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문제 정의
- malacophyllus 가 농도 의존적으로 알코올성 지방간 개선에 효과가 있다는 것이 입증되었다[20]. 따라서 실제 농가에서 재배되어 시중에서 판매되고 있는 O. malacophyllus와 유산균으로 발효시킨 O. malacophyllus 의 식이 첨가가 orotic acid 유발 비알코올성 지방간 개선에 미치는 영향에 대하여 비교 검토하였다.
제안 방법
- Orotic acid 1% 수준으로 첨가하여 지방간을 유발한 흰쥐의 와송 (둥근 바위솔, Orostachys malacophyllus)과 유산균으로 발 효된 와송 분말이 미치는 영향을 확인하기 위해 와송(OM)과 발효 와송(FOM) 분말을 각각 2.5%와 5% 농도로 기본 식이에 첨가하여 10일간 투여하였다(Table 2). N군의 체중 증가에 비해 OA 투여군들의 체중 증가는 적은 경향을 보였다.
- 0%로 첨가하였다. Orotic acid을 1% 수준으로 타 영양성분 을 혼합하여 대조구로 사용하였고, 식이에 orotic acid, 와송과 발효와송은 sucrose를 대체하여 첨가하였다
- 동물 실험은 10일간 각 군별로 조제 시료를 급여하면서 사 육한 후, 실험 최종일 12시간 이상 절식시킨 후 에테르로 가볍 게 마취시켜 해부하였다. 개복 후 복부 대동맥으로부터 채혈 하여 혈액을 채취하고, 약 30분간 실온에 방치시킨 후 3, 000 rpm에서 20분간 원심분리 하여 얻은 혈청을 생화학적 분석에 제공하였다. 채혈 후 각 조직을 적출하여 0.
- 동물 실험은 10일간 각 군별로 조제 시료를 급여하면서 사 육한 후, 실험 최종일 12시간 이상 절식시킨 후 에테르로 가볍 게 마취시켜 해부하였다. 개복 후 복부 대동맥으로부터 채혈 하여 혈액을 채취하고, 약 30분간 실온에 방치시킨 후 3, 000 rpm에서 20분간 원심분리 하여 얻은 혈청을 생화학적 분석에 제공하였다.
- 실험동물은 각 군마다 6마리씩 나누고, 식이와 물은 10일간 자유급여 시켰다. 사육 기간 중 식이 섭취량은 매일 측정하였고, 체중은 4일을 주기로 일정한 시간에 측정하였다. 이 실험은 동아대학교 동물윤리위원회의 승인(IRB- DIACUC-승인-12-20)을 받았으며 위원회의 동물실험 취급 규 정에 따라 사육하고 실험하였다.
- 5FOM, 5FOM)으로 총 6군으로 나누어 실험을 진행 하였다. 실험동물은 각 군마다 6마리씩 나누고, 식이와 물은 10일간 자유급여 시켰다. 사육 기간 중 식이 섭취량은 매일 측정하였고, 체중은 4일을 주기로 일정한 시간에 측정하였다.
- 실험 동물은 4주령의 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐를 ㈜대 한바이오링크(충북, 음성)로부터 구입하여 온도 22±2℃, 습도 50±5%, 명암주기 12시간(9:00~21:00)이 자동 설정된 동물 사육 실에서 사육하였다. 일주일간 시판 고형 사료를 급여하면서 사육실 환경에 적응시켰다. 적응기간 후, 각 군에서 체중이 동일하게 난괴법(randomized complete block design)으로 분 류하여 Table 1과 같이 정상군(N), 대조군(OA), 투여군(2.
- 본 실험에 사용한 와송(둥근바위솔, Orostachys mala- cophullus) 분말은 ㈜풀그린에서 구입 하였다. 자연 건조 시킨 와송 분말과 이 건조 분말에 시판되고 있는 유산균 starter (Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus) (Yougoumet, Quebec city, Canada)를 5% 접종하여 3일간 37℃에서 고체 발효한 후, 60℃에서 열풍 건조한 발 효와송을 실험 재료로 사용하였으며, 식이에 각각 2.5%와 5.0%로 첨가하였다. Orotic acid을 1% 수준으로 타 영양성분 을 혼합하여 대조구로 사용하였고, 식이에 orotic acid, 와송과 발효와송은 sucrose를 대체하여 첨가하였다
- 일주일간 시판 고형 사료를 급여하면서 사육실 환경에 적응시켰다. 적응기간 후, 각 군에서 체중이 동일하게 난괴법(randomized complete block design)으로 분 류하여 Table 1과 같이 정상군(N), 대조군(OA), 투여군(2.5 OM, 5OM, 2.5FOM, 5FOM)으로 총 6군으로 나누어 실험을 진행 하였다. 실험동물은 각 군마다 6마리씩 나누고, 식이와 물은 10일간 자유급여 시켰다.
