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문제 정의
- 이에 본 연구는 적포도 가공제품의 주요한 품질지표인 항산화 활성을 신속 간편하게 측정하기 위한 연구의 일환으로, 먼저 적포도주스의 항산화 활성과 항산화 성분, 색도 값을 다양한 방법으로 측정하고 이들 각각의 상관성을 조사하였기에 보고하는 바이다.
가설 설정
- 2)Values with different letters within the same column are significantly different at P<0.05.
- 3)Values with different letters within the same column are significantly different at P<0.05.
제안 방법
- 색도 측정은 분광광도계를 이용한 color hue, color intensity, yellow, red, blue 값과 색차계를 이용한 Hunter L, a, b 값을 측정하였다. 각 시료를 UV-visible Spectrometer(UV 1601, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 420 nm와 520 nm, 620 nm에서 흡광도를 측정하여 color hue(420 nm/520 nm) 값과 color intensity(420 nm+520 nm+620 nm) 값, yellow(100･420 nm/color intensity), red(100･520 nm/color intensity)와 blue(100･620 nm/ color intensity) 값을 각각 계산하였다(15). Hunter L(명도), a(적색도) 및 b(황색도) 값은 표준 백색판(L=97.
- 국내산 적포도주스의 이화학적 특성과 색도 값, 항산화 활성및 항산화 성분을 측정하고 그 상관성을 조사하였다. 이화학적 특성은 가용성 고형분, 환원당, 적정산도와 pH 값을 측정하였으며, 색도는 분광광도계와 Hunter 색차계로 측정하였다.
- 농축된 시료에 methanol 1 mL를 가하여 용해시킨 후 0.45 μm 필터로 여과하여 HPLC(1260 Infinity Quaternary LC System, Agilent Technologies, Waldbronn, Germany)로 시료의 폴리페놀 화합물을 분석하였다.
- 분석용 칼럼은 C18 column(Develosil ODS-HG-5, 4.6×150 mm, Nomura Chemical Co., Aichi, Japan)을 사용하였고, injection volume은 5 μL, 이동상은 용매 A[0.1% formic acid(v/v) in 40% methanol(v/v)]와 B[0.1% formic acid(v/v) in acetonitrile : methanol(1:1, v/v)]를 유속 0.4 mL/min으로 A 액과 B액의 비율을 2분까지 100:0(v/v), 5분까지 80:20(v/ v), 10분에서 20분까지 50:50(v/v)의 비율로 UV detector 254 nm, 330 nm에서 분석하였다.
- 시료 20 μL에 200 nM fluorescein 용액을 120 μL 첨가하고 37°C에서 15분간 방치 후, 200 mM AAPH 용액 60 μL를 혼합하여 multilabel plate counter(Victor 3 1420, Perkin Elmer Inc., Boston, MA, USA)를 이용하여 37°C에서 5분 간격으로 총 120분 동안 형광의 감소를 측정하였으며(excitation 488 nm, emission 520 nm), Trolox 검량선의 회귀식에서 Trolox equivalent mM(TE mM)로 나타내었다.
- 국내산 적포도주스의 이화학적 특성과 색도 값, 항산화 활성및 항산화 성분을 측정하고 그 상관성을 조사하였다. 이화학적 특성은 가용성 고형분, 환원당, 적정산도와 pH 값을 측정하였으며, 색도는 분광광도계와 Hunter 색차계로 측정하였다. 항산화 활성은 1,1-diphenlyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거 활성, ferric ion reducing antioxidant power (FRAP) 방법과 oxygen radical absorbance capacity 방법으로 측정하였으며, 항산화 성분으로는 총 페놀 화합물, 총플라보노이드 화합물, 총 안토시아닌 함량과 high performance liquid chromatography(HPLC)에 의하여 5종의 폴리페놀 화합물을 정량하였다.
- 적포도주스의 이화학적 품질 특성을 조사하기 위하여 가용성 고형분, 환원당 함량, 적정산도, pH를 측정하였다. 가용성 고형분은 굴절당도계(Master-a, Atago Co.
