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제안 방법
- 위하여 정밀성 및 정확성 평가를 하였다. (+)-catechin 표준용액을 5개 농도(250, 125, 62.5, 31.25, 15.625µg/mL), diosgenin 표준용액을 5개 농도(500, 250, 125, 62.5, 31.25µg/mL)의 범위에서, 각 시료 농도당 3일간 반복성 시험, 일내 3회반복 반복성시험을 하였다. 정밀성은 하나의 균질화 된 시료로부터 취한 여러 개의 등분체로 반복 분석하였을 때 분석물질에 대한 개개 측정치의 근접성으로 측정하여 정확성은 실제값과 측정값간의 일치되는 정도로 확인하였다.
- (+)-catechin과 diosgenin을 지표성분으로 설정하여 분석법을 확립하여 특이성, 직선성, 정량한계, 정확성 및 정밀성을 통하여 충분히 유의성이 있음을 확인하였으며 이상의 분석법을 이용하여 지표물질에 대한 함량분석을 시행하였다. 그 결과는 60%주정 추출의 경우에 (+)-catechin이 0.
- Diosgenin: Saponin 산가수분해를 통하여 diosgenin으로 변화시킨 후에 diosgenin의 함량을 측정하였다.22) 토복령 60% prethanol extract(4 g)에 60% MeOH, 2.5 mol/L농도 H2SO4 참가하여 90oC에서 3시간동안 환류시스템을 이용한 산가수분해를 하였다.23꺼) 산가수분해액을 식힌 후에 에테 르로 용매추출을 하여 에테르층에서 diosgenin(96.
- Diosgenin: Saponin 산가수분해를 통하여 diosgenin으로 변화시킨 후에 diosgenin의 함량을 측정하였다.22) 토복령 60% prethanol extract(4 g)에 60% MeOH, 2.
- 25µg/mL)가 되도록 용액을 만들어 실험 실시하였다. Linear regression equation(y=ax+b y: peak 면적, x: 시료농도 a: 직선의 기울기, b: y절편)을 구하였으며 R 2의 값을 통하여 직선성을 확인하였다. R 2의 값이 0.
- UPLC 조건 −표품인 (+)-catechin과 diosgenin의 분석조건을 Table I, II와 같이 설정한 다음, 이 분석조건에 따라 각각의 시료의 validation과 정량분석 실시하였다.
- 검량선, 직선성(Linearity)−직선성 평가를 위한 검량선을 얻기 위해 (+)-catechin과 diosgenin 표준용액을 MeOH 용액으로 희석하여 5개 농도의 각각 (+)-catechin 표준용액을 5개의 농도(250, 125, 62.5, 31.25, 15.625µg/mL), diosgenin 표준용액을 5개의 농도(500, 250, 125, 62.5, 31.25µg/mL)가 되도록 용액을 만들어 실험 실시하였다. Linear regression equation(y=ax+b y: peak 면적, x: 시료농도 a: 직선의 기울기, b: y절편)을 구하였으며 R 2의 값을 통하여 직선성을 확인하였다.
- 검액의 조제 −토복령 열수extract 및 60% prethanol extract 각각 1mg을 용매에 녹여서 1000ppm농도 되도록 하여 UPLC검액으로 사용하였다.
- 결과는 토복령의 60% prethanol 추출물을 산가수분해하여 ether 로 추출한 후 컬럼 chromatography를 이용하여 diosgenin을 분리하였다.
- 82분에 검출되었다. 두 지표성분의 UV 흡수 파장은 210nm로 설정하여 피크의 면적을 측정하였다.
- 본 연구에서는 토복령에 함유된 dioscin을 포함한 saponin 을 가수분해한 diosgenin과 (+)-catechin을 지표성분으로 설정하고 UPLC를 이용하여 분석법 validation과 함량평가를 수행하였다. 결
- 분석 방법의 검증(Validation)−UPLC 분석방법의 정 화성 및 재현성을 검증하기 위하여 KFDA(식품의약품안전처) 의 의약품등 시험방법 validation guide line에 따라서 특이성, 직선성, 정량한계, 정확성 및 정밀성 평가를 시행하였다.
- stock solution(500ppm)을 조제했다. 이 stock solution을 희석하여 250, 125, 62.5, 31.25, 15.625 ppm 농도의 표준용액을 조제하였다.