- 분석 방법에 준하여 측 정하였다[1]. 즉, 간 조직 1 g을 각 550℃ 회화로에서 3시간 회화 시킨 후 6 N HCl에 용해시켜 완전히 산분해시켜 수욕상 에서 산을 완전히 제거하고, 이 건고물에 3 N HCl를 가하여 Whatman No. 4 여과지로 여과하여 원소 종류에 따라 각각 일정비율로 희석하여 원자흡광 분광광도계(AAnalyst 300, Perkin Elmer, Norwalk. CT, USA)를 이용하여 측정하였다.
- 개복 후 복부 대동맥으로부터 채혈 하여 혈액을 채취하고, 약 30분간 실온에 방치시킨 후 3, 000 rpm에서 20분간 원심분리 하여 얻은 혈청을 생화학적 분석에 제공하였다. 채혈 후 각 조직을 적출하여 0.9% 생리식염수로 세척하고 여과지로 물기를 제거한 후 무게를 측정하고 분석시 료로 제공하였다.
- 혈청 중의 간장의 손상 상태를 파악하는 몇몇 효소로 알려진 ALT, AST, Alkaline phosphatase (ALP), Cholinesterase, LDH활성은 임상검사 수탁전문기관인 삼광의료재단(Seoul, Korea)에 의뢰하여 분석하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 와송(둥근바위솔, Orostachys mala- cophullus) 분말은 ㈜풀그린에서 구입 하였다. 자연 건조 시킨 와송 분말과 이 건조 분말에 시판되고 있는 유산균 starter (Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus) (Yougoumet, Quebec city, Canada)를 5% 접종하여 3일간 37℃에서 고체 발효한 후, 60℃에서 열풍 건조한 발 효와송을 실험 재료로 사용하였으며, 식이에 각각 2.
- 실험 동물은 4주령의 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐를 ㈜대 한바이오링크(충북, 음성)로부터 구입하여 온도 22±2℃, 습도 50±5%, 명암주기 12시간(9:00~21:00)이 자동 설정된 동물 사육 실에서 사육하였다. 일주일간 시판 고형 사료를 급여하면서 사육실 환경에 적응시켰다.
데이터처리
- 실험으로부터 얻어진 결과치는 one-way ANOVA 검정에 의한 평균치와 표준오차(mean± SE)로 표시하였으며, 각 실험군 간의 유의성 검증은 Duncan's multiple range test로 하였다[8].
이론/모형
- 각 조직의 미네랄 함량은 A.O.A.C. 분석 방법에 준하여 측 정하였다[1]. 즉, 간 조직 1 g을 각 550℃ 회화로에서 3시간 회화 시킨 후 6 N HCl에 용해시켜 완전히 산분해시켜 수욕상 에서 산을 완전히 제거하고, 이 건고물에 3 N HCl를 가하여 Whatman No.
- 각 조직으로부터 homogenate 분획 조제는 조직을 일정량 취해 250 mM sucrose를 함유한 homogenate 용액을 4배량 첨가하여 마쇄 균질액을 제조하였다. 분획한 homogenate 생 체막의 과산화지질 함량은 전보의 방법[19]에 준하여 정량 하였다. 즉, 각 조직 homogenate 분획 용액 1 ml에 각각 thio- barbituric acid (TBA) 시약 2 ml을 가하여 잘 혼합하고, 수조상 에서 30분간 가열한 후 실온에서 방냉하여 3, 000 rpm으로 10분 간 원심분리 한 상등액을 535 nm에서 흡광도를 측정하였다.