- 총 안토시 아닌 함량(mg/L)은 cyanidin-3-glucoside의 몰흡광계수(ε =26,900 M-1cm-1)를 이용하여 산출하였다.
- 표준물질 gallic acid 검량선의 회귀식에서 gallic acid equivalent(GAE mg/L)로 환산하여 나타내었다. 총 플라보노이드 함량은 Zhishen 등(20)의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료 70 μL에 50% ethanol 430 μL와 5% sodium nitrite 50 μL를 넣고 30분간 방치 후, 10% aluminium nitrate nonahydrate 50 μL를 가하여 6분간 방치한다.
- 4 mL/min으로 A 액과 B액의 비율을 2분까지 100:0(v/v), 5분까지 80:20(v/ v), 10분에서 20분까지 50:50(v/v)의 비율로 UV detector 254 nm, 330 nm에서 분석하였다. 표준물질 gallic acid, caffeic acid, ferulic acid, catechin, quercetin, kaempferol을 이용하여 구한 검량선의 회귀식에서 각 성분의 함량을 구하였다.
- 항산화 성분은 총 페놀 화합물(total phenolic contents), 총 플라보노이드 화합물(total flavonoid contents), 총 안토시아닌(total anthocyanin content) 함량을 측정하였다. 총페놀 화합물 함량은 Folin-Ciocalteu 방법(19)을 이용하여 측정하였다.
- 이화학적 특성은 가용성 고형분, 환원당, 적정산도와 pH 값을 측정하였으며, 색도는 분광광도계와 Hunter 색차계로 측정하였다. 항산화 활성은 1,1-diphenlyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거 활성, ferric ion reducing antioxidant power (FRAP) 방법과 oxygen radical absorbance capacity 방법으로 측정하였으며, 항산화 성분으로는 총 페놀 화합물, 총플라보노이드 화합물, 총 안토시아닌 함량과 high performance liquid chromatography(HPLC)에 의하여 5종의 폴리페놀 화합물을 정량하였다. 가용성 고형분 함량은 12.
- 적포도주스의 항산화 활성과 항산화 성분을 Table 3에 나타내었다. 항산화 활성은 DPPH 라디칼 소거 활성법, FRAP 및 ORAC 방법으로 측정하였으며, 항산화 성분은 총페놀 화합물, 총 플라보노이드 화합물 및 총 안토시아닌 함량을 측정하였다. DPPH 라디칼 소거 활성은 0.
대상 데이터
- Gallic acid, Trolox, naringin, caffeic acid, ferulic acid, catechin, quercetin, kaempferol, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH), ferric chloride, sodium acetate, ferric chloride, potassium ferricyanide, 2,4,6-tris(2-pyridyl)-1,3,5-triazine(TPTZ) 은 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)의 제품을 사용하였고, methanol 등의 추출용 용매는 일급 시약(Duksan Co., Seoul, Korea), HPLC 용매는 J. T. Baker(Phillipsburg, NJ, USA) 제품을 사용하였다.
- 실험 재료 중 적포도주스는 실험실에서 분쇄 후 착즙하여 제조한 적포도주스 2종[A(충북 영동), B(경북 영천), Campbell early]과 대구지역에서 2014년 9월경 구입한 포도과즙 100%인 시판 적포도주스 5종(C~G)을 사용하였다. 항산화 활성, 항산화 성분 및 색도 측정용 시료는 methanol로 10배 희석하여 원심분리(5,000 rpm, 15분, 4°C)하고 침전물을 제거한 용액으로 하였다.
데이터처리
- 모든 실험은 3회 반복하였으며 SAS(statistical analysis system, version 9.3, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)에 의하여 유의차를 검정하였으며(Duncan's multiple range test, P<0.05), 요인 간의 상관성(Pearson's correlation coefficient)을 분석하였다.
