누룩으로부터 오르니틴 생성능을 갖는 Pediococcus 속 균주의 분리 및 오르니틴 함유 막걸리의 3T3-L1 세포의 중성지질 축적 억제 효과 Isolation of Pediococcus Strain from Nuruk and Anti-Lipid Accumulation Effect of Ornithine-Containing Makgeolli on 3T3-L1 Cells원문보기
본 연구에서는 누룩에서 ornithine 생성능을 보유하고 있는 Pediococcus 속 균주를 동정하고, ornithine 생성 유산균인 Pediococcus pentosaceus TNO-4를 이용하여 막걸리를 제조하였다. Ornithine의 전구물질인 arginine과 Pediococcus pentosaceus TNO-4를 첨가하여 제조한 ornithine 함유 막걸리의 ornithine 함량을 측정하고 세포 수준에서의 지방구 형성 억제 효과를 통한 항비만 효과를 평가하였다. Ornithine 막걸리의 ornithine 함량은 일반 막걸리에 비하여 3배 증가되었으며, 세포 실험 결과 0.05 mg/mL 농도의 ornithine 막걸리를 3T3-L1 세포에 처리하였을 때 독성이 없는 수준에서 유의적으로 지방구 형성을 억제하는 것을 관찰하였다. 본 연구를 바탕으로 후속 연구가 이루어진다면 기능성 물질이 강화된 우리나라 전통술인 막걸리를 통하여 지질축적 억제를 통한 항비만 효과를 기대해 볼 수 있을 것이라 사료된다. 더 나아가서 기능성이 부각된 막걸리의 개발을 통하여 막걸리 시장에 새로운 판로를 개척할 수 있고, 누룩에서 분리된 ornithine 생성능을 가진 유산균은 막걸리 이외에 여러 가지 발효식품에도 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
본 연구에서는 누룩에서 ornithine 생성능을 보유하고 있는 Pediococcus 속 균주를 동정하고, ornithine 생성 유산균인 Pediococcus pentosaceus TNO-4를 이용하여 막걸리를 제조하였다. Ornithine의 전구물질인 arginine과 Pediococcus pentosaceus TNO-4를 첨가하여 제조한 ornithine 함유 막걸리의 ornithine 함량을 측정하고 세포 수준에서의 지방구 형성 억제 효과를 통한 항비만 효과를 평가하였다. Ornithine 막걸리의 ornithine 함량은 일반 막걸리에 비하여 3배 증가되었으며, 세포 실험 결과 0.05 mg/mL 농도의 ornithine 막걸리를 3T3-L1 세포에 처리하였을 때 독성이 없는 수준에서 유의적으로 지방구 형성을 억제하는 것을 관찰하였다. 본 연구를 바탕으로 후속 연구가 이루어진다면 기능성 물질이 강화된 우리나라 전통술인 막걸리를 통하여 지질축적 억제를 통한 항비만 효과를 기대해 볼 수 있을 것이라 사료된다. 더 나아가서 기능성이 부각된 막걸리의 개발을 통하여 막걸리 시장에 새로운 판로를 개척할 수 있고, 누룩에서 분리된 ornithine 생성능을 가진 유산균은 막걸리 이외에 여러 가지 발효식품에도 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
To evaluate the functional effect of ornithine produced by isolated lactic acid bacteria, we examined the anti-lipid accumulation effect of ornithine produced by isolate lactic acid bacteria on 3T3-L1 cells. Lactic acid bacteria (Pediococcus strain) were isolated from nuruk, which is made from wheat...