성능/효과
- 간장 기능적 임상지표로 사용되고 있는 혈청 ALP, Cholinesterase 및 LDH의 활성 또한 지방간 조직 모델에서 증가함으로써 간장 독성 유발과 관련성을 가진 것으로 보 고되고 있다[6]. ALP와 Cholinesterase 활성은 OA군 모두에서 증가 경향을 보였으나, 이러한 증가는 OM군과 FOM군에서 농도의존적으로 점차 감소하는 양상을 나타내었다. LDH는 체 내 혐기적 해당계의 최종 단계에서 산화, 환원 반응에 관여하는 효소로 급성간염, 초기간암, 심근경색, 악성빈혈, 백혈병 등에서 상승하는 효소로 알려져 있다[10].
- AST와 ALT의 증가는 간세포의 괴사와 간 조직의 파괴가 진행됨을 의미하므로 이들 효소의 혈중 유 리 정도를 측정하여 연구에 이용하고 있다[21]. AST와 ALT의 활성을 확인해본 결과, N군에서 낮고, OA군에서 활성이 높았 으며, OM군과 FOM군에서 OA군에 비해 유의적으로 감소한 경향을 보였다. 간장 기능적 임상지표로 사용되고 있는 혈청 ALP, Cholinesterase 및 LDH의 활성 또한 지방간 조직 모델에서 증가함으로써 간장 독성 유발과 관련성을 가진 것으로 보 고되고 있다[6].
- 간장의 무게는 정상군과 비교하여 OA 대조군 및투여군 모두에서 증가하여, Cha 등[6] 연구에서 orotic acid투 여 지방간 유발 흰쥐의 간장 무게가 orotic acid 투여군에서 증가한다는 결과와 일치하였다. OM군과 FOM군의 간장 무게는 OA군에 비해 유의적으로 감소한 결과를 보여OM와 FOM 의 식이 첨가가 지질 축적으로 인한 지방간 비대 현상을 억제 시키는 영향을 준 것으로 사료된다. 한편, 신장과 심장의 무게는 모든 군에서 유의적인 차이가 없었고, 고환과 비장의 무게는 orotic acid 투여 여부에 따라 약간의 차이를 보였다.
- 간 조직의 비헴철 농도는 OA군에서 가장 높았는데, 이는 과산화지질에 영향을 받아 산 화되어 간 조직의 비헴철의 농도가 N군보다 높아진 것으로 사료된다. OM군은 농도 의존적으로 감소하여 N군과 유사한 수치를 보였으며, FOM군에서는 농도 차이에 따른 유의적인 차이는 없었지만 N군보다 낮은 수치를 나타내었다. 따라서, FOM군은 산화를 촉매 시키는 철의 함량을 억제하여 과산화 지질에 영향을 OA군보다 적게 받아 낮은 수치를 보인 것으로 사료된다.
- Glutathionee 단백질이나 DNA 합성, 물질의 이동, thiol기의 저장 및 효소 활성 조절 등 생물학적으로 중요한 여러 반응에 관여하며, 활성산소에 대한 해독반응에도 관여한다[3, 18]. 간장에서 glutathione 함량은 N군에서 가장 높게 나타났고 OA군에서 가장 낮은 수치 를 보였으나(Fig. 3), FOM군에서는 농도 의존적으로 gluta- thione 함량이 높아져, FOM이 간장의 glutathione 함량을 높 이는데 영향을 준 것으로 사료된다. 한편 OM군은 OA군과 유사한 함량을 보여 glutathione 생성에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 사료된다.
- OM군은 농도 의존적으로 감소하여 N군과 유사한 수치를 보였으며, FOM군에서는 농도 차이에 따른 유의적인 차이는 없었지만 N군보다 낮은 수치를 나타내었다. 따라서, FOM군은 산화를 촉매 시키는 철의 함량을 억제하여 과산화 지질에 영향을 OA군보다 적게 받아 낮은 수치를 보인 것으로 사료된다.
- 2). 또한, 간 분획에서 얻은 mitochondria 의 측정 결과 역시 OA군에 비해 OM군과 FOM군 모두 감소하 였고, microsome에서는 OA군에서 N군보다 높게 나타났으며 OM군과 FOM군에서는 농도 의존적으로 약간의 감소 형태를 보이나 OA군과 유의적인 차이는 없었다. STZ로 당뇨를 유발 한 흰쥐에 와송과 생약재 복합물을 급여시킨 결과, 간장 TBARS 함량은 와송 투여 농도가 증가함에 따라 TBARS 함량 을 감소하는 것으로 나타나 와송의 과산화 지질 개선능이 보고된 바 있다[23].