이론/모형
- DPPH 라디칼 소거 활성(16)은 시료 100 μL와 200 μM DPPH 용액 900 μL를 혼합하여 30분간 암실에서 방치한 다음 96 well plate에 200 μL씩 분주한 후 microplate reader(Emax precision, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 490 nm에서 측정하였고, gallic acid 검량선의 회귀식에서 gallic acid equivalent mM(GAE mM)로 환산하여 나타내었다. FRAP value의 측정은 Khanizadeh 등(17)의 방법을 변용하여 실험에 이용하였다. 시료 25 μL와 cocktail solution(acetate buffer : TPTZ : ferric chloride solution=10:1:1) 175 μL를 혼합하여 암실에서 30분간 방치 후 650 nm에서 흡광도를 측정했으며 Trolox 검량선의 회귀식에서 Trolox equivalent mM(TE mM)로 나타내었다.
- 시료 25 μL와 cocktail solution(acetate buffer : TPTZ : ferric chloride solution=10:1:1) 175 μL를 혼합하여 암실에서 30분간 방치 후 650 nm에서 흡광도를 측정했으며 Trolox 검량선의 회귀식에서 Trolox equivalent mM(TE mM)로 나타내었다. ORAC value 측정은 Ou 등(18)의 방법으로 측정하였다. 시료 20 μL에 200 nM fluorescein 용액을 120 μL 첨가하고 37°C에서 15분간 방치 후, 200 mM AAPH 용액 60 μL를 혼합하여 multilabel plate counter(Victor 3 1420, Perkin Elmer Inc.
- 적포도주스의 이화학적 품질 특성을 조사하기 위하여 가용성 고형분, 환원당 함량, 적정산도, pH를 측정하였다. 가용성 고형분은 굴절당도계(Master-a, Atago Co., Tokyo, Japan)로 측정하였으며, 환원당 함량은 DNS 비색법(13)으로 측정하였고 적정산도는 AOAC 표준시험법(14)으로, pH는 pH meter(Mettler Toledo MP220, Mettler Toledo Co., Schwerzenbach, Switzerland)를 사용하여 측정하였다.
- 적포도주스의 항산화 활성은 DPPH 라디칼 소거 활성, ferric ion reducing antioxidant power(FRAP) 방법과 oxygen radical absorbance capacity(ORAC) 방법으로 측정하였다. DPPH 라디칼 소거 활성(16)은 시료 100 μL와 200 μM DPPH 용액 900 μL를 혼합하여 30분간 암실에서 방치한 다음 96 well plate에 200 μL씩 분주한 후 microplate reader(Emax precision, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 490 nm에서 측정하였고, gallic acid 검량선의 회귀식에서 gallic acid equivalent mM(GAE mM)로 환산하여 나타내었다.
- 표준물질 rutin 검량선의 회귀식에서 rutin equivalent(RE mg/L)로 환산하여 나타내었다. 총 안토시아닌 함량은 pH differential method(21)를 이용하여 측정하였다. 시료에 0.
- 항산화 성분은 총 페놀 화합물(total phenolic contents), 총 플라보노이드 화합물(total flavonoid contents), 총 안토시아닌(total anthocyanin content) 함량을 측정하였다. 총페놀 화합물 함량은 Folin-Ciocalteu 방법(19)을 이용하여 측정하였다. 시료 100 μL에 2 N Folin-Ciocalteu 시약 50 μL와 20% sodium carbonate 300 μL를 가하여 실온에서 15분간 방치한 후 증류수 1 mL를 넣고 원심분리 하여 상등액을 725 nm에서 흡광도를 측정하였다.
성능/효과
- 2)DPPH, DPPH radical scavenging activity; FRAP, ferric ion reducing antioxidant power; ORAC, oxygen radical absorbance capacity; TPC, total phenolic content; TFC, total flavonoid content; TAC, total anthocyanin content.
- 적포도주스의 항산화 활성 및 항산화 성분과 색도 값들의 상관성을 분석한 결과는 Table 6과 같다. DPPH 라디칼 소거 활성, FRAP 활성, ORAC 활성 모두에서 color hue, yellow 값과는 부의 상관성(color hue: r=-0.8593, r=-0.9335, r=-0.8530, yellow: r=-0.8665, r=-0.9220, r=-0.8658), color intensity, red, blue 값과는 정의 상관성(color intensity: r=0.9046, r=0.9478, r=0.8606, red: r=0.8642, r=0.9168, r=0.8483, blue: r=0.8417, r=0.9051, r= 0.8906)을 보였다. 이 색도 값들은 FRAP 활성과 가장 높은 상관성을 보였으며, 특히 color intensity가 0.