To evaluate the functional effect of ornithine produced by isolated lactic acid bacteria, we examined the anti-lipid accumulation effect of ornithine produced by isolate lactic acid bacteria on 3T3-L1 cells. Lactic acid bacteria (Pediococcus strain) were isolated from nuruk, which is made from wheat, rice, and barley (whole grain, grits, or flour) by fermenting microorganisms (Aspergillus, Rhizopus, and yeasts). Pediococcus strain was identified by 16S rDNA sequencing analyses, and cells were collected by centrifugation and developed as an ornithine starter. makgeolli, an ornithine-containing Korean traditional alcoholic beverage, was made with isolated lactic acid bacteria and arginine. makgeolli was made with the help of ornithine starter using a makgeolli making kit. We evaluated the anti-proliferation effect of ornithine makgeolli on 3T3-L1 cells. To determine the anti-proliferation effect of ornithine makgeolli on preadipocytes, lipid droplets were quantified and stained with Oil Red O. makgeolli made with ornithine starter and arginine showed a 3-fold higher concentration of ornithine compared to makgeolli without starter and arginine. In the results of 3T3-L1 cell line experiment, lipid accumulation was significantly reduced by adding 0.05 mg/mL of ornithine makgeolli compare to the control (adipocyte without sample). In conclusion, ornithine makgeolli containing ornithine starter isolated from nuruk showed an anti-lipid accumulation effect with increased ornithine content without toxicity.
To evaluate the functional effect of ornithine produced by isolated lactic acid bacteria, we examined the anti-lipid accumulation effect of ornithine produced by isolate lactic acid bacteria on 3T3-L1 cells. Lactic acid bacteria (Pediococcus strain) were isolated from nuruk, which is made from wheat, rice, and barley (whole grain, grits, or flour) by fermenting microorganisms (Aspergillus, Rhizopus, and yeasts). Pediococcus strain was identified by 16S rDNA sequencing analyses, and cells were collected by centrifugation and developed as an ornithine starter. makgeolli, an ornithine-containing Korean traditional alcoholic beverage, was made with isolated lactic acid bacteria and arginine. makgeolli was made with the help of ornithine starter using a makgeolli making kit. We evaluated the anti-proliferation effect of ornithine makgeolli on 3T3-L1 cells. To determine the anti-proliferation effect of ornithine makgeolli on preadipocytes, lipid droplets were quantified and stained with Oil Red O. makgeolli made with ornithine starter and arginine showed a 3-fold higher concentration of ornithine compared to makgeolli without starter and arginine. In the results of 3T3-L1 cell line experiment, lipid accumulation was significantly reduced by adding 0.05 mg/mL of ornithine makgeolli compare to the control (adipocyte without sample). In conclusion, ornithine makgeolli containing ornithine starter isolated from nuruk showed an anti-lipid accumulation effect with increased ornithine content without toxicity.
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문제 정의
이에 따라 본 실험에서는 누룩에서 기능성을 가진 ornithine 생성능이 우수한 균주를 스크리닝 하여 ornithine 유산균 스타터를 개발하고 이를 막걸리에 첨가하여 제조하였다. 더 나아가 개발된 ornithine 막걸리의 기능성을 입증하기 위하여 in vitro 수준에서의 지방세포 분화 억제능을 보고자 하였다.
제안 방법
1, 2차회수한 상등액을 합하여 동결건조 하였고, 초순수로 용해하여 0.45 μm PVDF 막을 통과시킨 후 TLC 및 HPLC를 이용하여 ornithine 함유량을 비교하였다(23).
16SrDNA의 클로닝을 위해 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'(forward), 5'-ACGGGCGGGTGTGTRC-3'(reverse)의 primer를 이용하여 PCR 증폭을 시행하였다.
3T3-L1 preadipocyte를 6-well culture plate에서 100% confluence 상태가 될 때까지 배양하고 2일 후 분화배지[MDI solution(0.5 mM isobutylmethylxanthine(IBMX),1 μM dexamethasone, 10 μg/mL insulin]를 3일 동안 처리하였고 다시 10% FBS와 insulin(10 μg/mL)이 포함된DMEM 배지로 교환한 후 배양하여 지방세포로 분화시켰다.
5 mM isobutylmethylxanthine(IBMX),1 μM dexamethasone, 10 μg/mL insulin]를 3일 동안 처리하였고 다시 10% FBS와 insulin(10 μg/mL)이 포함된DMEM 배지로 교환한 후 배양하여 지방세포로 분화시켰다.Ornithine 막걸리 샘플은 0.05 mg/mL의 농도로 분화과정의 각 단계마다 처리하였다. 분화가 완료된 3T3-L1 세포를PBS로 2회 세척하고 5% triton-X100으로 homogenize 한 후 heating과 cooling을 2회 반복하여 원심분리하고 상등액을 취한 뒤 10배 희석하였다.