- 지질과산화 반응은 여러가지 독성 화합물이나 약물 등에의한 간 손상 발생의 가장 중요한 기전[22]으로, TBARS는 지 질 과산화 생성물질 중의 하나로, 과산화지질 정도의 지표로 서 이용되고 있으며, 세포의 산화적 손상을 유발하고 각종 기 능장애를 야기함으로써 노화 또는 각종 성인병의 원인이 되고 있다[5]. 본 실험에서 TBARS를 각 장기 별로 측정한 결과, 간 장에서는 OA 군에서 N군보다 높은 수치를 나타냈으나, OM 군과 FOM군에서는 유의적으로 감소하여 N군과 가까운 수치 를 나타내었다(Fig. 2). 또한, 간 분획에서 얻은 mitochondria 의 측정 결과 역시 OA군에 비해 OM군과 FOM군 모두 감소하 였고, microsome에서는 OA군에서 N군보다 높게 나타났으며 OM군과 FOM군에서는 농도 의존적으로 약간의 감소 형태를 보이나 OA군과 유의적인 차이는 없었다.
- 혈청의 glutathione 함량 또한 N군에서 가장 높은 수치를 보였고 OA군에서 낮은 수치를 나타냈으나, 5FOM군에서 약간 증가하는 경향을 보이고 다른 시료 투여군 과는 큰 차이를 보이지 않았다. 비장과 심장의 glutathione 함량은 N군, OA군, OM군에서는 비슷한 수준을 나타내었지만, FOM군에서 glutathione 함량이 높아졌음을 확인할 수 있어 발효 와송이 간 조직뿐만 아니라 비장과 신장에서도 긍정적인 영향을 미치는 것으로 나타났다. 한편, 고환과 심장의 gluta- thione 함량은 모든 군에서 뚜렷하게 차이를 나타내지 않았다.
- STZ로 당뇨를 유발 한 흰쥐에 와송과 생약재 복합물을 급여시킨 결과, 간장 TBARS 함량은 와송 투여 농도가 증가함에 따라 TBARS 함량 을 감소하는 것으로 나타나 와송의 과산화 지질 개선능이 보고된 바 있다[23]. 신장에서 OA군과OM군 사이에는 큰 차이가 없었지만 FOM군에서는 농도의존적으로 감소하였고, 비장에 서는 앞선 간장 결과와 마찬가지로 OA군에 비해 OM군과 FOM 군 모두 감소한 것을 확인할 수 있었다. 혈청, 고환, 심장 에서는 각 군마다 유의적인 차이는 인정되지 않았다.
- 혈청, 고환, 심장 에서는 각 군마다 유의적인 차이는 인정되지 않았다. 위의 결과로 볼 때, OM와 FOMe 지질 개선에 효과를 보이며, FOM 에서 더 긍정적인 효과가 있을 것으로 사료된다.
- 한편, 고환과 심장의 gluta- thione 함량은 모든 군에서 뚜렷하게 차이를 나타내지 않았다. 이러한 결과로 OM이 조직 중에 glutathione생성에 큰 영향을 주지 못하지만, 유산균으로 발효시킴으로써 glutathione 함량 을 증가시키는 것을 알 수 있었다.
- LDH 활성에서는 N군과 OA 투여군들 대부분에서 차이를 나타내지 않았지만, 5FOM군에서는 유의적으로 감소하였다. 이로써 OM과 FOM 은 간 기능 개선에 영향을 미치는 것으로 사료되며, 특히 5FOM에서 뚜렷한 경향이 나타났다.
- 한편 OM군은 OA군과 유사한 함량을 보여 glutathione 생성에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 사료된다. 혈청의 glutathione 함량 또한 N군에서 가장 높은 수치를 보였고 OA군에서 낮은 수치를 나타냈으나, 5FOM군에서 약간 증가하는 경향을 보이고 다른 시료 투여군 과는 큰 차이를 보이지 않았다. 비장과 심장의 glutathione 함량은 N군, OA군, OM군에서는 비슷한 수준을 나타내었지만, FOM군에서 glutathione 함량이 높아졌음을 확인할 수 있어 발효 와송이 간 조직뿐만 아니라 비장과 신장에서도 긍정적인 영향을 미치는 것으로 나타났다.
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