- 항산화 활성은 DPPH 라디칼 소거 활성법, FRAP 및 ORAC 방법으로 측정하였으며, 항산화 성분은 총페놀 화합물, 총 플라보노이드 화합물 및 총 안토시아닌 함량을 측정하였다. DPPH 라디칼 소거 활성은 0.45~1.47 GAE mM, FRAP 활성은 1.91~4.80 TE mM, ORAC 활성은 79.34~475.22 TE mM 범위로 나타났다. 전반적으로 제조한 것에 비하여 시판주스의 항산화 활성이 높았다.
- 총 페놀 화합물 함량은 모든 항산화 활성과 높은 상관성을 보였으며, 총 플라보노이드 화합물 함량 역시 DPPH 라디칼 소거 활성, FRAP 활성과 상관성을 보였다. FRAP 활성의 경우 색도 값들과 매우 높은 상관성을 보였으며, 특히 color intensity 값과 가장 높은 상관성을 보였다(r=0.9478). 총 페놀 화합물 함량은 color intensity, color hue 값과도 각각 정, 부의 높은 상관성을 보였다.
- 이와는 다르게 총 안토시아닌 함량은 항산화 활성과 상관성이 거의 없었다. HPLC로 정량한 gallic acid, catechin, quercetin 함량은 모두 항산화 활성과 상관성이 낮았다.
- 항산화 활성은 1,1-diphenlyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거 활성, ferric ion reducing antioxidant power (FRAP) 방법과 oxygen radical absorbance capacity 방법으로 측정하였으며, 항산화 성분으로는 총 페놀 화합물, 총플라보노이드 화합물, 총 안토시아닌 함량과 high performance liquid chromatography(HPLC)에 의하여 5종의 폴리페놀 화합물을 정량하였다. 가용성 고형분 함량은 12.13~15.97%, 환원당은 13.93~21.93%, 적정산도와 pH는 각각 0.40~0.70%, 2.86~3.21이었으며 시판 포도주스의 산도가 제조품에 비하여 낮았다. 분광법으로 측정한 color hue 값은 제조품이 시판품보다 높은 반면에, color intensity 값은 시판주스가 높게 나타났다(P<0.
- 21의 범위로 나타났다. 가용성 고형분과 적정산도에 비하여 적포도주스의 환원당의 함량이 제품 간에 비교적 편차가 크게 나타났다. 그리고 제조한 적포도주스에 비하여 시판 적포도주스의 적정산도가 낮았다(P<0.
- 전반적으로 제조한 것에 비하여 시판주스의 항산화 활성이 높았다. 또한 총페놀 화합물 함량은 257.94~941.14 GAE mg/L, 총 플라보노이드 화합물 함량은 425.14~1,472.00 RE mg/L였으며, 항산화 활성과 유사하게 제조한 주스보다 시판주스의 함량이 높았다. 이는 시판주스 중에 보존의 목적으로 첨가하는 안식향산 등의 방향성 첨가물에 의한 것으로 사료된다.
- 분광법으로 측정한 color hue 값은 제조품이 시판품보다 높은 반면에, color intensity 값은 시판주스가 높게 나타났다(P<0.05).
- 분광법으로 측정한 color hue 값은 제조한 적포도주스(A, B)가 2.74~ 2.90으로 시판주스(C~G)보다 높은 반면에, color intensity 값은 시판 적포도주스가 1.87~3.07로 제조한 적포도 주스의 값(0.51~0.86)보다 높게 나타났다(P<0.05).
- 8906)을 보였다. 이 색도 값들은 FRAP 활성과 가장 높은 상관성을 보였으며, 특히 color intensity가 0.9478로 매우 높은 상관성을 나타냈다.
- 9478). 총 페놀 화합물 함량은 color intensity, color hue 값과도 각각 정, 부의 높은 상관성을 보였다. 따라서 분광계를 이용하여 적포도주스의 색도 값을 간편하게 측정하여 항산화능을 예측하는 것이 가능할 것으로 사료된다.
