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문제 정의
- 이 연구에서는 해충저항성 작물을 개발하기 위한 예비단계로서 곤충 면역과 발육을 교란하는 바이러스 유래 시스타틴 유전자를 해충 방제에 응용하는데 궁극적 목적을 두었다. 이를 위해 담배를 대상 작물로 이 유전자의 형질전환체를 구축하는 과정을 시도하고, 이를 통해 바이러스 시스타틴 유전자의 작물체를 통한 살충효과를 검정하였다.
제안 방법
- 재분화체 및 비형질전환체 담배 잎에서 Amani et al. (2011)의 방법으로 게놈 DNA를 추출하여 주형으로 사용하고 시스타틴 유전자의 담배 게놈 내 삽입을 확인하기 위한 프라이머로 운반체 제작에 사용한 시스타틴 유전자 프라이머 짝을 사용하였고, CaMV 35S 프로모터 및 시스타틴 유전자 삽입 확인용으로CaMV 35S 프로모터 영역의 정방향 프라이머(5‘-GCTCCTACAAATGCCATCA-3’)와 운반체 제작에 이용한 시스타틴 유전자의 역방향 프라이머를 이용하여 운반체 제작과 동일한 PCR조건으로 증폭, 목표유전자의 삽입을 확인하였다. Quantitativereal-time PCR (qRT-PCR)을 실시하기 위하여 형질전환 개체 및 비형질전환 개체 잎에서 Trizol (Ambion, Austin, TX, USA)을 사용하여 전체 RNA를 추출하고 RT-mix kit (Intron, Seoul, Korea)로 합성한 cDNA와, 시스타틴 유전자 프라이머 짝과 SYBR Green Realtime PCR master mix (Toyobo, Osaka, Japan)를 혼합하여 Applied Biosystems 7500 real-time PCR system(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 이용하여 제조사가 제시한 방법으로 qRT-PCR을 수행하였다.
- PCR 분석에서 시스타틴 유전자가 삽입된 형질전환 개체와 비형질전환 개체의 잎을 이용하여 갓 부화한 담배나방(Helicoverpaassulta) 1령 유충에 대한 생물검정을 실시했다. 형질전환체에 대한 담배나방유충의 살충력을 확인하기 위해 시험곤충들은 6시간 동안 절식시켰다.
- 1 클로닝벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 subcloning하고 플라스미드를 분리하여 제한효소 XbaI과 SacI으로 절단하였다. 발현 운반체를 제작하기 위해 pBI121 운반체내의 right board와 left board 영역 내에 존재하는 CaMV 35S promoter 하류의 XbaI 부위와 nopaline synthase terminator (NOS-T) 상류의 SacI 부위를 제한효소로 절단하여 리포터 유전자로 이용되는 β-glucuronidase (GUS)유전자 ORF 영역을 제거하고 그 부위에 시스타틴 유전자를 삽입하여 재조합시키고 대장균에 형질전환하였다. 시스타틴 유전자가 삽입된 클론을 선발하여 식물체 발현용 운반체, pBI121-CST를 제작하였다.
- 발현 운반체를 제작하기 위해 pBI121 운반체내의 right board와 left board 영역 내에 존재하는 CaMV 35S promoter 하류의 XbaI 부위와 nopaline synthase terminator (NOS-T) 상류의 SacI 부위를 제한효소로 절단하여 리포터 유전자로 이용되는 β-glucuronidase (GUS)유전자 ORF 영역을 제거하고 그 부위에 시스타틴 유전자를 삽입하여 재조합시키고 대장균에 형질전환하였다. 시스타틴 유전자가 삽입된 클론을 선발하여 식물체 발현용 운반체, pBI121-CST를 제작하였다. pBI121-CST 운반체를 아그로박테리움에 도입하기 위하여 MicroPulser electroporation system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 아그로박테리움 LBA4404(Takara, Otsu, Shiga, Japan) electro-cells 20 μl에 운반체 1 ng을 혼합하고, 1 mm cuvette에 주입하여 1.
- 식물체 발현 운반체를 제작하기 위해 바이러스 시스타틴cDNA (Kim et al., 2013)를 이용하여 제한효소 XbaI 인식서열(밑줄표시)이 부가된 정방향 프라이머 (5’-GCTCTAGAATGTGCAAGGAATATCGAGT–3’)와 SacI 인식서열(밑줄표시)이 부가된 역방향 프라이머(5’-CGAGCTCTTAATTTGAATCATCAATTTCA-3’)로 94℃ 30 초, 54℃ 30 초, 72℃ 1 분 조건으로 35 회 반복 PCR을 실시하여 open reading frame (ORF) 영역을 증폭하고 그 PCR 산물을 pCR2.1 클로닝벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 subcloning하고 플라스미드를 분리하여 제한효소 XbaI과 SacI으로 절단하였다. 발현 운반체를 제작하기 위해 pBI121 운반체내의 right board와 left board 영역 내에 존재하는 CaMV 35S promoter 하류의 XbaI 부위와 nopaline synthase terminator (NOS-T) 상류의 SacI 부위를 제한효소로 절단하여 리포터 유전자로 이용되는 β-glucuronidase (GUS)유전자 ORF 영역을 제거하고 그 부위에 시스타틴 유전자를 삽입하여 재조합시키고 대장균에 형질전환하였다.