Ornithine 생성 유산균인 Pediococcus pentosaceusTNO-4를 이용하여 제조한 막걸리의 ornithine 함량을 측정하였다. Arginine 무 첨가 막걸리에서는 44.
Ornithine 생성능이 있는 누룩 유산균주 동정은 16SrDNA sequence 분석으로 하여 동정하였다(22). 균주 동정을 위해 후보 균주로부터 genomic DNA를 DNeasy Blood＆Tissue kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)을 이용하였고,DNA의 정제는 제조사의 지침을 따라 추출하였다.
본 연구에서는 누룩에서 ornithine 생성능을 보유하고 있는Pediococcus 속 균주를 동정하고, ornithine 생성 유산균인Pediococcus pentosaceus TNO-4를 이용하여 막걸리를 제조하였다. Ornithine의 전구물질인 arginine과 Pediococcus pentosaceus TNO-4를 첨가하여 제조한 ornithine 함유 막걸리의 ornithine 함량을 측정하고 세포 수준에서의 지방구 형성 억제 효과를 통한 항비만 효과를 평가하였다. Ornithine 막걸리의 ornithine 함량은 일반 막걸리에 비하여 3배 증가되었으며, 세포 실험 결과 0.
025U/μL를 사용하여 95℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초의annealing, 72℃에서 1분 30초의 신장으로 하는 35 cycle을 Biometra Thermocycler(Biometra, Goettingen, Germany)로 증폭시켰다(21). PCR 산물을 1% 아가로스 겔 전기영동을 실시하여 확인하였다. 16S rDNA sequencing을통해 염기서열 정보를 얻었다.
이어 ornithine 생성능 시험을 위하여 분리된 유산균을 1% arginine이 첨가된 MRS 배지에 배양(25℃, 48 h)하고 TLC를 이용하여 유산균의 ornithine 생성능을 조사하였다. TLC는 silica gel F254(Merck,Darmstadt, Germany)와 표준 ornithine(Merck), 이동상(butanol : acetic acid : dichoromethanol : water=5:3:3:3)을 이용하여 실시하였다(21,23).
누룩으로부터 분리한 유산균주의 ornithine 생성 가능성은 TLC를 이용하여 조사하였다. TLC를 통한 ornithine 후보 균주 17개 중 9개를 선별하여 arginine 전환이 우수한 균주를 2차 선별하여 염기서열 분석을 하고 가장 우수한TNO-4를 선정하였다(Fig. 1, Table 1).
Ornithine 생성능이 있는 누룩 유산균주 동정은 16SrDNA sequence 분석으로 하여 동정하였다(22). 균주 동정을 위해 후보 균주로부터 genomic DNA를 DNeasy Blood＆Tissue kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)을 이용하였고,DNA의 정제는 제조사의 지침을 따라 추출하였다. 16SrDNA의 클로닝을 위해 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'(forward), 5'-ACGGGCGGGTGTGTRC-3'(reverse)의 primer를 이용하여 PCR 증폭을 시행하였다.
Oil Red O 염색을 위해서 10% formalin으로 고정한 세포에 Oil Red O solution을 처리한 후 실온에서 30분간 염색하였다. 그 이후에 Oil Red O solution을 제거하고 증류수로 세척하여 건조시킨 후 현미경으로 관찰하였다.
누룩으로부터 분리한 유산균주의 ornithine 생성 가능성은 TLC를 이용하여 조사하였다. TLC를 통한 ornithine 후보 균주 17개 중 9개를 선별하여 arginine 전환이 우수한 균주를 2차 선별하여 염기서열 분석을 하고 가장 우수한TNO-4를 선정하였다(Fig.
본 실험에서 개발한 ornithine 막걸리가 3T3-L1 preadipocyte에 독성을 나타내는지 알아보기 위하여 MTTassay를 실시하였다. 96-well culture plate에 2.
