 억제가 세포가 성장 하고 분열하는 과정에 영향을 끼쳐 세포 주기를 억제 하는지를 분석한 결과, DP가 MCF-7 세포에서 G1 phase의 정지를 유도하고, MDA-MB-231에서 G2/M phase의 정지를 유도하여 세포 증식에 영향을 주는 것으로 사료된다.
- DP를 유방암 세포주(MCF-7, MDA-MB-231)에 농도별로 처리하여 유전자의 발현을 mRNA 수준에서 측정한 결과 Bcl-xL의 발현이 DP 300 μg/ml에서 유의하게 감소했으며 Bax의 발현은 DP 300 μg/ml에서 유의하게 증가하였다. 또한 MCF-7 세포에서는 caspase-3, caspase-8, caspase-9의 발현이 증가되었으며, MDA-MB-231 세포에서는 caspase-3, caspase-9의 발현이 증가되었다. 이외에도 MCF-7 및 MDA-MB-231 세포에서 p21의 발현을 유의하게 증가시키고 MCF-7에서는 survivin의 발현을 유의하게 억제시켰으며, MCF-7와 MDA-MB-231에서 Rip1의 발현을 유의하게 증가시켰다.
- 먼저 유방암세포(MCF-7, MDA-MB-231)를 0, 50, 100, 250, 500 μg/ml의 DP로 처리하여 24시간 동안 배양한 뒤 증식 억제 효과를 측정한 결과 두 세포주에서 모두 세포 증식 억제 효과가 있는 것을 확인 할 수 있었으며, 이는 호르몬의존성과 상관 없이 유방암 세포에서 DP가 암세포의 성장 억제능을 갖고 있음을 시사한다.
- 이상을 종합하여 볼 때, 황칠나무 열수추출물은 MDA-MB-231과 MCF-7에 대해 항암효과를 나타내는 것으로 사료된다.
- 또한 MCF-7 세포에서는 caspase-3, caspase-8, caspase-9의 발현이 증가되었으며, MDA-MB-231 세포에서는 caspase-3, caspase-9의 발현이 증가되었다. 이외에도 MCF-7 및 MDA-MB-231 세포에서 p21의 발현을 유의하게 증가시키고 MCF-7에서는 survivin의 발현을 유의하게 억제시켰으며, MCF-7와 MDA-MB-231에서 Rip1의 발현을 유의하게 증가시켰다. 이것으로 보아 DP는 Bcl-xL의 발현을 감소시키고, Bax, p21, Rip1의 발현과 caspase-3, caspase-9의 활성을 증가시켜 세포사멸을 증가시킬 것으로 판단되며, 이는 세포주기를 억제하는 결과와 일치하였다.
후속연구
- 유방암의 약 60%는 estrogen receptor(ER) positive이고, anti-estrogen 치료제를 사용하며, ER-negative 유방암은 공격성이 강하고 anti-estrogen 치료제로는 큰 효과를 얻지 못한다25,26). 그렇기 때문에 항암치료제 물질의 억제 효과를 측정 시 ER-positive와 ER-negative 세포에서 모두 효과를 나타내는지 확인 할 필요가 있다. 이에 ER-positive인 MCF-7과 ER-negative인 MDA-MB-231 세포를 사용하여 DP가 암세포 증식에 미치는 영향을 측정하였다.
- 그러므로 황칠나무 열수추출물은 유방암세포의 세포 증식 억제와 NO 생성 저해뿐만 아니라 세포 주기의 억제와 세포사멸 프로그램에 관여하는 유전자들의 발현 조절을 통해 세포증식을 억제하여 항암효과를 갖는 것으로 사료된다. 이러한 결과는 향후 유방암 치료를 위한 천연물신약의 개발에 참고할 수 있을 것이며 정상 세포에 대한 연구 및 인체 내에서 일어나는 더욱 정확한 기전에 대한 심도있는 연구가 보강되어야 할 것으로 생각된다.
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