- 이 연구는 곤충의 생리 교란효과가 밝혀진 폴리드나바이러스 유래 CpBV-CST1 유전자의 살충효과를 형질전환담배를 제작하여 확인하였다. 이러한 결과는 이 바이러스 유전자가 식물세포에서 발현되어 생리적 기능을 발휘한 것으로 해석된다.
- 이 연구에서는 해충저항성 작물을 개발하기 위한 예비단계로서 곤충 면역과 발육을 교란하는 바이러스 유래 시스타틴 유전자를 해충 방제에 응용하는데 궁극적 목적을 두었다. 이를 위해 담배를 대상 작물로 이 유전자의 형질전환체를 구축하는 과정을 시도하고, 이를 통해 바이러스 시스타틴 유전자의 작물체를 통한 살충효과를 검정하였다.
대상 데이터
- 형질전환체 제작의 식물재료로 Nicotiana tabacum cv. KY14담배종자를 사용하였으며 70% 에틸알코올로 1 분간 표면살균을 한 후 25% sodium hypochlorite 용액에 15 분간 침지하고 멸균수로 3 회 세척하여 발아배지[4.4 g/L MS 배지(Murashigeand Skoog, 1962), 20 g/L sucrose, 8 g/L phyto agar, pH 5.8]에 치상하고 25℃, 2,000 lux, 24 시간 명조건으로 발아시키고 6-9주 생장된 잎을 형질전환용 식물재료로 사용하였다.
이론/모형
- (2011)의 방법으로 게놈 DNA를 추출하여 주형으로 사용하고 시스타틴 유전자의 담배 게놈 내 삽입을 확인하기 위한 프라이머로 운반체 제작에 사용한 시스타틴 유전자 프라이머 짝을 사용하였고, CaMV 35S 프로모터 및 시스타틴 유전자 삽입 확인용으로CaMV 35S 프로모터 영역의 정방향 프라이머(5‘-GCTCCTACAAATGCCATCA-3’)와 운반체 제작에 이용한 시스타틴 유전자의 역방향 프라이머를 이용하여 운반체 제작과 동일한 PCR조건으로 증폭, 목표유전자의 삽입을 확인하였다. Quantitativereal-time PCR (qRT-PCR)을 실시하기 위하여 형질전환 개체 및 비형질전환 개체 잎에서 Trizol (Ambion, Austin, TX, USA)을 사용하여 전체 RNA를 추출하고 RT-mix kit (Intron, Seoul, Korea)로 합성한 cDNA와, 시스타틴 유전자 프라이머 짝과 SYBR Green Realtime PCR master mix (Toyobo, Osaka, Japan)를 혼합하여 Applied Biosystems 7500 real-time PCR system(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 이용하여 제조사가 제시한 방법으로 qRT-PCR을 수행하였다. 각 시료는 3 반복 처리하여 94℃에서 10 분간 반응시키고 94℃ 1 분, 50℃ 30 초, 72℃ 40 초간 40 회 반복으로 PCR을 실시했으며 β-actin을 대조로 사용하였다.
- 사용된 β-actin 유전자 프라이머의 서열은 5’-TGGCACCACACCTTCTAC-3’과 5’-CATGATCTGGGTCATCTTCT-3’이였다. 유전자의 상대적 발현량 분석을 위해 comparative CT (ΔΔCT) 방법 (Livak and Schmittgen, 2001)을 사용하였다.
성능/효과
- 이러한 결과는 이 바이러스 유전자가 식물세포에서 발현되어 생리적 기능을 발휘한 것으로 해석된다. 따라서 담배 기주식물에서 발현된 CpBV-CST1 단백질인 시스타틴이 곤충의 섭식 작용을 통해 소화관으로 유입되었고, 여기에서 살충효과를 발휘하였을 것으로 추정된다. Kim et al.
- , 2006). 따라서 폴리드나바이러스 유래 시스타틴에 의해 피기생체의 캐셉신 활성을 교란하는 것은 피기생체 기주에게는 불리하지만, 숙주 기생봉에는 유리한 환경을 초래할 수 있다.
- 이 연구는 곤충 생리를 교란하는 유전자인 CpBV-CST1 유전자를 담배게놈에 삽입하여 형질전환담배를 구축하는 것을 보여 주었다. 현재 곤충병원성 세균인 Bacillus thuringiensis에서 유래된 Cry 독소단백질을 이용하여 다양한 작물에 대한 형질전환체를 상용화하고 있고 이를 재배하는 면적이 기하급수적으로 증가하고 있다(Tabashnik et al.
- , 2014). 이러한 결과는 이 CpBVCST1 유전자를 작물에서 발현시킬 경우 해충 억제에 유효할 것으로 예견되었다.
후속연구
- 이때 CpBV-CST1은 대안으로 새로운 형질전환 작물체를 개발하는 데 이용될 수 있다. 이를 위해 본 연구에서 보여준 형질전환 생리적 유용효과를 다시 차세대에서 안정적으로 발현되는 것을 보여주는 후속 연구가 필요하다.
- 그러나 다른 화학농약과 마찬가지로 이들 비티에 대한 해충의 저항성 발달이 실내는 물론이고 야외 농작물 재배지에서 보고되고 있다. 이에 대한 대책 가운데 일환으로 곤충의 생리작용을 교란하는 다양한 유용유전자의 발굴이 필요하며, 이를 이용하여 비티에 대한 한계를 극복하는 새로운 형질전환체의 개발이 시급해질 수 있다. 이때 CpBV-CST1은 대안으로 새로운 형질전환 작물체를 개발하는 데 이용될 수 있다.
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