본 연구에서는 누룩에서 ornithine 생성능을 보유하고 있는Pediococcus 속 균주를 동정하고, ornithine 생성 유산균인Pediococcus pentosaceus TNO-4를 이용하여 막걸리를 제조하였다. Ornithine의 전구물질인 arginine과 Pediococcus pentosaceus TNO-4를 첨가하여 제조한 ornithine 함유 막걸리의 ornithine 함량을 측정하고 세포 수준에서의 지방구 형성 억제 효과를 통한 항비만 효과를 평가하였다.
05 mg/mL의 농도를 처리하여 중성지방 농도를 측정함으로써 지방세포 분화에서의 영향을 평가하였다. 분화 시 처리되었던 농도는 시중 막걸리에서 10~50% 중성지방축적 저해 효과를 보였던 농도를 따라 설정하였다(3). Fig.
Ornithine 생성 유산균을 MRS 배지 10 L에 25℃, 48시간 배양하고 원심분리(5,000 rpm, 10 min)를 통해 cell을 분리하여 수집하였다. 수집된 cell을 동결건조 하여 스타터를 제조하였다. (유)대신환경개발 그린바이오식품에서 생산되는 막걸리 kit(술익거든)에 수집된 스타터 0.
5×103cells/well을 분주하여 24시간 동안 부착시킨 후 시료를 농도별로 처리하여 24, 48시간 동안 배양하였다. 시료 처리 후 시간별로 EZ-Cytox(Daeil Lab Service, Seoul, Korea) 시약이 포함된 배지로 교체하여 2시간 동안 반응시킨 후 microplate reader(MRX Ⅱ, Dynex Technologies, Chantilly, VA, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 증식율(%)은 시료처리군 흡광도/control군 흡광도의 평균×100으로 계산하였다.
16S rDNA sequencing을통해 염기서열 정보를 얻었다. 얻어진 16S rDNA의 서열정보를 이용하여 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 DNA의 상동성 조사에 활용하여 분석하였다.
본 실험에서 사용한 누룩은 (유)대신환경개발 그린바이오식품(Gunsan, Korea)에서 제공하였으며 ornithine 생산능 보유 유산균의 분리에 사용하였다. 유산균의 분리는 100mL MRS에 누룩을 1% 첨가한 뒤 25℃에서 48시간 배양 후 배양액을 1% 펩톤수로 10-1~10-8 범위로 희석하였고, 희석액을 0.1 mL씩 분주하여 DE MAN, ROGOSA, SHARPE(MRS)(Difco, Detroit, MI, USA) 고체 배지에 배양하였다. 배지에는 0.
콜로니 중에서 환을 형성하지 않으면서 진한 노란색을 띠는 것을 Pediococcus 속후보군으로 분리하였다(22). 이어 ornithine 생성능 시험을 위하여 분리된 유산균을 1% arginine이 첨가된 MRS 배지에 배양(25℃, 48 h)하고 TLC를 이용하여 유산균의 ornithine 생성능을 조사하였다. TLC는 silica gel F254(Merck,Darmstadt, Germany)와 표준 ornithine(Merck), 이동상(butanol : acetic acid : dichoromethanol : water=5:3:3:3)을 이용하여 실시하였다(21,23).
이에 따라 본 실험에서는 누룩에서 기능성을 가진 ornithine 생성능이 우수한 균주를 스크리닝 하여 ornithine 유산균 스타터를 개발하고 이를 막걸리에 첨가하여 제조하였다. 더 나아가 개발된 ornithine 막걸리의 기능성을 입증하기 위하여 in vitro 수준에서의 지방세포 분화 억제능을 보고자 하였다.
지방세포 크기는 한계가 있기 때문에 과잉의 영양공급 시 에너지의 신속한 저장을 위하여 지방세포 수의 증가가 일어나며 지방이 축적된다(25). 지방세포 분화 유도 시 ornithine 막걸리 0.05 mg/mL의 농도를 처리하여 중성지방 농도를 측정함으로써 지방세포 분화에서의 영향을 평가하였다. 분화 시 처리되었던 농도는 시중 막걸리에서 10~50% 중성지방축적 저해 효과를 보였던 농도를 따라 설정하였다(3).