- 총 페놀 화합물 함량은 color intensity, red, blue 값과 비교적 높은 정의 상관성(r=0.8434, r=0.8224, r=0.8468)을 보였으며, color hue, yellow, Hunter b 값과는 부의 상관성(r=-0.8362, r=-0.8355, r=-0.7364)을 보였다. 총 플라보노이드 화합물 함량은 color intensity 값과 정의 상관성(r=0.
- 적포도주스의 항산화 활성과 항산화 성분 간의 상관계수를 나타낸 결과는 Table 5와 같다. 총 페놀 화합물 함량은 모든 항산화 활성과 높은 상관성(r=0.8942~0.9195)을 나타냈으며, 총 플라보노이드 화합물 함량은 DPPH 라디칼 소거 활성, FRAP 활성과 비교적 상관성을 보였다(r=0.8375, r=0.7661). 이와는 다르게 총 안토시아닌 함량은 항산화 활성과 상관성이 거의 없었다.
- 항산화 활성과 총 페놀 화합물의 함량은 시판 포도주스가 높았으며, HPLC 에 의하여 gallic acid, caffeic acid, ferulic acid, catechin, quercetin, kaempferol을 정량하였을 때, gallic acid, catechin, quercetin이 모든 시료에서 검출되었다. 총 페놀 화합물 함량은 모든 항산화 활성과 높은 상관성을 보였으며, 총 플라보노이드 화합물 함량 역시 DPPH 라디칼 소거 활성, FRAP 활성과 상관성을 보였다. FRAP 활성의 경우 색도 값들과 매우 높은 상관성을 보였으며, 특히 color intensity 값과 가장 높은 상관성을 보였다(r=0.
- 7364)을 보였다. 총 플라보노이드 화합물 함량은 color intensity 값과 정의 상관성(r=0.7524)을 보였고, Hunter L, b 값과는 부의 상관성(r=-0.8055, r=-0.8223)을 나타내었다. HPLC를 통해 분석된 폴리페놀 화합물 중 quercetin이 높은 color hue 값을 나타냈다는 연구 결과가 있었으며(25), 포도주의 발효 중총 페놀 화합물의 함량이 color intensity 값과 정의 상관성, color hue 값과는 부의 상관성을 나타낸다는 보고가 있었다 (22).
- 적포도주스 가수분해물의 폴리페놀 화합물 조성을 HPLC로 분석하여 Table 4에 나타내었다. 페놀산의 일종인 gallic acid, 플라보노이드 화합물인 catechin, quercetin이 모든 적포도주스에서 검출되었으며, 그 함량은 각각 31.61~38.08 mg/L, 56.63~73.87 mg/L, 47.20~51.87 mg/ L의 범위로 나타났다. Caffeic acid와 kaempferol은 적포도 주스 C에서, ferulic acid는 제조한 주스 A, B에서만 확인되었다.
- Hunter L, a, b 값들은 제조품과 시판품의 차이가 거의 없었다. 항산화 활성과 총 페놀 화합물의 함량은 시판 포도주스가 높았으며, HPLC 에 의하여 gallic acid, caffeic acid, ferulic acid, catechin, quercetin, kaempferol을 정량하였을 때, gallic acid, catechin, quercetin이 모든 시료에서 검출되었다. 총 페놀 화합물 함량은 모든 항산화 활성과 높은 상관성을 보였으며, 총 플라보노이드 화합물 함량 역시 DPPH 라디칼 소거 활성, FRAP 활성과 상관성을 보였다.
후속연구
- 이는 꿀 중의 flavone, flavonol과 color intensity가 높은 상관성을 보였다는 보고(27)와도 유사하다. 따라서 color intensity와 color hue 값을 분광계로 측정하여 적포도주스 중의 폴리페놀 화합물과 같은 항산화 물질의 함량과 항산화 활성을 예측하는 것이 가능할 것으로 사료된다.
- 총 페놀 화합물 함량은 color intensity, color hue 값과도 각각 정, 부의 높은 상관성을 보였다. 따라서 분광계를 이용하여 적포도주스의 색도 값을 간편하게 측정하여 항산화능을 예측하는 것이 가능할 것으로 사료된다.
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