- 정량한계(LOQ)−분석물질의 정량이 가능한 최저 농도를 확인하기 위하여 정량한계(LOQ)를 측정하였다. 정량한계 (LOQ)는 QL=10×σ/S(σ는 반응의 표준편차를, S는 검량 선의 기울기)를 통하여 계산하였다.
- 정밀성(Accuracy) 및 정확성(Precision)−동일 시료에 대하여 실험 환경 변동에 따른 결과의 변화 정도를 확인하기 위하여 정밀성 및 정확성 평가를 하였다. (+)-catechin 표준용액을 5개 농도(250, 125, 62.
- 지표물질 분리 - 토복령의 열수와 60% prethanol extract 를 얻고 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 지표물질을 분리 하였으며 1H 300 MHz 및 13C 150 MHz 핵자기 공명 분광 기를 이용하여 (+)-catechin19,25)과 diosgenin26,27의 구조를 동 정하였다.
- 지표성분 분리 −(+)-Catechin: 토복령 60% prethanol extract(58g)를 물에 현탁시켜 여과한 후 Sephadex LH-20 column chromatography를 이용하여 H2O/MeOH(gradient)로용출시켜 세부분획으로 나누고 MCI-gel CHP20P(20% MeOH→100% MeOH, gradient) 및 MPLC(DaiSogel ODS-B: H2O/MeOH, gradient)를 통하여 (+)-catechin(120mg)을 분리하였다.
- 추출물 조제 - 토복령 분말을 1mm정도 두께로 절편을 낸 300 g에 물을 가하여 100oC로 3시간 가열하여 3회 추출한 다음 감압 농축하여 열수 exttact를 얻었으며, 같은 방법으로 준비한 재료에 60% prethanol을 가하여 90oC에서 5시 간동안 환류추출로 3회추출한 다음 감압 농축하여 60% prethanol extract(58.5 g)를 얻었다.
- 토복령의 60% prethanol으로 추출하여 각종 컬럼 chromatography에 적용하여 (+)-catechin을 분리하였다. 결과는 토복령의 60% prethanol 추출물을 산가수분해하여 ether 로 추출한 후 컬럼 chromatography를 이용하여 diosgenin을 분리하였다.
- 특이성(Specificity)−지표성분은 토복령 내의 다른 물질과 분리가 되는지 PDA검출기를 이용하여 피크의 순도를 검토하여 확인하였다.
- 함량분석(Content)−분석법 validation 검증과정을 통하여 확립한 UPLC분석법으로 토복령 내의 지표성분의 정량에 이용될 수 있는 충분한 감도, 특이성, 직선성, 정밀성, 정확성 등을 갖고 있음을 확인하고, 검증된 분석법으로 토복령의 함량을 측정하였다.
대상 데이터
- b50 mm) Column을 사용하였다. 분석 에 사용된 용매는 UPLC급 이고 Whatman® Membrane filters(0.2 pm, diam. 47 mm)를 이용하여 필터링하고 용매를 사용하였다. 지표물질을 분리에 사용된 역상 컬럼은 고정상 으로 Sephadex LH-20(10-25 pm, GE Healthcare BioScience AB, Uppsala, Sweden), MCI-gel CHP 20P(75- 150 pm, Mitsubishi Chemical, Tokyo, Japan) 및 ODS-B gel(40-60 pm, Daiso, Osaka, Japan)이었다.
- 식물재료 −본 실험에 사용된 토복령은 2014년 3월에 경북 생약 농업협동 조합에서 규격품을 구입하였다. 중앙대학교 이민 원 교수가 감별하였음.
- 확립되었다. 이동상 용매로 A: 0.1% formic acid, B: acetonitrile를 선정하여 각각 gradient elution을 적용함으로써 검체의 피크를 이상적으로 분리할 수 있었다. (+)-catechine 13.
- 시약 및 기기 - Ultra-Performance Liuid Chromatography (UPLC) 기기는 Waters Acquity UPLC® H-Class system (Waters, America를 사용하였다. 컬럼은 ACQUITY UPLC® BEH C18(1.7 μm, 2.b50 mm) Column을 사용하였다. 분석 에 사용된 용매는 UPLC급 이고 Whatman® Membrane filters(0.
데이터처리
- 정량한계 (LOQ)는 QL=10×σ/S(σ는 반응의 표준편차를, S는 검량 선의 기울기)를 통하여 계산하였다. 기울기 S는 분석대상물질의 검량선으로부터 구할 수 있다.
이론/모형
- 정량한계(LOQ)−정량한계(LOQ)공식을 이용하여 정량한계를 구하였다. (+)-catechine 2.
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