대상 데이터
마우스 배아에서 유래한 3T3-L1 세포주(American TypeCulture Collection(ATCC), Manassas, VA, USA)를 37℃, 5% CO2 조건에서 10% bovine serum(BS, Gibco,Grand Island, NY, USA)과 penicillin/streptomycin이 포함된 DMEM 배지로 배양하였다. 3T3-L1 preadipocyte는 신선한 배지로 2일마다 교환하였으며, 80~90% confluent하게 되면 1 mM trypsin-EDTA(HyClone, Logan, UT,USA)를 처리하여 계대배양 하였다.
본 실험에서 사용한 누룩은 (유)대신환경개발 그린바이오식품(Gunsan, Korea)에서 제공하였으며 ornithine 생산능 보유 유산균의 분리에 사용하였다. 유산균의 분리는 100mL MRS에 누룩을 1% 첨가한 뒤 25℃에서 48시간 배양 후 배양액을 1% 펩톤수로 10-1~10-8 범위로 희석하였고, 희석액을 0.
데이터처리
Data are expressed as mean±SD and treatment group (ornithine contained makgeolli 0.05 mg/mL) compared with untreated adipocyte control (*P<0.05) by independent t-test.
모든 실험 결과는 평균과 표준편차로 나타내었고, SPSS12.0 package program(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을이용하여 one-way AVOVA(analysis of variance)로 유의성 검정을 하고 P<0.05).
이론/모형
분화가 완료된 3T3-L1 세포를PBS로 2회 세척하고 5% triton-X100으로 homogenize 한 후 heating과 cooling을 2회 반복하여 원심분리하고 상등액을 취한 뒤 10배 희석하였다. Triglyceride quantification kit(Biovision Inc., Mountain View, CA, USA)의 protocol에 따라 지방구 생성량을 측정하였다. 결과는 대조군(adipocyte control) 대비 중성지방축적율(%)로 나타내었으며, 시료처리군 TG 양/adipocyte 대조군 TG 양의 평균×100으로 계산하였다.
성능/효과
Arginine 무 첨가 막걸리에서는 44.76±6.61 mg/100 g이었으며 arginine 첨가 막걸리 함량은 127.25±5.86mg/100 g으로 arginine 첨가에 따른 ornithine 함량이 3배 증가되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2).
Fig. 4와 같이 ornithine막걸리 처리 시 샘플을 처리하지 않은 대조군에 비해 중성지방축적량이 유의적으로 감소하였고, OM(82.09±3.39%)은control(103.84±18.34%) 대비 약 20%의 지방구 형성 감소를 나타냈다.
Ornithine의 전구물질인 arginine과 Pediococcus pentosaceus TNO-4를 첨가하여 제조한 ornithine 함유 막걸리의 ornithine 함량을 측정하고 세포 수준에서의 지방구 형성 억제 효과를 통한 항비만 효과를 평가하였다. Ornithine 막걸리의 ornithine 함량은 일반 막걸리에 비하여 3배 증가되었으며, 세포 실험 결과 0.05 mg/mL 농도의 ornithine 막걸리를 3T3-L1 세포에 처리하였을 때 독성이 없는 수준에서 유의적으로 지방구 형성을 억제하는 것을 관찰하였다. 본 연구를 바탕으로 후속 연구가 이루어진다면 기능성 물질이 강화된 우리나라 전통술인 막걸리를 통하여 지질축적 억제를 통한 항비만 효과를 기대해 볼 수 있을 것이라 사료된다.
따라서 지방세포의 분화 정도뿐만 아니라 세포 안의 지방축적을 억제하는 것은 지질대사 개선과 항비만 효과에 일조한다(26). 따라서 세포 수준에서 중성지방축적 억제 효과가 있는 ornithine막걸리의 지질 수준 개선의 가능성을 시사하는 결과로 사료된다.
후속연구
본 연구를 바탕으로 후속 연구가 이루어진다면 기능성 물질이 강화된 우리나라 전통술인 막걸리를 통하여 지질축적 억제를 통한 항비만 효과를 기대해 볼 수 있을 것이라 사료된다. 더 나아가서 기능성이 부각된 막걸리의 개발을 통하여 막걸리 시장에 새로운 판로를 개척할 수 있고, 누룩에서 분리된 ornithine 생성능을 가진 유산균은 막걸리 이외에 여러 가지 발효식품에도 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
05 mg/mL 농도의 ornithine 막걸리를 3T3-L1 세포에 처리하였을 때 독성이 없는 수준에서 유의적으로 지방구 형성을 억제하는 것을 관찰하였다. 본 연구를 바탕으로 후속 연구가 이루어진다면 기능성 물질이 강화된 우리나라 전통술인 막걸리를 통하여 지질축적 억제를 통한 항비만 효과를 기대해 볼 수 있을 것이라 사료된다. 더 나아가서 기능성이 부각된 막걸리의 개발을 통하여 막걸리 시장에 새로운 판로를 개척할 수 있고, 누룩에서 분리된 ornithine 생성능을 가진 유산균은 막걸리 이외에 여러 가지 발효식품에도 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
그러므로 누룩으로부터 분리한 ornithine 생성 균주를 분리, 동정하고 ornithine 전구물질인 arginine을 첨가한 막걸리의 ornithine 함량을 증가시키면 막걸리의 영양 기능성을 향상시킬 수 있다. 이와 같은 ornithine이 강화된 식품의 지속적인 연구가 이루어진다면 우리나라에서도 ornithine이 식품첨가물로 사용될 수 있을 것이라 기대된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
최근 막걸리의 건강기능성 관련한 연구로는 무엇이 있는가?
또한 다양한 유기산과 inositol, acetylcholine, riboflavin, 비타민 B 복합체 등 다양한 생리활성 물질을 포함하고 있으며, 인체 내의 신진대사에 관여하는 10여 종의 필수아미노산을 함유하고 있는 것으로 알려져 있다(2). 최근 막걸리의 건강기능성 관련한 연구로는 3T3-L1 세포주를 사용하여 분화 억제를 통한 항비만 효과, 항염증, 신생혈관생성 억제 효과(3)와 막걸리와 막걸리 지게미의 혈행 개선 효과(4) 등이 이루어지고 있다.
막걸리는 무엇인가?
한국의 전통적인 발효주인 ‘막걸리’는 탁주 또는 농주(農酒)라고도 하며 이것은 찹쌀, 멥쌀, 보리, 밀가루 등을 쪄서 누룩과 물을 섞어 발효시킨 술덧을 여과하지 않고 혼탁하게 만들어낸 곡주이다(1). 막걸리는 발효 후 여과과정을 거치지 않은 특성 탓에 발효에 관여한 효모, 유산균 등이 포함되어있는 발효산물 전체를 음용하는 세계 유일의 술로서, 다른 주류에 비하여 알코올 도수가 상대적으로 낮아 위에 부담을 주지 않을뿐더러 단백질, 식이섬유 등이 풍부하게 함유되어있다.
막걸리는 어떤 생리활성 물질들을 포함하고 있는가?
막걸리는 발효 후 여과과정을 거치지 않은 특성 탓에 발효에 관여한 효모, 유산균 등이 포함되어있는 발효산물 전체를 음용하는 세계 유일의 술로서, 다른 주류에 비하여 알코올 도수가 상대적으로 낮아 위에 부담을 주지 않을뿐더러 단백질, 식이섬유 등이 풍부하게 함유되어있다. 또한 다양한 유기산과 inositol, acetylcholine, riboflavin, 비타민 B 복합체 등 다양한 생리활성 물질을 포함하고 있으며, 인체 내의 신진대사에 관여하는 10여 종의 필수아미노산을 함유하고 있는 것으로 알려져 있다(2). 최근 막걸리의 건강기능성 관련한 연구로는 3T3-L1 세포주를 사용하여 분화 억제를 통한 항비만 효과, 항염증, 신생혈관생성 억제 효과(3)와 막걸리와 막걸리 지게미의 혈행 개선 효과(4) 등이 이루어지고 있다.
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